imunologia prática

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IMUNOLOGIA Expressão da ligação Ag-Ac Há vários tipos de reacção Ag-Ac, segundo a natureza do Ag, a classe do Ac e a forma de detecção da união Reacção de precipitação Reacção de aglutinação Reacção de neutralização Fixação do complemento Reacção com elementos marcados Provas cutâneas As reacções de precipitação e aglutinação fora as primeiras a ser descobertas

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Page 1: Imunologia Prática

IMUNOLOGIA

Expressão da ligação Ag-Ac

Há vários tipos de reacção Ag-Ac, segundo a natureza do Ag, a classe do Ac e a forma de detecção da união

• Reacção de precipitação • Reacção de aglutinação• Reacção de neutralização• Fixação do complemento• Reacção com elementos marcados• Provas cutâneas

As reacções de precipitação e aglutinação fora as primeiras a ser descobertas

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Expressão da ligação Ag-Ac• Reacção de precipitação

Baseia-se na capacidade que alguns Acs (precipitinas) têm para formarem com Ags solúveis, macromoléculas sufi-cientemente grandes para precipitarem

É mais eficaz para detectar Ags do que Acs

Permite determinar títulos de Acs quando se coloca uma quantidade fixa de Ag em solução perante diluições sucessivas da amostra

A precipitação só se observa quando se obtém um ponto de equivalência de concentrações do Ag e do Ac (Fenómeno de prozona)

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União Ag-Ac

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Modificações da reacção de precipitação

1. Imunodifusão passiva– Difusão em gel

• Técnica de Ouchterlony (1948)

Realiza-se em poços perfurados num gel de agar onde se colocam soluções de Ags e Acs

A difusão de ambos na espessura do agar levará ao seu encontro produzindo bandas de precipitação

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Padrões de reacção em imunodifusão dupla(Técnica de Ouchterlony)

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Modificações da reacção de precipitação1. Imunodifusão passiva

– Imunodifusão radial (IDR)

• Técnica de Mancini (1965)

Utiliza um gel de agar em que se incorporou um Ac

Poços feitos no agar servem para acrescentar Ags ou factores do complemento

A difusão do Ag provoca um halo de precipitação em voltado poço

O diâmetro do halo é directamente proporcional à concen-tração do Ag, que é calculada face aos diâmetros dos halos produzidos por soros de concentração conhecida

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Imunodifusão radial (IDR)

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Modificações da reacção de precipitação2. Imunoelectroforese

É um excelente método para detectar diversos sistemas Ag-Ac sobre um gel de agar ou outro meio sólido, tendopor base uma separação electroforética prévia das váriasproteínas de uma solução antigénica complexa que depoisse põe em contacto com os Acs para dar as linhas deprecipitação

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Técnica de imunoelectroforese

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Modificações da reacção de precipitação3. Imunodifusão activa

– Contraimunoelectroforese

Usa uma placa de gel de agar com 2 poços em oposiçãoonde se coloca Ag num e Ac no outro

Submetida, a placa, a uma corrente eléctrica Ag e Ac migraram ao encontro um do outro para dar uma linha de precipitação

Boa para detectar Ags bacterianos em líquidos orgânicos

Ex.º Ags de meningococo ou de pneumococo no LCR quando não são visíveis na coloração de Gram

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Técnica de contraimunoelectroforese

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Modificações da reacção de precipitação3. Imunodifusão activa

– Electroimunodifusão a duas dimensões

Tecnicamente consegue-se que o Ac permaneça fixo e é o Ag que migra no gel

Com este método consegue-se que os precipitados tenham uma forma de ponta de lança

A altura dos precipitados é proporcional à concentração do Ag

Com um pH adequado pode fazer-se o contrário

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IMUNOLOGIA

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Modificações da reacção de precipitação3. Imunodifusão activa

– Electroforese cruzada de Laurell

Começa-se por realizar uma electroforese de proteínas

Uma vez concluída a separação, a placa de agar adere-se a outra que tem os Ags e submete-se a uma electro-forese cruzada

Também permite uma quantificação

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Técnica de Laurell

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Expressão da ligação Ag-Ac• Reacção de aglutinação

Possibilidade de alguns Acs ( aglutininas) provocarem aglutinação com Ags particulados (eritrócitos, bactérias, partículas de látex, etc.)

Os Acs mais aglutinantes são os da classe IgM

Está também sujeita aos fenómenos de prozona e pode utilizar-se como técnica qualitativa, semiquantitativa e quantitativa, em que o título da reacção corresponderá à maior diluição em que ainda se observa a aglutinação

Consoante a forma de se realizar, assim é:– Directa– Passiva

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Reacção de aglutinação1. Reacção de aglutinação directa

Consoante o tipo de Ag que se empregue assim o resul-tado da união Ag-Ac se pode observar de maneira diferente

No caso de bactérias, observa-se a formação de pequenos depósitos finamente granulares que se ressuspendem sem se desmancharem. Podem ser de tipo somáticos ou flagelares

Nos casos em que o Ag está representado por células inteiras como as hemáceas, produz-se o fenómeno de hemaglutinação, com a formação de grumos

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Reacção de aglutinação2. Reacção de aglutinação passiva

Por adsorção de Ags solúveis sobre a superfície de umacélula (GV) ou de uma partícula sintética (Látex),consegue-se converter uma prova de precipitação em reacção de aglutinação, melhorando a sua sensi-bilidade

Uma vez sensibilizadas põem-se em presença do soro problema e observa-se se há ou não aglutinação

É possível uma semiquantificação da taxa de Acs

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Reacção de aglutinação passiva

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Expressão da ligação Ag-Ac

• Reacção de neutralização

Neste tipo de reacção vai observar-se o fenómeno fisiológico de inactivação de um processo biológico

A união do Ag-Ac revela-se pelo desaparecimento de determinadas propriedades biológicas como sejam:

– Neutralização de vírus– Neutralização de toxinas in vitro– Neutralização da mobilidade

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Imunoensaios (Ensaios de ligação)

1. Ensaios heterogéneosExiste separação entre a fase ligada e a fase livreDoseia-se a fase ligada

2a. Competitivos (Ag*)2b. Imunométricos (Ac*)

2. Ensaios homogéneosNão há separação e ocorre uma modulação da actividade

da substância marcadaSó doseiam Ag

EMIT -Enzyme multiplied immuno assay technicFPIA -Fluorescente polarization assay

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IMUNOLOGIA

Imunoensaios (Ensaios de ligação)

1. Ensaios heterogéneos

• Tipo de marcadores (*)

– Radioisótopos – Enzimas– Compostos fluorescentes– Compostos luminescentes

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• Ensaios heterogéneos Competitivos

RIA -Radio immuno assayEIA -Enzyme immuno assayFIA -Fluoro immuno assayLIA -Luminescente immuno assay

[Ac fixo em fase sólida + Amostra (Ag a dosear) + Ag*]

A probabilidade que o Ag* tem de se ligar ao Ac é inversa-mente proporcional à concentração do Ag não marcado que interessa dosear

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IMUNOLOGIA

• Ensaios heterogéneos imunométricos(Ensaio tipo Sandwich)

IRMA -Immuno radio metric assayIEMA -Immuno enzymo metric assayIFMA -Immuno fluoro metric assayILMA -Immuno luminescente metric assay

[Ac fixo em fase sólida + Amostra (Ag a dosear) + Ac* ]

A fracção ligada é directamente proporcional à concentra-ção na amostra

ELISA -Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (IEMA)

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IMUNOLOGIA

Sífilis (Lues)

Testes inespecíficos:• Reacção de VDRL • RPR (rapid plasma reagin) - VDRL clássico, mod.Servem para pesquisar a reaginas sifilíticas e usam como Ag a

cardiolipina-lecitinaTítulos sugestivos se > 1/16Útil para monitorização da terapêutica

Testes específicos:• FTA-Abs – (Fluorescent Treponema Antibody-Absorption) Usa

uma técnica de imunoflorescência• TPHA – É uma reacção de hemaglutinação passiva, visto que

usa GVs de galinha revestidos com Ag treponémico• TPI – É um teste de imobilização treponémica• EIA e Western-Blot

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Transição materno-fetal

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Brucelose (Febre de Malta)

• Hemocultura (Método de Castañeda)• Reacção de Huddlesson – reacção de aglutinação rápida

em lâmina para detecção de Acs anti-Brucella abortus• Reacção de Wright - reacção de aglutinação lenta em

tubo para detecção de Acs anti-Brucella abortus Títulos de 1:80 a 1:160 são indicativos e os de 1:320 são conclusivos a

partir da 2ª semana

• Reacção de Rosa Bengala – reacção de aglutinação rápida em lâmina que usa uma suspensão tamponada de Brucella abortus corada com Rosa Bengala

Dá resultados qualitativos e é útil em estudos epidemiológicos em larga escala

Revela a brucelose aguda 4 a 6 dias depois da R. de Wright, mas perma-nece um pouco mais tempo positiva nos casos de brucelose antiga

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Febre tifóide• Hemocultura (Kayser)• Coprocultura (meio de Wilson–Blair com verde brilhante)• Reacção de Widal – em lâmina ou em tubo é uma prova de

aglutinação para detecção de Acs contra:

Salmonella typhi - O (somático) e H (flagelar)Salmonella paratyphi A – AH (flagelar)Salmonella paratyphi B – BH (flagelar)

Esperar grandes aumentos entre o 8º e 15º dia da doençaOs Ags O são os primeiros a subir e declinam rapidamente com o

tratamentoOs Ags H sobem mais lentamente e persistem denunciando uma

infecção antiga ou vacinaçãoTítulos de 1:160 em O e de 1:80 em H são indicativosNos casos positivos, a demonstração do Ag Vi (superficial ou de

virulência) interessa para o despiste de portadores. Títulos ≥20 já são suspeitos

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Mononucleose infecciosa

• Reacção de Paul-Bunnell-Davidsohn – reacção de hema-glutinação para detecção de Acs heterófilos ou de Acs inespecíficos de tipo Forssman

• Monoteste – teste de aglutinação em lâmina em que antes da adição de Ag EBV, se adiciona a uma parte da amostra Gvs de boi para adsorverem os Acs heterófilos e, a outra parte, rim de cobaia para adsorver os Acs inespecíficos

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Febre escaro-nodular (Febre da carraça)

• Reacção de Weil-Félix – em lâmina ou em tubo é uma prova de aglutinação para detecção de Acs anti-Proteus usando suspensões bacterianas coradas e inactivadas de:

– Ag Proteus OX2– Ag Proteus OXK– Ag Proteus OX19

Prova obsoleta por inespecífica

A doença é causada pela Rickettsia conorii e o vector é acarraça do cão

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IMUNOLOGIA

Hidatidose (Quisto hidático)

É uma Equinococose (Echinococcus granulosus) em que o cão é o hospedeiro definitivo albergando o parasita adulto

• Reacção de Wienberg – que é uma reacção de fixação do complemento

• Reacção de Casoni – intradermoreacção

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IMUNOLOGIA

Artrite reumatóide

• RA Teste (Factores reumatóides)

O termo Factor reumatóide (FR) engloba um grupo hetero-géneo de auto-Acs (na sua maioria IgM), que são capa-zes de reagir com diferentes epítopos da região Fc da IgG humana

A pesquisa pode fazer-se por:• Reacção de aglutinação em lâmina• Imuno-turbidimetria• Nefelometria

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Artrite reumatóide

• Reacção de Waller-Rose

É uma técnica de hemaglutinação que utiliza glóbulos de carneiro sensibilizados por imunoglobulinas de coelho anti-eritrócitos de carneiro

Em presença de FR, observa-se a hemaglutinação

Outras técnicas:• Imuno-turbidimetria• Nefelometria• ELISA e RIA

GV carneiro

Ac coelho anti-GV

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Lúpus eritematoso disseminado (LED)

• LE teste (fenómeno LE)

O teste é uma reacção de aglutinação em lâmina em que partículas de látex revestidas com (DNP) desoxiribo-nucleoproteínas, aglutinam se o soro do doente tiver Acs anti-DNP

• Pesquisa de células LE

Em 1948 descobriu-se que o fenómeno da célula LE era devido à fagocitose, por neutrófilos, de núcleos celu-lares opsonizados por auto-Acs

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IMUNOLOGIA

Infecção estreptocócica

No homem, os estreptococos dos grupos A, C e G de Lan-cefield podem causar faringite, mas praticamente só os do grupo A ocasionam febre reumática e glomerulone-frite

Estes estreptococos elaboram um grande número de pro-dutos extracelulares como:

• Estreptolisinas O e S (ASO/TASO)• Desoxiribonuclease B (DNAse)• Hialuronidase

A pesquisa pode fazer-se por:• Reacção de aglutinação em lâmina• Imuno-turbidimetria• Nefelometria

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IMUNOLOGIA

Gravidez

• DIG (Diagnóstico Imunológico de gravidez)

Teste presuntivo de gravidez que faz a detecção de hCG, se esta estiver acima de determinado nível de sensibi-lidade do teste (25 mUI/mL)

A pesquisa pode fazer-se por:

• Teste de aglutinação em lâmina• Teste imunocromatográfico

• Doseamento de β-hCG