ENZIMAS DE RESTRICCINENZIMAS DE RESTRICCIN

Vector de clonacin digerido con EcoRI y

PvuII

ADNLigasa

Extremos cohesivos Extremos romos

Sitio de corte

ADN cromosmico

Sitio de corteSecuencias de reconocimiento

Tipos de enzimas de restriccin

Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrmicas, 4-7 pb. Sitio de corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia

Restriccin-modificacin

mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

mEcoRIEcoRI

mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm

mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm

EcoRIEcoRI

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GEcoRIEcoRI

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G

Plantas: metilacin m5CG y m5CNG.

Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilacin:McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354

Vertebrados: metilacin de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulacin de la transcripcin.HpaII, MspI: isosquizmeros, reconocen C/CGG

La metilacin del ADN en eucariotas superiores est relacionada con la regulacin de la transcripcin. El uso de algunas enzimas de restriccin especficas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado, obtenindose de esta manera informacin sobre la posible regulacin de la expresin de un gen por metilacin del ADN

Metilacin del ADN y digestin con enzimas de restriccin

Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando 6-metiladenina: Gm6ATC.PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC)ClaI: AT/CG*ATXbaI: T/CTAG*A

Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando 5-metilcitosina: Cm5CWGGEcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGGStuI: AGG/C*CT

DpnI: Es una enzima de restriccin que corta en la secuencia GATC slo si est metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar ADN plasmdico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro.

ENZIMAS DE RESTRICCIN

Reconocen secuencias concretas

Simetra (palndromes)

Ejemplos de palndromes

Dabale arroz a la zorra el abad La ruta natural A man, a plan, a canal: Panama

Enzimas de restriccin

Reconocen secuencias concretas Simetra (palndromes) Nmero de nucletidos en la secuencia

44

N1N2N3N4N5N6N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6N7N8

46 48

256 4096 65536

Sitios de corte de las endonucleasas de restriccin del tipo II

Tipo IIs: MboII

Extremos protuberantes

GAATTCCTTAAG

G-3CTTAA-5

5-AATTC3-G

EcoRI

5 protuberantes

Extremos protuberantes

CTGCAGGACGTC

CTGCA-3G-5

5-G3-GACGTC

PstI

3 protuberantes

Extremos romos

CCCGGGGGGCCC

CCC-3GGG-5

5-GGG3-CCC

SmaI

Extremos compatibles (I)

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRI

GAATTCCTTAAG

EcoRI

Extremos compatibles (II)

GTCGAGCAGCTC

GTCGACCAGCTG

SalI

CTCGAGGAGCTC

XhoI

Extremos romos (siempre compatibles)

CCCATCGGGTAG

CCCGGGGGGCCC

SmaI

GATATCCTATAG

EcoRV

Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles)

GAATTCCTTAAG

EcoRI

CTCGAGGAGCTC

XhoI

G-3CTTAA-5AA T-3T

5-TCGAG3-CTCG3-A

GAATTCTTAA

TCGAGAGCTC

Degradado de cadena sencilla

+ dNTPs

Rellenado parcial

Extremos no compatibles transformados en compatibles

AAGCTTTTCGAA

HindIII

TCTAGAAGATCT

XbaI

A-3TTCGA-5AG-3

5-CTAGA3-CC3-T

AAGTTCGA

CTAGATCC+ dATP, + dGTP

+ dCTP, + dTTP

Precauciones

Actividad star

Metilacin

Aspectos prcticos

Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la temperatura y condiciones ptimas.

Inhibicin: Adicin de 20 mM EDTA.

Inactivacin: Por calor o tratamiento con fenol-CIA

Dos enzimas de restriccin pueden utilizarse simultneamente siempre que compartan las mismas condiciones de digestin (temperatura, pH, concentracin de sales)