81LAPORAN PRAKTIKUM KIMIAPERCOBAAN IIIPENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE LOWRYDosen Pengampu: Dr. rer. nat. Senam Dr. Hari SutrisnoOleh:NINDI MEDIARTIKA14728251010PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIAPROGRAM PASCASARJANAUNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA2015KATA PENGANTARAssalamualaikum wr wb..Segala puji kehadirat Allah SWT. yang berkat rahmat dan seizin-Nyalah laporan praktikum Percobaan III Menentukan Kadar Protein Dengan Metode Lowry ini dapat terselesaikan pada waktunya. Terimakasih juga kami sampaikan kepada Dosen Pengampu Mata Kuliah Praktikum Kimia Lanjut Bapak Dr. rer. nat. Senam, M.Si dan Bapak Dr. Hari Sutrisno yang telah membimbing kami selama perkuliahan, Koordinator Asisten Praktikum Kimia Lanjut dan rekan-rekan kelompok I atas kekompakan dan kerjasamanya selama melakukan percobaan. Kami sadari laporan ini jauh dari kata sempurna, masih banyak terjadi kesalahan-kesalahan selama praktikum sehingga data yang diperoleh juga banyak yang tidak sesuai dengan teori yang ada. Namun, meskipun demikian dengan dilakukannya percobaan ini sedikit tidak dapat membantu kami selaku mahasiswa Program Pascasarjana Universitas Negeri Yogyakarta Program Studi Pendidikan Kimia pada khususnya untuk lebih memahami tahapan-tahapan dalam melakukan percobaan menganai penentuan kadar protein secara Biuret.Akhir kata kami sampaikan terimakasih atas perhatiannya, kritik dan saran yang membangun sangat kami harapakan.Yogyakarta, 22 Oktober 2015Nindi MediartikaDAFTAR ISIHalaman JuduliKata PengantariiDaftar IsiiiiDaftar GambarivDaftar TabelvPERCOBAAN III1Tujuan praktikum1Pelaksanaan praktikum1Dasar teori1Alat dan bahan2Cara kerja2Hasil pengamatan4Analisis data6Pembahasan7Kesimpulan9DAFTAR PUSTAKA10DAFTAR GAMBARGambar 1. Diagram Alir Pembuatan Larutan Blanko2Gambar 2. Diagram Alir Pembuatan Larutan Standar 0,2 mg/ml3Gambar 3. Diagram Alir Pengenceran Telur Bebek 2000 kali3Gambar 4. Diagram Alir Pengenceran Telur Ayam 2000 kali4Gambar 5. Grafik Absorbansi-Panjang Gelombang5Gambar 6. Grafik Absorbansi-Waktu5Gambar 7. Grafik Absorbansi-Konsentrasi6DAFTAR TABELTabel 1. Panjang Gelombang Maksimal4Tabel 2. Waktu Kestabilan5Tabel 3. Konsentrasi Larutan Blanko, Standar dan Sampel6PERCOBAAN IIIPENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE LOWRYTujuan PraktikumMenentukan kadar protein dalam larutan sampel dengan Metode Lowry.Pelaksanaan PraktikumHari: Jumat, 23 Oktober 2015Tempat: Laboratorium Pendidikan Kimia Universitas Negeri Yogyakarta.Dasar TeoriProtein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar pengatur dalam tubuh juga berfungsi sebagai zatpembangun dan pengatur. Protein merupakan sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau kerbohidrat. Molekul protein mengandung pula Posfor, Belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1990).Protein digunakan sebagai bahan bakar apabila keperluan energi dalam tubuh tidak terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ikut pula mengatur berbagai proses tubuh, baik langsung maupun tidak langsung dengan membentuk zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Sifat amfoter protein yang dapat bereaksi dengan asam dan basa dapat mengatur keseimbangan asam basa dalam tubuh (Winarno, 1990).Penentapan protein secara akurat merupakan pekerjaan yang sulit dilaksanakan. Hal tersebut disebabkan oleh beberapa faktor antara lain yaitu protein membentuk grup yang sangat beragam dan luar biasa kompleksnya baik dalam komposisi maupun dalam sifat sehingga sulit untuk memisahkan, memurnikan atau mengekstrak, sifat amfoterik dari protein, kemampuan mengabsorbsi yang tinggi, dan sensitifitas terhadap elektrolit, panas, pH, dan pelarut. Oleh karena itu, analisa protein dalam makanan pada umumnya lebh kepada kadar total protein dan bukan pada kadar protein tertentu (Anwar & Sulaeman, 1992).Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode yaitu secara kualitatf dan kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometer visible (Biuret), dan metode spektromotometri UV (Poedjiadi, 2007).Kadar protein yang terkandung dalam setiap bahan berbeda-beda. Kerena itu, pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan. Prinsip metode Lowry berdasarkan pada reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptide dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupaka residu protein) akan menghasilkan warna biru. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0,01 mg/ml. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Anwar & Sulaeman, 1992).Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metode Lowry. Bentuk yang paling sederhana reagen folin ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosen (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat yang merupakan konstituen utama reagen folin ciocalteu menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu (Hermansyah, 2012).Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi rendah dibanding metode biuret (Soeharsono, 2006).Alat dan BahanAlat:Gelas bekerGelas pengadukPipet ukurPipet mikroSpektroskopi UV-VisStopwatchTabung reaksiVortex mixerTissueBahan:Larutan BSA 1 mg/mlReagen A: Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 MReagen B: CuSO4.5H2O 0,5% dalam Natrium atau Kalium tartrat 1%Reagen C: campuran antara 50 ml reagen A dengan 1 ml reagen B. Reagen ini harus dalam keadaan segar ketika akan digunakan.Reagen E: reagen Folin-Ciocalteau diencerkan 2 kali hingga diperoleh konsentrasi akhir 1 N.Putih telur ayam negeriPutih telur bebekCara KerjaPembuatan Blanko1 ml Aquades+5 ml Reagen Lowry CDikocok dengan Vortex MixterDiamkan 15 menitTambah 0,5 ml Reagen FolinGambar 1. Diagram Alir Pembuatan Blanko2 ml BSA 1 mg/ml+Aquades hingga 10 mlDikocok dengan Vortex MixterPembuatan Larutan Standar 0,2 mg/mlDikocok dengan Vortex MixerDitambah 5 ml Reagen Lowry CDiamkan 15 menitDitambah 0,5 ml Reagen FolinDiamkan 30 menitDiukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VisGambar 2. Diagram Alir Pembuatan Larutan Standar 0,2 mg/mlPembuatan Larutan Protein dari Putih Telur Bebek dengan Pengenceran 2000 KaliO,5 ml sampel+Aquades hingga 10 mlDiambil 1 ml+aquades hingga 100 mlDikocok dengan Vortex MixerDiamkan 15 menitDitambah 5 ml Reagen Lowry CDikocok dengan Vortex MixerDitambah 0,5 ml Reagen FolinDiukur absorbansinya dngan spektrofotometer UV-VisDiamkan 10 menitGambar 3. Diagram Alir Pengenceran Telur Bebek 2000 KaliDiambil 1 ml+aquades hingga 100 mlO,5 ml sampel+Aquades hingga 10 mlDikocok dengan Vortex MixerPembuatan Larutan Protein dari Putih Telur Ayam Negeri dengan Pengenceran 2000 KaliDikocok dengan Vortex MixerDiamkan 15 menitDitambah 5 ml Reagen Lowry CDiukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VisDiamkan 10 menitDitambah 0,5 ml Reagen FolinGambar 4. Diagram Alir Pengenceran Telur Ayam Negeri 2000 KaliHasil PengamatanPenentuan Panjang Gelombang MaksimalTabel 1. Panjang Gelombang MaksimalKonsentrasi (mg/ml)Panjang Gelombang (nm)Absorbansi (A)0,2 mg/ml5000,2095100,2195200,2345300,2485400,2605500,2715600,2775700,2855800,2925900,2966000,3056100,3056200,3126300,3176400,3186500,3206600,3246700,3256800,3266900,3307000,3327100,3337200,335 (max)7300,3347400,3337500,3327600,3317700,3247800,320Berikut grafik persamaan regresi berdasarkan hasil analisis menggunakan Program Excel.Gambar 5. Grafik Konsentrasi-Panjang GelombangPenentuan Waktu Kestabilan (Operating Time) pada Panjang Gelombang 720 nmTabel 2. Waktu KestabilanKonsentrasi (mg/ml)Waktu (menit)Absorbansi (A)0,2 mg/ml50,337100,338 (waktu stabil)150,338200,338Berikut grafik berdasarkan hasil analisis menggunakan Program Excel.Gambar 6. Grafik Absorbansi-WaktuKonsentrasi Larutan Blanko, Standar dan Sampel pada Panjang Gelombang 720 nmTabel 3. Konsentrasi Larutan Blanko, Standar dan SampelLarutanKonsentrasi (mg/ml)Absorbansi (A)Blanko00Standar0,20,3350,40,4070,60,7110,80,9001,00,903Telur ayamPengenceran 100 kali- 0,470,073Pengenceran 100 kali- 0,470,073Telur bebekPengenceran 100 kali-1,330,065Pengenceran 100 kali-1,330,064Berikut grafik persamaan regresi berdasarkan hasil analisis menggunakan Program Excel.Gambar 7. Grafik Absorbansi-KonsentrasiAnalisis DataPembuatan 10 ml Larutan Standar 0,2 mg/mlM1 x V1 = M2 x V21 mg/ml x V1 = 0,2 mg/ml x 10 mLV1 = = 2 mLPembuatan Larutan Protein dari Sampel Telur AyamPengenceran 100 kaliAbsorbansi (y) = 0,073 A y = 0,9306x + 0,0774 0,073 = 0,9306x + 0,07740,9306x = 0,073 0,0774 x = = - 0,0047Kadar protein = x X faktor pengenceran = (- 0,0047) X 100 kali = - 0,47 mg/mlPembuatan Larutan Protein dari Sampel Telur BebekPengenceran 100 kaliAbsorbansi (y) = 0,065 A y = 0,9306x + 0,0774 0,065 = 0,9306x + 0,07740,9306x = 0,065 0,0774 x = = - 0,0133Kadar protein = x X faktor pengenceran = (- 0,0133) X 100 kali = - 1,33 mg/mlPembahasanPada percobaan kali ini, bertujuan untuk menentukan kadar protein dengan metode Lowry menggunakan bantuan alat Spektrofotometer UV-Vis dengan melihat kekuatan serapan atau absorbansi dari setiap sampel. Adapun sampel protein yang digunakan pada percobaan ini masih sama dengan percobaan sebelumnya yang menggunakan metode Biuret yaitu putih tekur bebek dan putih telur ayam negeri. Larutan standar yang digunakan juga sama pada metode Biuret yaitu larutan satandar BSA yang diencerkan dengan aquades, adapun konsentrasi larutan standar yang digunakan untuk membuat kurva sandar yaitu konsentrasi 1,0; 0,8; 0,6; 0,4; dan 0,2 mg/ml. Dari konsentrasi larutan ini diukur absorbansinya (dapat dilihat pada Tabel 3) dan persamaan garis dari data absorbansi dengan konsentrasinya, yaitu y = 0,9306x + 0,0774 dan harga R2 = 0,9444. Hasil ini menunjukkan bahwa nilai pembacaan absorbansi kurang akurat karena harga R2 nya belum mendekati 1,0.Pada metode Lowry ini, Cu2+ pada suasana basa akan tereduksi menjadi Cu+. Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks Phosphomolibdat-Phosphotungstat, menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu yang menghasilkan warn biru.Sebelum sampel protein dari putih telur ayam dan bebek dicampurkan dengan biuret, perlu dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimal untuk mengukur absorbansi dari sampel nantinya. Setelah panjang gelombang maksimal didapat, selanjutnya kita menentukan waktu kestabilan atau operating time dengan mengukur absorbansi larutan standar pada konsentrasi 0,2 mg/ml (konsentrasi terendah dari larutan standar yang telah dibuat) diukur pada panjang gelombang 720 nm (maks) setiap selang waktu 5 menit dari 0 sampai 20 menit. Dari hasil pengukuran, waktu kestabilannya berada pada menit ke 10 dengan harga absorbansi sebesar 0,338 A. Setelah mengetahui waktu kestabilan, sampel protein putih telur yang telah diencerkan 2000 kali ditambahkan dengan 5 ml reagen Lowry C kemudian di vortex dan didiamkan selama 15 menit setelah itu ditambahkan dengan 0,5 ml reagen Folin di vortex dan didiamkan selama 10 menit kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 720 nm didapatkan harga absobnasinya yaitu sebesar 0,073 A untuk sampel telur ayam dan 0,065 A untuk sampel telur bebek. Dari data harga absorbansi tersebut kita dapat menghitung besarnya konsentrasi protein pada masing-masing sampel, besarnya konsentrasi untuk sampel telur ayam yaitu sebesar - 0,47 mg/ml dan - 1,33 mg/ml untuk telur bebek. Dari hasil ini sedikit membingungkan karena pada kenyataannya tidak mungkin ada harga konsentrasi bernilai negatif, sehingga diperkirana dalam praktikum ini terjadi beberapa kesalahan yang menyebabkan harga dari kadar protein yang diukur menjadi tidak valid. Adapun penyebab yang memungkinkan yaitu yang pertama yaitu penentuan panjang gelombang dan waktu kestabilan menggunakan larutan standar dengan konsentrasi terendah, pengmabilan sampel putih telur yang kurang akurat karena putih telur yang sangat kental menyebabkan saat pengambilan sampel sedikit susah sehingga dapat menyebabkan ukuran sampel yang digunakan tidak sesuai dengan yang seharusnya digunakan yaitu 0,5 ml. Penggunaan alat yang kurang teliti misalnya pipet yang digunakan untuk mengambil reagen Lowry lupa dicuci sebelum digunakan untuk menggambil reagen Folin. Waktu pendiaman sampel setelah dicampurkan dengan reagen yang kurang tepat. Kemungkinan terakhir juga dapat disebabkan karena pengenceran yang dilakukan terlalu besar sehingga konsentrasi atau kadar protein pada sampel tidak terdeteksi oleh alat spektrofotometer yang digunakan.KesimpulanBerdasarkan hasil pengamatan, analisis data, dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa:Pada percobaan penentuan kadar protein dengan metode Lowry, terjadi pembentukan warna ungu yang menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks Cu2+.Dari hasil analisis didapatkan hasil untuk kadar protein yang terkandung dalam sampel putih telur ayam yaitu sebesar -0,47 mg/ml dan -1,33 mg/ml.Hasil perhitungan kadar protein yang negatif dapat disebabkan oleh beberapa hal diantaranya:Sampel yang terlalu kental sehingga menyulitkan praktikan dalam mengambil sampel tersebut.Kurangnya kebersihan dalam penggunaan alat.Waktu pendiaman sampel seteleh dicampurkan reagen yang kurang tepat.Pengenceran yang terlalu besar.DAFTAR PUSTAKAAnwar, F., & Sulaeman, A. (1992). Penetapan Zat Gizi dalam Makanan. Bogor: PAU Pangan dan Gizi IPB.Hermansyah, d. (2012). Penuntun Praktikum Biokimia. Inderalaya: MIPA UNSRI.Poedjiadi, A. (2007). Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.Soeharsono. (2006). Biokimia I. Yogyakarta: UGM Press.Winarno, F. (1990). Gizi dan Makanan Bagi Bayi dan Anak Sapihan. Jakarta: Pustaka Sinar Harapan.