KLINIČKI VAŽNI ENZIMI

HOLIN ESTERAZA

•Grupa enzima hidrolaza

•Postoje dvije forme enzima

1.Prava AChE (eritrocit,CNS)

2.Holin esteraza(serum,porijeklo jetra, bijela masa) ChE

Acetil holin + H2OHolin+Acetat

Značaj holin esteraze

1.Koristan enzim kod praćenja intoksikacije organofosfornim substancama(insekticidi, otrovne substancije)

Karaktersitičan pad aktivnosti,indikacija pada na nivou hepatalne sinteze

2.Za detekciju abnormalnih varijeteta holin esteraze koji ne mogu

Hidrolizirati sukcinil holinHipersenzitivnost na sukcini holin

3. Indikator sintetskog kapaciteta jetre

Aktivnost enzima opadne do 70% u akutnom hepatitu, cirozi,Metastatskom karcinomu

Alfa amilaza

•Kalcijum metaloenzim

•Hidroliza alfa 1,4 glikozidnih veza

Produkti : Maltoza, maltoteroza,dekstrini

Distribucija: pljuvačne žlijezde, acinarne ćelije pankreasa(većinski),no prisutna i u intestinalnom epiteliju, falconijevim tubama,endometriju, dojci za vrijeme laktacije

Filtracija: Glomerule bubrega

Izoenzimi: Pankreasni(P)-porijeklo pankreas

Salivarni(S)-porijeklo (plj. Žlijezde, pluća,kost,ovarije, tiroideja)

•Distribucija u normalnom serumu40% aktivnosti=P tip60% aktivnosti je S tip

•Oba izoenzima tri podfrakcije S1,2,3 P1,2,3

•Serum dominacija: S2 i P2

•Akutni pankreatit: rast P3

•Hiperamilazemija(pankreasna etiologija): pankreatit, pseudocista,ascites, efuzije,karcinom pankreasa.

•Nepankreasna etiologija:tumori pluća,tumori ovarija(raste do 200 puta) Holecistitisi 4 puta Peritonitisi, akutni apendicitisi(blagi rast), cerebralne traume, traumatski šokovi ,dijabetična ketoacidoza

Određivanje amilaze

• Hidroliza (14) i (1 6) veza se javlja, ali pri različitim brzinama.

• To znači da aktivnost amilaze ovisi o odabranom substratu.

• Postoji više pristupa određivanju amilaze nego bilo kojeg drugog anilata.

O

OH

OH

CH2OH

O

OH

OH

CH2OH

O

-Amylose

-Amylase

Ca++Glucose, Maltose

(14)

Amiloklastična metoda

• Brzina nestanka plavog kompleksa proporcionalna je aktivnosti amilaze.

• Škrob se može mjeriti i turbidimetrijski.• Metode sa škrobom nisu često u upotrebi.

Skrob + I2 Plavi kompleksAmilaza

Crveni kompleks

Saharogene metode

• Nekoliko metoda se može koristiti u kvantifikaciji.• Somogyi opisao saharogeničnu amilazu te definirao

jedinice aktivnosti kao redukujuće ekvivalente glukoze”

• Glukoza i maltoza se alternativno mogu mjeriti konvencionalnim enzimskim metodama.

ŠkrobAmilaza

Glukoza + Maltoza Reducirani substrat

1. Kaufman-tietz

Amilaza

Maltoza+maltotrioza---alfa glukozidaza----------------glukozaGlukoza+1/2 O2--------------- glukozo oksidaza---------------------------------->H2O2+ delta-glukonolakton

Dodavanje peroksidaze:

H2O2+ABTS-------------------->H2O +ABTS(oksidovani-obojen)

Škrob---------------amilaza---------maltotrioza+maltoza+dekstrini

2.Du Pont Aca

Maltopentoza--------- alfa amilaza---------- maltotrioza + maltoza

Maltotrioza +maltoza------alfa glikozidaza------- 5 glukoza

Glukoza+ATP---------heksokinaza------------ G6P+ADP

G6P+NAD+---------G6PDH----------- 6-fosfo glukonolakton + NADH+ H+

3.Beckman DS

Maltotetroza-----alfa amilaza--------- 2 maltozeMaltoza+Pi-------maltozo fosforilaza------- glukoza+ beta glukozo 1PBeta glukozo 1P------beta fosfoglukomutaza-------- glukozo 6PG6P+ NAD+---------G6PDH----------- 6-fosfo glukonolakton + NADH+ H+

glukozo 6 fosfat dehidrogenaza

Amilaza(hromogeni)

• J&J Vitros aplikacija dozvoljava da ovi bojom obojeni fragmenti difunduju kroz sloj filtra

• Abbott FP metoda koristi škrob obojen fluoresceinom

Bojom obojeni škrobAmilaza

Mali obojeni fragmenti

Fotometrijsko određivanje bojeFaza separacije

Definirani substrat-amilaza

-Glukozidaza ne reagira sa ologosaharidima koji sadrže više od četiri ostatka glukoze.

• Modifikacija ovog pristupa koristi -2-hloro-4-NP, koji ima veću molarnu apsorpciju od 4-NP.

4-NP-(Glukoza)7Amilaze

4-NP-(Glukoza)4,3,2

-Glukozidaza

4-NP-(Glukoza)4 + Glukoza + NPmax= 405 nm

IZOENZIMI

Postranslacijske i vještačke modifikacije

Podtipovi ili izoforme enzima mogu nastati iz posttranslacijskih modifikacijaoriginalne strukture enzima putem dodavanja hemijskih substituenata iliputem parcijalne degradacije.

Ove promjene dešavaju se intracelularno, poput dodatka karbohidratnih bočnihlanaca ili nakon oslobađanja proteina iz ćelija u plazmu.

Izoenzim termin se često koristi –može biti genski produkt i posttranslacijkaModifikacija

No,u pravom smislu te riječi posttranslacijska modifikacija je izoforma.

TKIVNA DISTRIBUCJJA OSNOVNIH IZOENZIMA

Osnovni klinički važni enzimi : CK,LDH,ALP i ACP

ACP=kisela fosfatazaALP= alkalna fosfatazaCK=kreatin kinazaLDH=laktat dehidrogenaza

CKMM=dominantan CK izoenzim u skeletnim mišićima odraslih osobaCKMB*=3% ukupne aktivnosti CK u skeletnom mišićuCKMB=kod nekih stanja mišićne etiologije može dosećin i do 10%

Mišić miokarda: 14-42% CK MBOstatak: distribucija CKMM

Mozak: ekspresija CK BB

Svi ovi su citoplazmatski izoenzimi,ali postoji i mitohondrijalni CK izoenzim

METODE ANALIZE IZOENZIMATehnika Princip izoenzim, izoforma

Elektroforeza Nabojn podjedinica različit Sve

Jonoizmjenjivačka hromat. Podjedinice sa različitim naboj CK;LDH

Imunoinhibicija At reagira specifično sa jednim CK,LD,ACP

Imunoesej At reagira specifično sa jednim CK,LDH,ACP;ALP, AMY

Toplotna stabilnost Katalitička neaktivnsot na raznim ALP temperaturama

Katalitička inhibicija Individualne podjedinice vezuju ACP(tartarat),ALP razne inhibitore ALP(ureja i L-fala) ChE(dibukain)

Substratna specifičnost Svaki izoenzim veže razne substrate CK,ACP(alfa naftil fosfat

LIPAZA

•Enzim bez aktivnosti u urinu

•Organospecifičan za pankreas

•Prisutan: crijevni mukus, stomak, leukociti

Određivanje lipaze (direktno)

• Cherry/Crandall procedura uključuje dgradaciju maslinovog ulja i mjerenje oslobođenih masnih kiselina titracijom.

• Pad zamućenja emulzije Tg se prati.-turbidimetrija• Za punu aktivnost i specifičnost, treba dodavanje koenzima kolipaze.• Spektrofotometrijsko određivanje• imunoesej

H2C OFA

HC

H2C

OFA

OFA

H2C OH

HC

H2C

OFA

OFAFA FA

H2C OH

HC

H2C

OH

OFAFA

H2C OH

HC

H2C

OH

OH

Lipase Lipase Lipase

Triglyceride ,-Diglyceride -Monoglyceride Glycerol

Određivanje lipaze (indirektno)

• Indirektne metode se fokusiraju:– Enzimatska fosforilacija (Glicerol kinaza) i

oksidacija (L--Glicerofosfat oksidaza) glicerola, i mjerenje oslobođenog H2O2

– Bojom obojeni diglicerid koji oslobađa hromofor nakon hidrolize lipazom.

• Nekoliko netriglicerid substrata predloženo.

1. 1oleil-2,3 diacetilglicerol+H2O-----pank.lipaza------>2,3 diacetil glicerol+oleinska kis.

2. 2,3 diacetil glicerol+H2O------diacetilaza------>glicerol+acetat3. Glicerol+ATP---------glicerol kinaza-------->L-alfa glicerolfosfat+ADP

4. L-alfaglicerol fosfat+o2--------oksidaza------>DHAP+H2O2

5. H2O2+leuko boja--------peroksidaza-------->bojena reakcija+2 H20

Drugi tip reakcije

1. 1,2 diacil glicerol-------pankr.lipaza-------->2 monoacil glicerol+ MK2. Monoacil glicerol+H2O-------lipaza------->glicerol+MK3. Glicerol+ATP-----glicerol kinaza-------->L-alfa glicerofosfat+ADP4. L-alfaglicerol fosfat+o2--------oksidaza------>DHAP+H2O25. H2O2+leuko boja--------peroksidaza-------->bojena reakcija+2 H20

Laktat dehidrogenaza

•Citoplazmatski enzim sa 4 polipeptidna lanca

•Izoenzimi: LDH1,2,3,4,5(H4,H3M,H2M2,HM3, M4)

Razlike u biološkim , hemijskim, fizikalnim osobinama

a)Anodni izoenzimi LD 1 i LD2 (srce, eritrocit)

b)Katodni izoenzimi ( LD5,LD4)-jetra,skeletni mišić

c)Bez tkivne specifičnosti( LD2 i LD3)-pluća,gušterača

U serumu dominantne LD1,LD2,LD3

Ukupna aktivnost enzima LDH raste kod :.

a)hepatitis (virusni hepatit-pet puta veća aktivnost ) toksični hepatit do deset putab)infektivna mononukleozac)kancer pankreasa,prostated)limfomie)anemijef)mišićna distrofija

g)akutni infarkt miokarda-raste 8-12 sati, max nakon 48 sati, ukupno Raste 6-7 dana do 10 dana, Infarkt 80% ljudi LD 1veće od LD2

h)ciroza jetre (2 puta veća aktivnost od referentnih vr)i)nekrozaj)pankreatit

Određivanje laktat dehidrogenaze

• Oba tipa metoda dostupne PL i LP metode dostupne– Na fiziološkom pH, PL reakcija favorizirana– LP reakcija traži pH 8.8-9.8

• LD li LDH aktivnost varira u ovisnosti od korištene metode.

H3CO-

O

O NADH NAD+

H3CO-

OH

OPyruvate Lactate

Lactatedehydrogenase

ANALITIKA LDH(ukupna aktivnost)

1)Laktat Piruvat Metoda krajnje tačke, kinetička refer. alk.ph

2)Piruvat Laktat Isto kao pod jedan

3) Kompleksiranje sa DNPH Stvaranje produkata sa piruvatom(obojeni)

4)Određivanje fluorscirajućeg NADH Metoda krajnje tačke

Laktat piruvat +NADH fluorescirajući

5. Metoda sa tetrazolijem

oslobođeni NADH+tetrazolijum-------građenje obojenog kompleksa

Osobine izoenzima

Elektroforetska separacija LD1 LD5 alfa globulin gama globulin

2 oksoglutarat kao substrat visoka aktivnost niska aktivnost

Zagrijavanje 30 minuta,60*C neefektiran razoren

Ureja(2 mmol/L) Mala inhibicija totalna inhibicija

Oksalat(0,2 mmol/L) Značajna inhibicija mala inhibicija

Analitika LDH-izoenzimi

1.ElektroforezapH=8,6., različita pokretljivost izoenzima u 1 % agaroziAktivnost izoenzima preko vezivanja za boju-tetrazolijum

2.Jonoizmjenjivačka hromatografijapH=8,0,LD1 i LD2 apsorpcija na smoli(DEAE)Elucija: prva frakcija-LD5 elucija sa najvećom koncentracijom soli-LD1

Kvantifikacija kao za ukupnu aktivnost

3.ImunoinhibicijaUklanjanje M subjedinica precipitinskom reakcijom(dvostruko antitijelo na čvrstoj fazi), dobije se samo LD1

ASAT/ALAT-Transferaze, transaminaze

•ASAT- dominantan enzim u citoplazmi jetre mišić miokarda,skeletni mišić,bubregMitohondrijalni oblik -također u jetri

•ALAT-velika koncentracija citoplazma jetreMitohondrijalni oblik postoji samo u tkivima, ne u serumu

Omjer ASAT/ALAT- plazma, žuč, CSL, pljuvačka

Nikad urin izuzev ako nema lezije bubrega !!!!

•Oba enzima korisna u dijagnozi akutnih i hroničnih obolenja

Uzroci rasta AST/ALT

• ?Porijeklo jetra ili neko drugo– Mjeriti CK, cTnI, amilaze itd.

• Ako je porijeklo iz jetre, onda rast AST indicira oštećenje hepatocita:– Hepatitis – virusni, autoimuni, izazvan alkoholom,

lijekovima

• Ako nije jetreno, onda se vjerovatno radi o potencijalnom oštećenju mišića:– Miozitis, hipotiroidizam, zloupotreba droga, MI

Rast AST/ALT porijeklo iz jetre• Rast transaminaza praćen manjim rastom na razini

drugih testova je indikacija hepatitisa:– Infektivni – Hep A/B/C, CMV, EBV & drugi

• ALT bolji od AST u monitoringu hroničnog Hep B/C– Autoimuni – AIH potvrđen uz korištenje LKM

autoantitija, toksini• Alkoholni hepatitis nije čest, ali se može javiti kod ‘binge’

pijanaca (vrlo često žene)• Lijekovi – paracetamol & drugi (često idiosinkratski)• Metali – bakar (Wilsonovo obolenje), željezo

(hemohromatoza)• otrovi – gljive i slično.

– Post-transplantacijska rejekcija

ASAT(10-100 puta rast) infarkt, virusni hepatit, nekroza jetre,cirkulatorni problemi,hipoksija,šok

Slab rast-ciroza jetre,mišićna distrofija,nakon traume ili hirurškog zahvata,ozbiljne hemolitičke anemije,infektivne mononukleoze

Značajan rast 12-48 sati nakon infarkta, maksimum 24-36 sati, bazna linija 4-5 dana

Bez promjena aktivnosti-angina pectoris, aneurizme, perikarditis

Ciroza-progresivan rast ASAT-a, veći ASAT/ALAT

AST/ALT - ciroza veći od 2,0

Hepatitis - manji od 1,0

Infektivni hepatitis-oba enzima jako rastu

Rani hepatitis-ALT veći od ASAT

Hronični hepatitis - ASAT veći od ALAT

Uzorkovanje:

Plazma(heparin,oksalat, EDTA,citrat)Visok AST-eritrociti, hemoliza,lipemija

Stabilnost enzima:

1-3 dana na 0-4 stupnja.

ANALITIKA AST

L-asparaginska kiselina+ alfa oksoglutaratOksalacetat+ L-glutamat

OA Dalja analitika

1. OA+ 2,4 DNPH oksalodinitrofenilhidrazin (505 nm)Analitički problem:vit B6(pacijenti sa nedostatkom vitamina)

MDH2.OA+NADH+H+ malat+NAD

3.OA+Ar-N-N (diazonij boja) OA-diazonij boja

Analitika ALT

L alanin+alfaketoglutarna kisleinapiruvat+ L-glutamat

Dalja analitika:

1.Piruvat+2,4 DNPH piruvat dinitrofenil hidrazon(505 nm) LDH2. Piruvat+NADH+H+ laktat+ NAD+

3.ista reakcija –fluorimetrija NAD+(pad fluorescencije)

Gama-glutamil transpeptidaza

• Producira se na razini hepatocita i biliarnih epitelnih ćelija

• Mikrozomalni enzim odgovoran je za transfer glutamil grupa sa gama-glutamil peptida na druge peptide ili amino kiseline

• Također prisutan i u drugim organima:– Srce, bubreg, pluća, pankreas,seminalne

vezikule– Plazma GGT predominantlno izoenzim jetreni

• Raste kod uzimanja droga

GGT transferaza

•Enzim prisutan u ćelijama biliarnog trakta i jetrenih kanala Serumska aktivnost uglavnom jetrena

•Značaj: diferencijalna dijagnoza hepatobiliarnih poremećaja (85-93% osjetljivost)

•5 puta veća aktivnost kod obolenja biliarnog trakta•2-5 puta (jetrena obolenja)-virusni hepatitis, ciroza, Indukcija alkohol, droge Fenobarbitol, antidepresivi,fenitoin, kontraceptivi

Gama glutamil paranitroanilid+glicilglicingama glutamil glicilglicin + para-nitroanilin

Rast plazma GGT - 1• Lijekovi

– Indukcija - alkohol, anti-konvulzivi etc.– ?mehanizam

• antibiotici e.g. sintetski pencilini, isoniazid, ketoconazole, fluconazole

• Inhibitori HmG CoA reduktaze – statini• NSAIDs• Sulfonilureje• DOA• Biljne droge i homeopatski lijekovi• Metotreksat

Rast plazma GGT - 2

• Steatoza– Alkohol vezana steatoza, debljina, D.M., NASH (ne-

alkoholni steatohepatitis)• Fibroza/ciroza

– Alkoholna ciroza, PBC, PSC, hemokromatoza, alfa-1-antitripsin nedostatak, Wilson obolenje etc.

• Lezije koje okupiraju određene prostore– Malignitet (HCC ili sekundarni)– Granulomatozno obolenje., primjer sarkoidoza, TB

Određivanje gama glutamil transferaze

• Metod opisan Szasz 1969, modifikacija Rosalki and Tarlow

C

CH2

CH2

HC

COOH

NH2

HNO

NO2

COOH

CH2

NH

C

CH2

O

NH2

NO2

NH2 COOH

CH2

NH

C

CH2

O

HNCO

CH2

CH2

HC

COOH

NH2

-glutamyl-p-nitroanalide Glycylglycine p-Nitroanalinemax= 405 nm

-Glutamylglycylglycine

+ +

-Glutamyltransferase

pH 8.2

5’ nukleotidaza

A5’P+ H2Oadenozin + fosfat

•Aktivnost paralelna sa ALP i GGT-hepatobiliarni poremećaji

•Diferencira između koštanog i jetrenog rasta ALP

Analitika:

Adenozin dezaminazaAdenozin+H2O inozin+NH3

Leucin amino peptidaza (jetra,bubreg,crijevo)

Tip reakcije : L-leucinamid+H2Oleucin + NH3

•Detekcija hepatobiliarnih poremećaja

ANALITIKA

Leucin para nitro anilid p-nitroanilin (405 nm)

Aktivnost CK pod utjecajem:

Starosne dobi,Spola,rase,Tjelesne maseFizikalne aktivnostiGenetskih razlika

Djeca veće vrijednosti od odraslihMuškarci veće vrijednosti od ženaCrnci veće vrijednosti od necrnaca

Aktivnost raste: nakon vježbanja,im injekcija,hirurških zahvata,

ODREĐIVANJE CK

1.KP +ADP------kreatin+ATP

ATP+glukoza-----G6P+ADP

G6P+NADP+-------6-P-glukonat+NADPH+H+

Interferencije:1.Redukovani glutation kombiniran sa oksidovanim glutationomAktiviranje reakcije katalizirane u prisustvu glutation reduktaze GRGSSG+NADPH+H+--------GSH+NADP+

Redukcija CK aktivnostiKorištenje N-acetilcisteina spriječava pojavu ovog efekta.

2.AK efekat u serumu

2ADP------ATP+AMPRast aktivnosti CK nakon aktiviranja ove reakcije.

2.Drugi tip reakcije: CK-kreatin kinaza

K+ATP-------KP+ADP PK-piruvat kinaza

ADP+PEP(fosfoenol piruvat)--------ATP+piruvat LDH

Piruvat+NADH+H+--------laktat+NAD+

Ovako se dobije 1/6 aktivnosti enzima pa se zato manje koristi. --------

3.Bioluminiscentne metode

Osobina veća osjetljivost od spektrofotometrijskih metoda

KP+ADP-------K+ATP CK

ATP+luciferin+O2--------- AMP+oksiluciferin+PPi+CO2+ luciferaza

ACP ekspresija(lociran u lizozomima)Eritrociti,leukociti, trombociti te prostata

izuzetno visoke koncentraciej ACP-a)

Najčešće mjerena je prostatična ACP

PAP povećan kod uznapredovalog kancera prostate, ali nije dobar pokazatelj

u ranoj fazi detekcije

Lažno pozitivan test kod hipertrofije prostate benigne prirode

Kod drugih vrsta maligniteta(leukemija,)Uloga preuzeta sa PSA antigenom

Druga mogućnost: dijagnostika Gaushera te leukemija

Slučajevi silovanja-legalna evidenija kod silovanja

ANALITIKA ACP(kisele fosfataze)1.Monofenil fosfat+ Folin Ciocalteau Serum Metoda krajnje tačke

2.Timolftalein iz timolftalein fosfata Sve tekućine

3.Alfa naftol fosfat- alfa naftol Kinetička spektrofotometrijska

4.Fluorimetrijska-pojava 4 metilumbeliferona koji se oslobađa iz istoimenog fosfata

5.RIA-antitijelo usmjereno prema PAP obloženom čvrstom matriksu,specifična PAP

6.EIA –monoklonalno antitijelo vezano za solidni suport vezuje PAP.Drugo At konjugirano za ALP ili peroksidazu vezuje se za vezani PAP.

Količina vezane enzimske aktivnosti proporcionalna koncentraciji PAP

Specifična za PAP

1.

2.

3.

4.

5.6.

Analitika CHE

1.Klasični test:

Butiril holin Tioholin +buterna kiselina

Tioholin+ 5,5 ditiobis-2-nitro-benzoat 5tionitrobenzoat

2.Određivanje inhibicije dibukainom

Atipična varijanta enzima pokazuje veću rezistenciju inhibicije DibukainomTest kao gore u prisustvu i bez dibukainaInhibicija izražena preko dibukain broja.

Normalni oblici enzimaa DB ispod 30%Homozigoti sa atipičnom varijantom DN veći od 70%.Heterozigoti: (30-70%)