genomİk analİzler - neu.edu.tr · snp/ cnv hücre cpi kimliklendirmesi genom modifikasyonu tek...
TRANSCRIPT
MahmutÇerkezErgören,PhD
GENOMİKANALİZLER
UygulamalıHücreKültürüKursu
3-4Haziran2016LeFoşa,KKTC
YAKINDOĞUÜNİVERSİTESİ
Genomik/ProteomikAnalizler-omiks(ing.–omics):Biyolojideçalışılanalanırefereeder,örneğin;genomiks,proteomiks.
-om(ing.–ome):Çalışmaalanlarınhedeflerinigösterir,örneğin;genom,proteom.
Genomiks:Organizmagenomlarınınçalışılması.
Proteomiks:Proteinyapıveişlevleriningenişölçekteçalışılması.
ProteomAnaliziGenlerinModifikasyonuveKlonlanması
TranskriptomAnalizleriiçinGenomikTestler
FizyolojikRekonstrüksüyonlar ModellemeAnalizleri
Genomikanalizyapılabilmesiiçin:
invitrohücreha_
Hücre/Doku/Organ NükleikAsit(DNAveRNA)ektraksiyonu
ANALİZ
FENOTİP
GENOTİP
İkincilveÜçüncülYapısıKarakterizasyonu
YADAİşlevselanalizler(invitrotest)
Proteinizolasyonu
PROTEOMİKS
Hücregenomdizianalizindeişakışı:
invitrohücreha_
Doku/Organ
DNAekstraksiyonuGenocpleme:DizianaliziANALİZ
SNP/CNVHücrecpikimliklendirmesiGenommodifikasyonu
TEKhücregenomdizianalizindeişakışı:LazerYakalamaMikrodissessiyon(LCM)
invitrohücreha_
Doku/Organ
veya
Flowsitometriveya
FloresanAkcveHücreAyırma(FACS)veyaMikrofluidler
Tekhücreizolasyonu
DNAekstraksiyonuGenocpleme:DizianaliziANALİZ
SNP/CNVHücrecpikimliklendirmesiGenommodifikasyonu
DNAekstraksiyonu
Tümgenomhaplocpanalizler
Ayda1yumurta
HerbirejakulaPa106
sperm
Genocpleme:Dizianalizi
BüyükölçekliGerm-linedenovomutasyon
tayini
“Mayockyönlendirme”
Genharitalama/SNPkimliklendirme/Popülasyonçalışmaları
• MolekülerbiyolojitekniklerikullanılarakbireyinDNAdizisininincelenmesi,başkabireylerleyadareferansDNAdizisiilekarşılaşTrarak,bireyingenoUpfarklılıklarınıbelirlemeişlemidir.
• BireylerinebeveynlerindenkalıTlanalellerigösterir.
Genocpleme
Aynı türün genomları arasındaki varyasyonçeşitlilikleridir.
1. İnsan genomlarındaki genom değisiklikleri kisileregöredeğismelerinerağmenetkileriyoktur.
2.Diğer değisiklikler fenoUpi, vücut yapısını belirleyennormal değerleri, metabolizmayı, pigmentasyonu vbetkileyebilirveherkisiyiözelyapar.
3.Bazıvaryantlarpatojenikcr.
6 milyondan fazla SNPkimliklendirildi.
Her500bazda0.5-10kezgözlenebilirler.~60,000genleriniçinde
Myerset.al.2008NatureGene,cs40,1124-1129
TekNükleocdPolimorfizmi(SingleNükleocdPolimorfizm–SNP)
İnsanGenomProjesi–1990/2004“TheLanguageofGod”FrancisCollins
3milyarnükleocd300bingen
11farklıpopülasyon~21bingen~Her50/100bç1SNP
~33bingen~GenomdaSNP’lervar
UluslararasıİnsanHaplocpHaritaProjesi(HapMap)–2005/-
GenocplemedeKullanılanTeknikler:1. RestriksiyonFragmentUzunlukPolimorfizmi(RFLP)
2. RastgeleÇoğalTlmışPolimorfikTanımlama(RAPD)
3. ÇoğalTlmış Fragment Uzunluk Polimorfizmi Tanımlama(AFLPD)
4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) / Gerçek Zamanlı – PCR(RT-PCR)
5. Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon
6. DNAdizianalizi
7. DNAmikroarray/SNParray
Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon
GenomikDNA
ASO(C) ASO(T)AlelSpesifikOligonükleocdler
Genocp
ProbProb
Dot-blotüzerindekiDNAörnekleri
! BilinenSNPler.
! Ucuz.
! Radyasyonyadafloresanboya.
DiziAnalizi• Verilen DNA fragmenUnin nükleoUd (adenin, guanin, sitozin, Umin)
sıralamasınıbelirlemeişlemidir.
DNAdizianalizinedenönemlidir?! Dizinin sıralanışını belirler, böylece organizmanın neden ve nasıl
yaşadığıhakkındabilgiverir.
! Bireylerin genleri, geneUk bölgeleri (genler ya da operonlar), birkromozomuyadatümgenomudizianalizleriilebelirlenebilir.
! Hayvanlar, bitkiler, bakteri vb gibi geneUk bilgi taşıyan her kaynaktanelde edilen DNA veya RNA moleküllerinden nükleoUd dizi analiziyapılabilir.
DiziAnaliziYöntemleri1.SangerDiziAnalizi(DideoksiDNAdizianaliziveyazincirsonlandırma)
invitroDNAreplikasyonuesnasındaDNApolimeraz taracndan zincir sonlandırandideoksinükleoUtlerirastgeleseçerekdizibelirlemesinedayanmaktadır.
Sanger dizi analizi tekniği hala büyükölçüdekullanılmaktadır.
500bç<dizileriçinideal.
3.Shotgundizianalizi
1000bç-tümkromozomanalizi
KaTbiryüzeyebağlananprimerlerlegüçlendirilmiş"DNAkolonileri"yada"DNAkümelenmeleri"dizianaliziformudur.
Dideoksi nükleoUdleri ile zincir sonlandırmayerine “sentezle dizi analizi” yönteminedayanır.
2.Pyrosekanslama
4.KöprüPCR
5.YeniNesilDizileme(NextGeneraconSequencing–NGS)
Yeniden-sekanslamabirbireyeaitgenomanalizi,aynıtürünfarklıbireylerindeki geneUk varyasyonları temsil etmediği içingereklidir.
• Varyasyonprofilendirilmesi
– GeneUkvaryasyon– Transkriptvaryason– EpigeneUkvaryasyon– Metagenomikvaryasyon
• Keşif
– Yenigenomlar
– Yenigenler– Yenitranskriptler– Küçük/uzunnon-codingDNA
RNADizianalisi(RNASeq)
• Kodlayanveyakodlanmayanbölgelerdekitransciprtprofillendirilmesi
Epigenomik
• Tümgenomprotein-DNAetkileşimi
• Genregülasyonununkalıtsalvegeridönüşümlüifadesi
Bugün
YeniNesilDizilemeMetodları1. Massivelyparallelsignaturesequencing(MPSS)
2. Polonysequencing
3. 454pyrosequencing(beadmicroreactor)
4. Illumina(Solexa)sequencing
5. SOLiDsequencing(2baseencoding)
GenelÖzellikeri
A.GenomikDNA’nınrastgelefragmentasyonu
B.BoncukyadadüzlemselkaTyüzeydesteklerkullanılaraktektekDNAfragmentlerininimmobilizasyonunusağlamalı.
C. PCR kullanarak DNA fragmentlerinin kaT yüzeyde amplifiyeetmekveböylecepolimerazkolonilerioluşturmak.
D. Dizi analizi ve floresan ya da kemilüninesans kullanarak herdöngüdensonrainsitusorgulamak/kontroletmek.
DNAmikroarray(DNA-chips,Gene-Chips,SNP-chips)
! Silikon,camveyanaylontabakaüzerindesabitkonumlardabilinenkısakomplementerDNAoligonükleoUtlerisıraylayerleşUrirler.
! OligonükleoUdler deneysel olarakbelirlenirler ve (1)microspotlama yada (2) bir çipüzerindesentezlenirler.
! Kullanıcı tanımlı SNP çipleri Ucari olarak temin edilebilir, ve> 400,000 farklı probuiçerebilir.
HuangH.etal.2015Microarrays4(4),570-595
Genlerinekspresyonseviyeleriniölçmekyadabirgenomdabirdenfazlagenbölgesindegenocplemesikullanilır.
Her bir DNA probu (veya oligo)10-12 pikomol özel DNA dizisiniiçerir.
cDNA örneği hibridizasyon içinkullanılanbirgenyadabaşkaDNAelemanınınkısaparçasıolabilir.
Prob-hedefleyerek hibritlemedehedef nükleik asit sekanslarınıngöreceli olarak belirlemek için -gümüş- veya kemilüminesanseUketlemeiletespitedilir.
DNAMikroarrayUygulamaAlanları:
1) GenEkspresyonProfilendirilmesi
2) KomperacfGenomHibridizasyon(CGH)
3) GeneID
4) KromacnimmünopresipitasyononChip
5) DamID
6) SNPdeteksiyonu
7) AlternacfKesimDeteksiyonu
8) FüzyonGenArray
9)TilingArray
invitrohücreha_
Doku/Organ
RNAdizianalizindeişakışı:
RNA
RT&Ikinci-zincirsentezi
cDNA
ÇoğalmışcDNA
PCR
DiziAnaliziEkspresyonProfilleri
RealTimeKonfirmasyon
RNAdizianaliziuygulamarı:• Genekspresyonu
• SNPkeşfi
• Post-transkripsiyonelSNP
• Ko-ekspresyonyolakları
bgisequence.comsitesindenalindi.
HedefBölgeSeçimi
PCRAmplifikasyonu
DiziAnalizi(ShortgunyadaYüksekverimlilikli)
GenomAnotasyon
DNAdizianalizi
KomperacfAnalizProteinTahminiYolaklar
GELECEK…
Hedeflenen nükleazların rekombinasyon vektörlerikullanarak ya da kullanılmayarak uygulanmasına“genomdüzenleme"denir.
GenomDüzenleme
Genom düzenleme araçları, in vitro ve in vivo olarakhedeflenen mutasyonların elde edilmesinde, gen yerdeğişcrmesindevegendüzelclmesindekullanılabilir.
Nükleazakcvitesinin sekansıspesifikveDNA'yabağlanabilmesi için, istenilen bölgeye özgü DNA-bağlamaproteinlerikullanılabilir(DNA-binding).
Buproteinler:(1)Zinc-fingerproteinleri(ZFPs)
(2) Transkripsiyon akUvatörü benzer efektör (TALE)(transcripUonacUvator-likeeffector)proteinleri
(3)Kümelenmişdüzenliaraboşluklukısapalindromiktekrarlar (CRISPR/Cas) (Clustered regulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats)
FDAonayıalındıktansonra...
ZFNsklinikdeneylerletestediliyor.
TALENveCRISPR/CasteknolojilerinispetenyenivehenüzklinikuygulamalardatestedilmemişUr.
CRISPR / Cas İngiltere'de insan embriyo ediUngiçinonaylanmışTr.
ZincFingerNükleaz(ZFN)
3+ZFModül,herbiri3bçNükleazfüzyonu
TALEfektorNükleaz(TALEN)
10+TALModül,herbiri1bçNükleazfüzyonu
CRISPR/Cas9
1hedefRNANükleazabağlanma
Clustered,Regularly-Interspaced,ShortPalindromicRepeats(CRISPR)–Associatedproteinsystem(/Cas)
VirusveplasmidlerekarşıprokaryoUkimmünsistem.S.pyogenesSF370TipIICRISPRlokusu4geniçerir:I.Cas9nükleazII.2non-codingCRISPRRNA(crRNA)III.trans-akUvatörcrRNA(tracrRNA)
IV.Prekürsör(oncu)crRNA(pre-crRNA)özdeşdoğrudantekrarlartaracndanaraboşluklunükleazkılavuz
CRISPR/CasSistemi
RNAbileşenleri,buyabancıgeneckdizileriDSB(double-strandbreak,ci|-zincirkırıkları)
oluşturmakiçinspesifikDNAdizilerineCas9endonükleaziniyönlendirmekcr.
CRISPR/Cas9TeknolojisindenSonraBiyolojisinSonAdımıTamamlanmışOldu
DNAyapısı/dizilenmesi
PCR
SNPtayini/Ekspresyoncalismlari
Genomdüzenleme
Workshop:1. İstenilengenbölgesininnükleoUddizisinenasılulaşabiliriz?
2. DNAdizisindekitekrarlıbölgelerintespitedilmesi?
3.HedefbölgedekiSNPtayinivepopulasyondakiönemi?
4.HedefSNP’inhastalıkyapıcıözelliklerininaraştırılması?