IMUNOLOGIA ERITROCITÁRIA

HISTÓRICOSéculo XVITransferência de sangue de um indivíduoa outro sempre foi um desafio para o homem.

1492 1o relato de transfusão Papa Inocêncio VIII, recebeu sangue de 3 jovens doadores.

A tentativa heróica teve como conseqüência a morte dos 3 doadores por anemia e do pontífice por reação transfusional.

1667

O médico de Luis XIV, Jean-Baptiste Dennis realizou as primeiras transfusões de animal –homem, porém, como se poderia esperar, sem sucesso.

1818

James Blundel, um médico inglês, realizou com sucesso a primeira transfusão homem-homem

Postulado de Ottemberg:

“A transfusão só é possível quando o soro do receptor não aglutina as hemácias do doador”.

1900

Era cientifica da transfusão descoberta do Sistema ABO por Karl Landsteiner

1911

1945 Emprego e análise dos testes de aglutinação direta, através do emprego da albumina bovina e a antiglobulina humana

1946Surge também a utilização das enzimas proteolíticas e de outros reagentes como a Solução de LISS e o Polibreno

1974 Polietilenoglicol

Nos últimos anos, os avanços na bioquímica e na genética molecular contribuíram para o descobrimento de diversos Sistemas de Grupos Sangüíneos

A análise das freqüências antigênicas nos permite observar características relacionadas a determinadas raças.

Os grupos sangüíneos se aplicam a estudos genéticos e antropológicos.

Função dos grupos sangüíneos

Receptores de vírus, bactérias e parasitas Participação no fenômeno de adesão de

moléculas Ação enzimática Função protéica estrutural.

A imunematologia eritrocitária é aplicada em varias áreas da medicina

HEMATOLOGIA / HEMOTERAPIA

Vários testes são realizados na rotina laboratorial dos doadores de sangue, na seleção pré-transfusional e nos estudos de pacientes hematológicos:•Classificação Sanguínea ABO / Rh•Fenotipagem eritrocitária•Pesquisa de auto-anticorpos - Coombs direto•Pesquisa de anticorpos irregulares - Coombs Indireto•Provas de compatibilidade sanguínea

OBSTETRÍCIA / NEONATOLOGIA

Aplicamos diversos testes imunematológicos no acompanhamento de gestantes e no recém-nato visando a prevenção e o diagnostico precoce da Doença hemolítica peri-natal.

• Classificação sanguínea ABO / Rh• Fenotipagem eritrocitária• Pesquisa de anticorpos irregulares no soro materno que atravessam a barreira placentária - Coombs Indireto• Pesquisa de anticorpos maternos que sensibilizam as hemácias do recém-nato pois cruzam a barreira placentária - Coombs Direto

 MEDICINA LEGAL

O estudo dos grupos sangüíneo também tem sua aplicação, através da utilização das técnicas moleculares, nos estudos de paternidade e no reconhecimento de cadáveres.

IMUNOLOGIA ERITROCITÁRIA

A Imunematologia eritrocitária é uma ciência que

estuda os Grupos Sangüíneos através da análise dos

diversos ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS E DE

SEUS ANTICORPOS séricos correspondentes.

As reações antígeno-anticorpo são reveladas através do fenômeno da AGLUTINAÇÃO que é a mais importante ferramenta de trabalho dos imunematologistas.

DEFINIÇÃO DOS GRUPOS SANGÜÍNEOS

Antígenos Alotípicos da membrana eritrocitária

São considerados antígenos pois são substâncias capazes de deflagrar a resposta imune induzindo a formação de anticorpos e possuem a capacidade de se combinarem a ele.

Os antígenos são produtos genéticos:Os antígenos são produtos genéticos:

fabricados diretamente pelo material genético

ou indiretamente através de enzimas que agem em

um substrato e o transformam em um determinado

antígeno.

Antígenos protéicos Antígenos protéicos

são produto primário do gene.

Assim temos:

Sistema Rh

Sistema MNS

Quando o antígeno é um Açúcar, ele é o produto secundário do gene.

O Produto primário são as Glicosiltransferases

Sistemas ABO

GENETICAMENTE INDEPENDENTES

Dominante ou recessivo

Ex: genes H e h

Co-dominanteEx: genes A e B

MONOMORFISMOProdução de apenas 1 antígeno - Sistema H.

DIFORMISMOProdução de apenas 2 antígenosExemplo: Antígenos - Yta e Ytb

POLIMORFISMOProdução de vários antígenos, Exemplo: Sistemas Rh e Kell. 

HOMOZIGOSE ou HETEROZIGOSE.Alguns genes apresentam efeito de dose. Ex.: Sistema MNS Antígenos M e N

EFEITO DE POSIÇÃO. Neste caso um gene situado na posição trans em relação a um outro, tem sua ação modificada.Ex.: Sistema Rh Gene C trans com D

Reconhecimento de um Antígeno Ocorre pela interação química, não covalente, entre segmentos da molécula do antígeno, chamado de determinante ou sítio antigênico ou epitopo, com regiões especializadas de moléculas de glicoproteínas. Ex.: N-acetilgalactosamina (Antígeno A)

O determinante é o responsável pela especificidade de um determinado antígeno.

Os Antígenos eritrocitários bioquimicamente podem ser:

GLICOPROTEÍNAS - Exemplo: Sistemas M.

GLICOLIPÍDEOS - Exemplo: Sistema ABO, Hh.

LIPOPROTEÍNAS - Exemplo: Sistema Rh.

PARCIALPARCIAL

Ex.: Antígenos D parciais do Sistema Rh

Características dos AntígenosCaracterísticas dos Antígenos

COMPOSTOCOMPOSTO

Ex.: Ag Leb

CRIPTOANTÍGENOSCRIPTOANTÍGENOS

Ex.: Ag T e Tn

Hétero-antígenosPertencentes a espécies diferentes.

Ex.: Antígenos presentes em animaisAlo-antígenosDiferem os indivíduos de uma mesma espécie.

Ex.: Ag A, B, O.Auto-antígenosSão antígenos do próprio indivíduo, alvos de auto-anticorpos.

Ex.: Ag I, e antígenos do Sistema Rh.

Antígenos na membrana eritrocitáriaAntígenos na membrana eritrocitária

O número de sítios antigênicossítios antigênicos na membrana eritrocitária é variável e pode influenciar a reação antígeno-anticorpo.

Observamos que:

• hemácias Al = 1.000.000 sítios do Ag A1

• hemácias Rh + = 10.000-30.000 sítios do Ag D

• hemácias Fy a+ = de 15.000 sítios do Ag Fya

• hemácias K + = 2000-5000 sítios do Ag K

Membrana Eritrocitária

PROTEÍNAS DA MEMBRANA ERITROCITÁRIA

Proteínas Estruturais - Sistema Rh e Kell

Proteínas Receptoras - Sistema Duffy

Proteínas de Transporte – Sistema Kidd

Enzimas Membranares – Sistema Kell Proteínas Controladoras do Complemento – Sistema

Chido e Rodger

ANTÍGENOS GRUPOS SANGUÍNEOS ( CARREADOR ) MICROORGANISMOS

P (oligossacarídio) E . coli, Parvovirus B19

Leb (oligossacarídio) Helicobacter pylori

H, A (oligossacarídio) Candida albicans

M, N (GPA) e Gerbich (GPC) Plasmodium falciparum

Dra (DAF - CD55) E . coli

Cromer (DAF - CD55) Echovirus

Indian (CD44) Poliovirus AnWj (CD44) Haemophilus influenzae

Duffy (receptor da M.E.) P. vivax, P. knowlesi

Na imunematologia a principal resposta imunológica é a humoral, através da ativação dos linfócitos B.

ANTICORPOS ANTI-ERITROCITÁRIOS

IgM IgG

A IgG é o único anticorpo humano que atravessa a barreira placentária. Essa propriedade está relacionada com a composição química dos fragmentos Fc.

Atuam melhor a 37oC

IMUNOGLOBULINA G (IgG)

As IgM encontram-se principalmente sob a forma de PENTÂMEROS, apresentando 10 sítios de ligação com o antígeno e são chamados anticorpos aglutinantes.

Atuam melhor em baixas temperaturas.

IMUNOGLOBULINA M (IgM)IMUNOGLOBULINA M (IgM)

ANTICORPOS NATURAISANTICORPOS NATURAIS

Não identificamos um estímulo antigênico especifico. Na sua grande maioria são IgM , mas também observamos IgG.

NATURAIS REGULARES

São aqueles que sempre estão presentes se o antígeno correspondente estiver ausente

Ex: anti-A, anti-B , anti-P PI Pk (anti-Tja)

NATURAIS IRREGULARES

São aqueles que não estão necessariamente presentes se o antígeno correspondente estiver ausente

Ex: anti-Le a , anti-Le b , anti-Pl , anti-M

ANTICORPOS IMUNESANTICORPOS IMUNES São decorrentes de estímulo antigênico especifico, ou seja: a TRANSFUSÃO OU GRAVIDEZ.

Via de regra são IgG. Na fase muito inicial da sensibilização podemos observar uma IgM, que logo desaparece, dando lugar a IgG que permanecerá detectável ou em memória imunológica.

Observamos também que determinados sistemas são mais imunogênicos que outros: Sistemas RH > KELL > KIDD > DUFFY > MNS.

A resposta imune também se relaciona à a predisposição genética. Indivíduos HLA Al B8 DR3 são bons produtores de anticorpos.

E observado uma maior incidência em mulheres.

Doenças malignas relacionadas ao S. Linfóide e a cirrose hepática predispõem à formação de anticorpos.

SISTEMA COMPLEMENTOSISTEMA COMPLEMENTO

O Sistema Complemento, é um sistema complexo constituído por muitas proteínas com atividade enzimática que complementam o efeito dos anticorpos.

Efeitos Biológicos:

Imunoaderência, lise da célula alvo e facilitação da fagocitose do antígeno.

A presença de duas moléculas de IgG ou uma de lgM ligadas às hemácias (complexo Ag - Ac) são capazes de ativar a cascata do complemento.

A aderência de fragmentos C3b pode levar à facilitação da fagocitose (opsoninização) levando a:

HEMÓLISE EXTRA-VASCULARHEMÓLISE EXTRA-VASCULAR

Quadros de mal aproveitamento transfusional.

A inserção dos componentes finais (C5 - C9) na membrana eritrocitária leva a formação de orifícios funcionais - HEMÓLISE INTRA-VASCULAR.

Exemplo clássico:

Anticorpos do Sistemas ABO, dai a extrema importância transfusional deste Sistema

ATIVAATIVAÇÃOÇÃO DA CASCATA DO SISTEMA DE COMPLEMENTO DA CASCATA DO SISTEMA DE COMPLEMENTO

Antígeno

REAÇÃO ANTÍGENO ANTICORPOREAÇÃO ANTÍGENO ANTICORPO

ESPECIFICIDADE REVERSIBILIDADEAg-Ac Ag + Ac

A reação antígeno-anticorpo é uma reação de equilíbrio submetida à Lei Geral de Ação das Massas.

Os anticorpos relacionados aos grupos sangüíneos e seus antígenos estão unidos num equilíbrio dinâmico .

(Ag- Ac) = K’ = K

(Ag- Ac) K’’ K’ = constante de associação Ag Ac.

K’’= constante de dissociação Ag Ac.

K = constante de equilíbrio do sistema

HEMÁCIAS NÃO AGLUTINADAS

AGLUTINAÇÃO

FIXAÇÃO DE ANTICORPOS NAS HEMÁCIAS

Os anticorpos reagem com seus antígenos específicos, a ferramenta laboratorial é a análise da aglutinação.

REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO

A aglutinação é a formação de agregados suficientemente grandes que possibilitem a sua visualização.

As IgM possuem 10 sítios de ligação com o antígeno e são denominadas

ANTICORPOS AGLUTINANTES.

As IgG são monômeros e possuem apenas 2 sítios de ligação com o antígeno e são denominadasANTICORPOS SENSIBILIZANTES

POTENCIAL ZETAPOTENCIAL ZETA

É a diferença de potencial eletrostático entre a superfície das células e a periferia da nuvem iônica. (ZONA DE DESLIZAMENTO)

As hemácias são partículas eletro-negativas devido aos grupos carboxílicos das sialoglicoproteínas da membrana eritrocitária.

Essa eletronegatividade cria uma forte repulsão entre elas em meio salino.

Os eletrólitos contidos no meio, envolvem cada hemácia como uma nuvem de íons positivos que se torna menos densa, à medida que se distancia do glóbulo.

A força de repulsão entre as hemácias depende do Potencial Zeta.

Carga elétricas negativas das hemácias

Constante dielétrica do meio Força iônica do meio

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ImunoBase- DiaMed AG

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Reação Ag-Ac

POTENCIALIZADORESSubstâncias que auxiliam o fenômeno da aglutinação

Os anticorpos não aglutinantes fixam-se sobre as membranas das hemácias sem aglutiná-las.

Podemos visualizar a aglutinação de hemácias sensibilizadas por IgG aplicando artifícios técnicos que interferem no Potencial Zeta diminuindo-o a um ponto critico e levando a AGLUTINAÇÃO.

É o que denominamos produção artificial da aglutinação.

TRATAMENTO DAS HEMÁCIAS POR ENZIMAS  Pickles - 1946

As enzimas proteolíticas retiram polipeptídios contendo ácido siálico das glicoproteínas membranares das hemácias.

Isto determina a diminuição da carga elétrica das hemácias diminuindo sua repulsão.

Também aumentam a afinidade do anticorpo pelo antígeno pois expõem melhor estes antígenos

Ex. PAPAÍNA, FICINA, BROMELINA

ADIÇÃO DE SUBSTÂNCIAS MACROMOLECULARES

Determina a neutralização de parte das cargas elétricas

negativas das hemácias pois se polarizam em seu campo

elétrico.

Aumento da constante dielétrica do meio e assim temos diminuição do Potencial Zeta por substâncias hidrossolúveis como: ALBUMINA e FICOL.

POLÍMEROS SOLÚVEIS EM ÁGUA

São substancias que rechaçam moléculas de água facilitando a fixação de anticorpos auxiliando portanto a 1a fase da reação antígeno-anticorpo: POLIETILENOGLICOL

ADIÇÃO DA ANTIGLOBULINA HUMANA (AGH)

A AGH é um hétero-anticorpo que reconhece proteínas humanas.

Este é um artifício imunológico para se visualizar o fenômeno da hemaglutinação

A fração Fab da AGH se liga na fração Fc das imunoglobulinas e também ao complemento.

Os pontos de ligação levam a neutralização das cargas elétricas e assim temos diminuição do Potencial Zeta

ImunoBase- DiaMed AG

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Fonte: P. Rouger e C. Salmon; La pratique de l´agglutination des Érythrocytes et du Test de Coombs