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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas em Imunologia

Parte IParte IMétodos Laboratoriais em ImunologiaMétodos Laboratoriais em Imunologia

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Colheitas Utilizar o Utilizar o tubo correctotubo correcto

Sangue /plasmaSangue /plasmaAnticoagulante apropriadoAnticoagulante apropriado

• EDTAEDTA• CitratoCitrato• heparinaheparina

SoroSoroCom activador da coagulaçãoCom activador da coagulaçãoCom activador da coagulação e gel separador do Com activador da coagulação e gel separador do

coágulo e sorocoágulo e soro


Soro

Coagulação deve ser completaCoagulação deve ser completa Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem

anticoagulanteanticoagulante Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da

coagulaçãocoagulação

Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação natural ou induzidanatural ou induzida

Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºCCentrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºC Guardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinasGuardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinas


Que tubo utilizar? Preparação de leucócitosPreparação de leucócitos

Habitualmente utilizar anticoagulante (qual Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste)depende do teste)

Purificar as célulasPurificar as células Preservar as célulasPreservar as células

Fenotipagem Fenotipagem 4ºC 4ºCCultura/estudos funcionaisCultura/estudos funcionais

• Transportar o sangue a RT rapidamenteTransportar o sangue a RT rapidamente• Preparar as células rapidamentePreparar as células rapidamente• Cultivar/testar de imediatoCultivar/testar de imediato


Outros tipos de Amostra (I) Urina (muito raro)Urina (muito raro)

CSFCSF SalivaSaliva Liquidos de:Liquidos de:

Sinovial, Sinovial, pleura, pleura, pericárdio, pericárdio, peritoneu, peritoneu, BALBAL

Utilizar Tubo c/ EDTA

ou

sem anticoagulante


Outros tipos de Amostra (II)

Biópsias (aspirados por agulha fina)Biópsias (aspirados por agulha fina) Nódulos linfáticosNódulos linfáticos Medula ósseaMedula óssea TumoresTumores etcetc

Utilizar Tubo c/ EDTA

ou

Com heparina


Amostras que necessitam de processamento especial

ComplementoComplemento Congelar a –20ºC até 2 horas após colheitaCongelar a –20ºC até 2 horas após colheita

CrioglobulinasCrioglobulinas Colhido em tubo morno, estéril e sem Colhido em tubo morno, estéril e sem

anticoagulanteanticoagulante Mantido a 37ºC até ser testadoMantido a 37ºC até ser testado


O que deve acompanhar a amostra

Identificação completa do doente no tubo e na Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco)requisição (ou código claro e unívoco)

Sexo, data de nascimentoSexo, data de nascimento Exame requisitadoExame requisitado Patologia suspeitaPatologia suspeita Tipo de amostraTipo de amostra Data e hora da colheitaData e hora da colheita Nome,código e assinatura do Médico requisitanteNome,código e assinatura do Médico requisitante


Razões de rejeição de amostras

Colheita inapropriadaColheita inapropriada Tubo erradoTubo errado Condições de manutenção/transporte incorrectasCondições de manutenção/transporte incorrectas Informação incorrecta/ilegível no tuboInformação incorrecta/ilegível no tubo Informação no tubo discordante da requisiçãoInformação no tubo discordante da requisição HemóliseHemólise Volume insuficienteVolume insuficiente Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)


Técnicas baseadas em Imunoglobulinas

Ligação dos anticorpos é específicaLigação dos anticorpos é específica Anticorpos podem ser conjugados com um Anticorpos podem ser conjugados com um

vasto leque de enzimas e marcadoresvasto leque de enzimas e marcadores

Constituem excelentes reagentes para a Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de identificação sensível e específica de ligandosligandos

Permitem o estudo do historial imunológico Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduode um índivíduo


Anticorpos como reagentes Preparação de Anticorpos policlonaisPreparação de Anticorpos policlonais

Inoculação/estimulação de animaisInoculação/estimulação de animaisAdjuvantesAdjuvantesQue animalQue animalQue via de inoculação/estimulaçãoQue via de inoculação/estimulação

Colheita, preparação e teste do soroColheita, preparação e teste do soro Estimulação repetida leva a uma Estimulação repetida leva a uma

maturação da especificidade do Abmaturação da especificidade do Ab


Anticorpos como reagentes Preparação de anticorpos monoclonaisPreparação de anticorpos monoclonais

Estimular animais como anteriormenteEstimular animais como anteriormente Colher Linfoblastos BColher Linfoblastos B Fazer experiências de diluição limiteFazer experiências de diluição limite Preparar hibridomas com estas célulasPreparar hibridomas com estas células Fazer experiências de diluição limite dos Fazer experiências de diluição limite dos

hibridomashibridomas Testar cada clone para especificidadeTestar cada clone para especificidade

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas em Imunologia

Parte IParte IMétodos Laboratoriais em ImunologiaMétodos Laboratoriais em Imunologia


Técnicas baseadas em imunoglobulinas

Ensaios LiquidosEnsaios Liquidos(ensaios homogéneos)(ensaios homogéneos)

Difração da luzDifração da luz NefelometriaNefelometria turbidimetriaturbidimetria

Outros ensaios liquidosOutros ensaios liquidos EMITEMIT CEDIACEDIA

ImunofluorescênciaImunofluorescência AglutinaçãoAglutinação QuimioluminescênciaQuimioluminescência

Ensaios SólidosEnsaios Sólidos(ensaios heterogéneos)(ensaios heterogéneos)

ELISAELISA CompetitivoCompetitivo Não-competitivo Não-competitivo

indirectoindirecto RIARIA


Técnicas baseadas na difracção da luz

NefelometriaNefelometria

Baseada na reacção de Baseada na reacção de imunoprecipitaçãoimunoprecipitação

Mede a quantidade de luz Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de difractada devido à presença de complexos imunológicoscomplexos imunológicos

O ângulo de difracção e o O ângulo de difracção e o comprimento de onda são comprimento de onda são aspectos importantesaspectos importantes 31º permite melhor razão 31º permite melhor razão

sinal/ruídosinal/ruído

ImunoturbidimetriaImunoturbidimetria

Baseada na reacção de Baseada na reacção de imunoprecipitaçãoimunoprecipitação

Mede a diminuição de luz que Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma consegue atravessar uma solução na presença de solução na presença de complexos imunológicoscomplexos imunológicos

O detector está sempre alinhado O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada, mas da não difractadadifractada


Curva de imunoprecipitação Assumindo:Assumindo:

Ig pelo menos bivalentes IgGIg pelo menos bivalentes IgG Antigénio com pelo menos 2 Antigénio com pelo menos 2

epitopesepitopes Se Ab em excesso, um aumento Se Ab em excesso, um aumento

de Ag implica um aumento da de Ag implica um aumento da reacçãoreacção

Se Antigénio em excesso, um Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a antigénios, o que diminui a precipitaçãoprecipitação

A quantificação só é possível se o A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excessoanticorpo estiver em excesso


Cinética da Curva de imunoprecipitação

A reacção inicia-se A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio20s após a adição do antigénio

A reacção prossegue de modo A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos a precipitação dos complexos origina uma aparente origina uma aparente diminuição da reacçãodiminuição da reacção


Rate Nephelometry [Ab] é constante[Ab] é constante Aumento progressivo da Aumento progressivo da

[antigénio][antigénio] Deve ser realizada na zona de Deve ser realizada na zona de

excesso de Abexcesso de Ab Em nefelómetros automáticos Em nefelómetros automáticos

deste tipo, 2 [antig] são deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado:Dependendo do resultado: São testadas novas []São testadas novas [] É testada o excesso de antigÉ testada o excesso de antig


End-point nephelometers

Medida no ponto Medida no ponto máximo da reacçãomáximo da reacção

Medida de branco ou Medida de branco ou no inicio da reacçãono inicio da reacção

Valor intrapolado de Valor intrapolado de uma curva de uma curva de calibraçãocalibração

VariaçõesVariações Particle enhancedParticle enhanced


Particle enhanced nephelometry

São utilizadas particulas de latex São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio conjugadas com anticorpo ou antigénio competidorcompetidor Aumento de sensibilidadeAumento de sensibilidade


Ensaios RequisitosRequisitos

Qualquer fluido Qualquer fluido SoroSoro PlasmaPlasma UrinaUrina CSFCSF

Deve ser diluído (para não Deve ser diluído (para não interferir na leitura)interferir na leitura)

Amostras ricas em lipídios devem Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugaçãoultracentrifugação

Amostras ictéricas ou hemolisadasAmostras ictéricas ou hemolisadas Não afectam a nefelometriaNão afectam a nefelometria Afectam a turbidimetriaAfectam a turbidimetria


Outro ensaios homogéneosCEDIA CEDIA

(Cloned enzyme donor assay)(Cloned enzyme donor assay) -galactosidade em 2 fragmentos -galactosidade em 2 fragmentos

inactivosinactivos enzyme donnorenzyme donnor Enzyme acceptorEnzyme acceptor

A reacção imune junta-os A reacção imune junta-os activando a enzima. activando a enzima.

Se não houver antigénio o Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima anticorpo liga-se à enzima inactivando-ainactivando-a

EMIT EMIT (Enzyme multiplied immunoassay (Enzyme multiplied immunoassay

technique)technique) Aumento ou diminuição da Aumento ou diminuição da

actividade enzimatica com a actividade enzimatica com a reacção Ag-Abreacção Ag-Ab


Imunofluorescência Anticorpos conjugados com Anticorpos conjugados com

compostos fluorescentescompostos fluorescentes Conjugado utilizado como Conjugado utilizado como

revelador directorevelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na Aumento de 10 a 1000 vezes na

sensibilidadesensibilidade Grande aumento na rapidez de Grande aumento na rapidez de

detecçãodetecção Vantagens relativamente à RIA:Vantagens relativamente à RIA:

Tão sensivelTão sensivel Reagentes mais estáveisReagentes mais estáveis Mais fácil de implementarMais fácil de implementar


Principais fluorocromos utilizados


Técnicas de imunofluorescência (I)

DirectasDirectas Anticorpo directamente conjugadoAnticorpo directamente conjugado

IndirectasIndirectas Anticorpo secundário conjugadoAnticorpo secundário conjugado

AcopladasAcopladas Duas reacções acopladasDuas reacções acopladas

Fluorescence polarization immunoassayFluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida

quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexoantigénio no complexo


Técnicas de imunofluorescência (II)

Fluorescent Quenching assay Fluorescent Quenching assay Método competitivo directo que utiliza [ab] fixaMétodo competitivo directo que utiliza [ab] fixa

Competição para o ab entre o antigénio marcado e o Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar)não marcado (a testar)

A fluorescência é absorvida (quenched) quando o A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpoantigénio marcado se liga ao anticorpo

A intensidade de fluorescência é uma medida da A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpopara o anticorpo

Método indirectoMétodo indirecto


Técnicas de imunofluorescência (III)

Substrate labelled Fluorescent immunoassay Substrate labelled Fluorescent immunoassay Método indirectoMétodo indirecto

Analito ligado a um modulador que influencia o sinal geradoAnalito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligação do AbActividade do modulador influenciada pela ligação do Ab


Técnicas de imunofluorescência (IV)

Fluorescent energy transfer immunoassay Fluorescent energy transfer immunoassay Método competitivoMétodo competitivo

Analito conjugado com FITCAnalito conjugado com FITC Anticorpo ligado a RodaminaAnticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao Se o analito conjugado ligar ao

anticorpo, por ressonância a energia anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodaminado FITC excita a rodamina

Se por competição, o analito impedir Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodaminanão haverá excitação da rodamina


Problemas da imunofluorescência

AutofluorescenciaAutofluorescencia Proteinas do soro (320-Proteinas do soro (320-

350nm)350nm) Bilirubina (430-470nm)Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha Urina apresenta elevada linha

de basede base Para obviar a estes problemas Para obviar a estes problemas

pode-sepode-se Tratar a amostra com Tratar a amostra com

Enzimas proteoliticasEnzimas proteoliticas Agentes oxidantesAgentes oxidantes Agentes desnaturantesAgentes desnaturantes

QuenchingQuenching BilirrubinaBilirrubina HemoglobinaHemoglobina

FotodestruiçãoFotodestruição Diminuição da Diminuição da

fluorescência ao fluorescência ao longo da excitaçãolongo da excitação


Aglutinação Baseada na reacção ag-abBaseada na reacção ag-ab Observada visualmenteObservada visualmente Tipos:Tipos:

Directa (ABO)Directa (ABO) IgM aglutina várias RBCIgM aglutina várias RBC IgG necessita de reagente de IgG necessita de reagente de

Coombs (anti-human-ab) para fazer Coombs (anti-human-ab) para fazer a pontea ponte

Indirecta ou passivaIndirecta ou passiva Antigénio ligado a subtancia inerteAntigénio ligado a subtancia inerte

ReversaReversa Anticorpo ligado a substancia inerteAnticorpo ligado a substancia inerte


Aglutinação de partículas

Mais sensíveis que a aglutinaçãoMais sensíveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, Mensurável por nefelometria, turbidimetria,

contagem de partículascontagem de partículas Anticorpo ou antigeneo conjugado com partículas Anticorpo ou antigeneo conjugado com partículas

de látexde látex Reacção ag-ab aglutina as partículas que saem de Reacção ag-ab aglutina as partículas que saem de

soluçãosolução A medida das partículas em solução é A medida das partículas em solução é

inversamente proporcional ao titulo a determinarinversamente proporcional ao titulo a determinar


Ensaio quimioluminescente Produção de luz por uma reacção química, habitualmente uma reacção Produção de luz por uma reacção química, habitualmente uma reacção

de oxidação-reduçãode oxidação-redução O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10 -18-18 a a

zeptomole=10zeptomole=10-21-21)) Compostos utilizados:Compostos utilizados:

Esteres de acridina (detecção do NaOH e HEsteres de acridina (detecção do NaOH e H22OO22)) Limite de detecção de 0.5 atomolesLimite de detecção de 0.5 atomoles

Derivados do isoluminol (detecção com HDerivados do isoluminol (detecção com H22OO22 e um catalizador) e um catalizador) Limite de detecção de 50 atomolesLimite de detecção de 50 atomoles


Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes


Ensaios em fase sólida

ELISAELISA CompetitivoCompetitivo

Não competitivo-indirectoNão competitivo-indirecto


Ensaios em fase sólida

ELISAELISA Sandwich ou de capturaSandwich ou de captura


Resolver problemas do ELISA


Electroforese de Imunoglobulinas

Electroforese em agarose de alta resoluçãoElectroforese em agarose de alta resolução ImunofixaçãoImunofixação ImunosubtracçãoImunosubtracção Electroforese capilarElectroforese capilar


Electroforese de Ig em agarose

Electroforese + Corar com Ponceau S e secar


Imunofixação ElectroforeseElectroforese Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo

monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondenteprecipitado onde houver Ig correspondente

Proteinas não pp são lavadasProteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosinCorar os pp com amido black nigrosin


Imunosubtracção


Crioglobulinas (I) Tipo ITipo I

Monoclonal (IgG, IgM, Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves)IgA, raramente c.leves)

Tipo IITipo II Mistas (2 ou mais Ig, Mistas (2 ou mais Ig,

sendo uma monoclonal)sendo uma monoclonal) Tipo IIITipo III

PoliclonalPoliclonal


Crioglobulinas (II)

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