enzimi jetre

1

Enzimi jetre

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina

2

Enzimi jetre • Transaminaze

– Alanin aminotransferaza ALT

– Aspartat aminotransferaza AST

• Laktat dehidrogenaza LD

• Alkalna fosfataza

• Holinesteraza

• gama GT

• Glutamat dehidrogenaza

• Glutation-S-transferaza

• 5’-nukleotidaza

• Pojam hepatogram

3

Testovi za ispitivanje endogenih supstanci koje se oslobađaju iz oštećenog tkiva

Hepatociti AST ALT GLD

Kanikularne membrane Epitela žučne kese Endotela centralne i Peritonealne vene Alkalna fosfataza

γ-GT 5’-nukleotidaza

Enzimska dijagnostika Povećanje aktivnosti jetrenih enzima

4

Jetreni enzimi

• Transaminaze – Alanin aminotransferaza ALT – Aspartat aminotransferaza AST

• Laktat dehidrogenaza LD • Alkalna fosfataza • Holinesteraza • γ-GT • Glutamat dehidrogenaza • Glutation-S-transferaza • 5’-Nukleotidaza

5

γ-Glutamil transferaza

• Peptidaze • Katalizuju hidrolitičko razlaganje peptida

• Transfer amino grupe sa jednog peptida na aminokiselinu ili drugi peptid

• (EC 2.3.2.2; gama-glutamil-peptid: aminokiselina γ-glutamil transferaza, γ-GT, GGT)

• Katalizuje transfer γ–glutamil grupe sa peptida na akceptor

• Deluje na peptide sa terminalnom (-γ-) karboksilnom grupom

• Glicilglicin je pet puta efektivniji akceptor nego što je glicin ili tripeptid (gly-gly-gly)

• Peptidazna transferna reakcija je brža nego prosta hidroliza.

6

Primer reakcije koju katalizuje γ-glutamiltransferaza

7

Distribucija i izoforme γ-glutamil transferaza

Distribucija GGT u organizmu:

• Proksimalnim tubulima, jetri, pankreasu i intestinumu

Ćelijska distribucija GGT:

• Enzim se nalazi u citoplazmi (mikrozomima) i

• Veća frakcija locirana na ćelijskoj membrani

Uloga

• Transport aminokiselina i peptida u ćeliju kroz ćeljsku membranu u

formi γ-glutamil peptida.

• GGT u serumu primarno potiče iz jetre

8

Distribucija i izoforme γ-glutamil transferaza

Izoforme GGT • Enzim u serumu je heterogen i u odnosu na naelektrisanje (dokazano

elektroforetski) i u pogledu veličine.

• Ove izoforme su rezultat posttranslacionih modifikacija jednog enzima

• Visoko molekularne forme enzima su u stvari fragmenti membrana koji se oslobađaju u cirkulaciju.

• Ne postoji povezanost zmeđu pojedinih molekularnih formi enzima i pojedinih bolesti.

9

Mitohondrije

Lizozomi

Golđijev kompleks

Glatki endoplazmatični retikulum

Zrnasti endoplazmatični retikulum

Lokalizacija enzima u hepatocitima

AST, GLD

ALT, LAP,AST, LD

ALP, GGT, 5-NTP

Citoplazma

10

GGT je kritičan za održavanje adekvatne količine intracelularnog redukovanog glutationa, glavnog antioksidansa

Sinteza i regeneracija glutationa kao dela γ -glutamilskog ciklusa

5-oksiprolinaze

γ -Glutamil ciklotransferaze

γ -Glutamil transpeptidaze

γ -Glutamil sintetaze

GSH-sintetaza Proteaza

11

Klinički značaj GGT

• GGT najveća koncentracija u bubregu, a u serumu je hepatobilijarnog porekla

• GGT je senzitivni indikator prisustva hepatobilijarnog oboljenja – povećan je kod većine osoba sa bolestima jetre bez obzira na uzrok

– mala specifičnost

• Najveći porast je kod intrahepatične i posthepatične bilijarne opstrukcije – Dostiže vrednosti od 5 do 30 puta od URL.

• Velika povišenja GGT – kod pacijenata sa primarnim i sekundarnim (metastaze) neoplazmama jetre.

• Srednje povišenje – kod infektivnog hepatitisa (od 2 do 5 puta)

• Malo povećanje GGT – kod masne jetre kao i prolazno povećanje kod intoksikacije lekovima.

• U akutnom i hroničnom pankreatitisu i kod nekih pankreasnih maligniteta (posebno ako je povezana sa hepatobilijarnom opstrukcijom) enzimske aktivnosti su povećane 5 do 15 puta iznad URL.

12


• Povišene vrednosti GGT – kod alkoholnog hepatitisa i kod teških alkoholičara – Kod uzimanja antikonvulziva: fenitoin i fenobarbiton

• Mehanizam dejstva – Alkohol i lekovi indukuju povišene vrednosti GGT – Toksično dejstvo na mikrozomalne strukture hepatocita

• Akutni infarkt miokarda – GGT je obično normalan – Povišenje GGT četiri dana posle infarkta i maksimum dostiže posle dodatnih 4

dana – Odražava sekundarno oštećenje jetre zbog kardijačne insuficijencije

Faktor rizika za KVB – Novija istraživanja ukazuju da je GGT nezavisni prediktor kardiovaskularnog

mortaliteta i morbiditeta

– Eksperimentalna istraživanja su pokazala prisustvo GGT u aterosklerotskom plaku i ima ulogu u prooksidatnom/antioksidatnom balansu

13


Zaključak: • Određivanje GGT ima najveći značaj kod: • Hepatobilijarnih oboljenja • Indukcija sinteze ovog enzima kod:

– Alkoholičara – Određenih lekova

14

Metode određivanja aktivnosti GGT

• Ranije metode su koristile L-γ-glutamil-p-nitroanilid (GGPNA) kao

supstrat i sa glicilglicinom kao akceptorom γ-glutamil ostatka

• GGPNA ima ograničenu rastvorljivost u reakcionoj smesi i teško je

postići koncentracije supstrata kojima se enzim zasiti

• Stvoreni p-nitroanilin u ovoj reakciji je žuto obojen i prati se na 405 nm.

• Koriste se i derivati GGPNA sa bočnim grupama na benzenskom

prstenu

• Povečana rastvorljivost u vodi

• Primer: L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid

15

Određivanje aktivnosti γ-glutamiltransferaza

IFCC referentna metoda Supstrat L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid Akceptor glicilglicin Pufer glicilglicin Temperatura 37oC Meri se 5-amino-2-nitrobenzoat na 410 nm

16

Stabilnost enzima • GGT je stabilan enzim in vitro • Aktivnost je stabilna najmanje 1 mesec na 4oC i 1 godina na -20oC. Biološki materijal • Koristi se nehemolizovan serum • EDTA plazma • Heparin dovodi do zamućenja • Citrat, fluorid i oksalat snižavaju aktivnost GGT za 10 do 15 %

Referentne vrednosti • Gornja granica je 40 U/L za žene i 70 U/L za muškarce mereno

sledljivom metodom po IFCC • Crnci imaju dva puta veće vrednosti • Kod rođenja vrednosti su 6-7 puta veće od RV odraslih • Vrednosti posle toga opadaju i posle šest meseci dostižu vrednosti

odraslih osoba

17

5’-nukleotidaza

• EC 3.1.3.5. • 5’-ribonukleotid fosfohidrolaza • Skraćenica NTP

• NTP je glikoprotein koji je široko rasprostranjen u mnogim

tkivima • Lociran je u citoplazmatičnoj membrani ćelije • pH optimum je između 6,6 i 7,0.

18

Mitohondrije

Lizozomi

Golđijev kompleks



Lokalizacija enzima u hepatocitima

AST, GLD

ALT, LAP,AST, LD, GST

ALP, GGT, 5’-NTP

Citoplazma

19

Reakcija koju katalizuje 5’-nukleotidaza 5’-nukleotidaza je fosfataza koja deluje na nukleozid-5’-fosfat,

kao što je adenozin-5-fosfat (AMP) i adenilnu kiselinu, uz oslobađanje neorganskog fosfata

20

Klinički značaj određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze

• NTP je široko rasprostranjen enzim

• Aktivnost NTP reflektuje hepatobilijarne bolesti sa zadovoljavajućom specifičnošću.

• NTP se povećava 3-6 puta u hepatocelularnim bolestima gde ima problema sa sekrecijom žuči – Ekstrahepatična opstrukcija (kamen ili tumor koja blokira žučne puteve)

– Intrahepatična opstrukcija kao što je holestaza izazvana hloropromazinom, malignim infiltracijama jetre ili bilijarnom cirozom.

• Infektivni hepatitis sa dominantnim parenhimskim oštećenjem ćelije, dovodi do slabog povećanja aktivnosti serumske NTP

21

Klinički značaj određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze

• NTP ima poseban značaj u slučaju povećane aktivnosti nespecifične ukupne ALP jer povećanje NTP u tim slučajevima je dokaz da povećana ALP potiče iz jetre.

• Polovina osoba kod kojih je ALP povećana mogu istovremeno da pokažu normalne vrednosti NTP.

• Postoje i slučajevi gde je jetrena ALP normalna, a NTP povećana i obično se radi o prisutnom oboljenju jetre.

• Ovako različite vrednosti ova dva enzima ukazuje na potrebu da se istovremeno određuje aktivnost jetrene ALP i NTP kako bi se poboljšala dijagnostička efikasnost.

22

Metode određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze

• Supstrati: • adenozin-5’-monofosfat (AMP) i inozin-5’monofosfat (IMP).

• Supstrati su organski fosfatni estri i oni mogu biti hidrolizovani i drugim

enzimima, prevashodno nespecifičnom alkalnom fosfatazom, čak i pri pH nižem od 7,5 koji je inače optimalan pH za NTP

• Metode određivanja NTP moraju da se koriguju hidrolizu nespecifičnim fosfatazama

23


Inozin-5’-monofosfat NTP

Inozin Purin nukleozid fosfohidrolaze EC 2.4.2.1

Hipoksantin Ksantin oksidaza EC 1.2.3.2

Mokraćna kiselina + 2H2O2

H2O2 + hromogen → H20 + Obojeni hromogen 510 nm

24


Uklanjanje interferencije drugih fosfataza • Efekat ALP na IMP je inhibiran sa β-glicerofosfatom • β-glicerofosfatom je supstrat za ALP ali ne i za NTP • Smanjuje aktivnosti ALP i njeno hidrolitičko dejstvo na supstrat

za NTP, inozin monofosfat

Stabilnost enzima • NTP u serumu ili plazmi je stabilna najmanje 4 dana na 40C i 4

meseci na -200 C.

Referentne vrednosti • Referentni interval za NTP na 37o C od 3-9 U/L • Nema razlika prema polu

25

Glutamat dehidrogenaza

• Enzimski broj: EC 1.4.1.3. • L-glutamat: NAD(P)+ oksidoreduktaza, deaminacija • Skraćenica GLD • Mitohondrijalni enzim • Distribucija u tkivima

– pre svega nalazi u jetri, ali i u srčanom mišiću, bubrezima, – male količine u drugim tkivima: mozak. skeletni mišići i leukociti.

• GLD sadrži cink u svojoj strukturi • Sastoji se od šest polipeptidnih lanaca. • Najmanji aktivni molekul ima Mm oko 350 000, a ima i većih

polimera.

26

Mitohondrije

Lizozomi Golđijev

kompleks



Ćelijska lokalizacija enzima u hepatocitima

GLD

GST

27

Reakcija glutamat dehidrogenaze

Enzim katalizuje uklanjanje hidrogena iz glutamata na odgovarajuću ketoimino kiselinu, Spontana hidroliza do 2-oksoglutarata. Koenzimi: •NAD preferirajući •može i NADP Inhibicija enzima •jonima metala Ag i Hg •helatizirajući agensi •L-tiroksin

28

Klinički značaj glutamat dehidrogenaze

• GLD je povišena u serumu kod pacijenata sa hepatocelularnim oštećenom.

• U hroničnom hepatitisu povećanje je 4-5 puta.

• U cirozi jetre do 2 puta

• Vrlo visoke vrednosti su kod trovanja halotanom, a i kao odgovor kod nekih

hepatotoksičnih agenasa.

• GLD ima potencijal u diferencijalnoj dijagnostici oboljenja jetre, posebno

kada se interpretiraju zajedno sa drugim enzimskim testovima.

29

Klinički značaj glutamat dehidrogenaze

• Ključna stvar u ovoj diferencijalnoj dijagnostici je distribucija enzima u ćeliji i

unutar organa (jetre).

• GLD je mitohondrijalni enzim i oslobađa se iz nekrotičnih ćelija

• U poređenju sa drugim bolestima jetre sa intenzivnom nekrozom,

oslobađanje je manje nego u difuznim inflamatornim procesima i u ovim

slučajevima je više izraženo oslobađanje citoplazmatskih enzima poput

ALT.

• GLD zajedno sa m-AST je važan u proceni težine oštećenja jetrenih ćelija

• GLD je više koncentrisan u centralnim zonama jetrenih lobusa nego u

periportalnim delovima

• Ova distribucija je reversna distribuciji ALT.

• Realno je očekivati povećanje GLD u stanjima u kojima centrolobularna

nekroza se dešava (kao rezultat ishemije, u trovanju halotanom).

30

Metode određivanja aktivnosti glutamat dehidrogenaze

Kontinuirana metoda • reakcija GLD može se

odvijati u oba smera • ravnoteža forsira stvaranje

glutamata, veća brzina je dobijena kada je 2-oksoglutarat korišćen kao supstrat.

• Reakciona smesa: • NADH, amonijumova so, i

ADP u puferu pH 7,5. • Reakcija započinje dodatkom

supstrata 2-oksoglutarata. • Meri se smanjenje

apsorbancije na 339 nm.

31

Metode određivanja aktivnosti glutamat dehidrogenaze

Optimizacija metode • Nemačko društvo za kliničku hemiju je optimiziralo metodu na 37o C. • U reakcionu smesu se dodaje oksamat jer ova kiselina inhibira aktivnost LD,

i na taj se način izbegava korišćenje NADH od strane ovog enzima

Stabilnost enzima • Aktivnost GLD u serumu je stabilna na 4oC u toku 48 sati • na -20o C nekoliko nedelja

Referentne vrednosti • Gornja granica GLD za žene je 6 U/L • 8 U/L za muškarce na 370 C

32

Glutation-S-transferaza

• EC 2.5.1.18

• Skraćenica GST

• Citozolni enzim

• GST je dimerni enzim koji katalizuje reakciju nukleofilnog ugrađivanja glutationa u elektrofilne centre raznih hemijskih struktura što predstavlja reakciju detoksikacije.

• GST delimično pokazuje aktivnost glutation peroksidaze i ima važnu ulogu u intracelularnom vezivanju i transportu raznih endogenih i egzogenih supstanci.

• Familija GST proteina obuhvata četiri klase: α θ μ i π.

• α-GST je nađena u velikoj količini u jetri i brzo se oslobađa u cirkulaciju u velikoj količini kod oštećenja hepatocita.

• Poluživot enzima 90 minuta; brzo reagujući i osetljiv marker.

33

Klinički značaj glutation-S-transferaze

• α-GST je brz marker hepatocelularnog oštećenja.

• Nasuprot transaminazama koje su nađene uglavnom u

periportalnim hepatocitima, α-GST je raspoređena duž jetrenih

acinusa i oslobađa se u svim tipovima oštećenja hepatocita.

• Kod transplantiranih pacijenata utvrđeno je da je GST bolji

(korisniji) parametar u odnosu na AST u detekciji epizoda

odbacivanja u postoperativnom periodu i manje podložno

interferirajućim efektima infekcije

34

Određivanje aktivnosti enzima • Problem je odrediti aktivnost ovog enzima u serumu 1. Prvo normalna aktivnost u plazmi je niska i teško je izmeriti 2. GST vezuje izvestan broj anjona, kao što su bilirubin i žučne

soli koji inhibiraju aktivnost enzima. Određivanje masene koncentracije enzima • Imunoesej metode omogućavaju precizno i specifično

određivanje koncentracija α-GST. • Nedostaci metode: određivanje traje nekoliko sati.

Referentne vrednosti • Imunohemijska metoda 11,4 μg/L

Metode određivanja aktivnosti glutation-S-transferaze

enzimi jetre

Health & Medicine