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ENZIMAS DE RESTRICCION

En 1978 Daniel Nathans, Hamilton Smith, y al científico suizo Werner Arber.

Fueron galardonados con el premio Nobel de Medicina por su trabajo en enzimas

de restricción que marcaron un notable avance en el campo de genètica.

La degradación del DNA extraño que ha ingresado a una célula huésped fue

descubierta por infecciones por fagos. Este fenómeno, denominado restricción, es

el resultado de la accion de endonucleasas específicas (enzimas de restricción)

que degradan el DNA extraño. Estas enzimas son codificadas por la bacteria a

nivel cromosómico o plasmidico.

Las enzimas de restricción se llaman también nucleasas de restricción,

endonucleasas de restricción y en algunas ocasiones enzimas restrictivas o

restrictasas. Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético

a partir de una secuencia que reconocen.

Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen

secuencias especificas

Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como

un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que

entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo

cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las

enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo

afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

 Se nombran con tres letras tomadas del genero y especie de la bacteria de la que

se aislaron originalmente, seguida a veces por una letra mas, que identifica el

serotipo (variante antigénica de la bacteria)y finalmente por numero romano que

las identifica en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias

enzimas con distintas especificidad:

Ejemplo:

Eco RI à E = género Escherichia

co = especie coli

R = cepa RV 13

I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres familias de

acuerdo con sus propiedades:

.      Tipo I y Tipo III:

a.      Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).

b.      Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las

Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o

río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la

secuencia que reconocen.

c.      Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA,

desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II:

a.      Sólo tienen actividad de restricción.

b.      Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia

que reconocen.

c.      Sólo requieren Mg++ como cofactor.

d.      No necesitan ATP.

¿COMO HACE LA BACTERIA PARA QUE SUS PROPIAS ENZIMAS NO

ATAQUEN SU DNA?

(PAPEL BIOLOGICO DEL SISTEMA METILACION-RESTRICCION O

RESTRICCION-MODIFICACION)

La existencia natural de las nucleasas de restricción en muchas bacterias ofrece

un mecanismo de defensa contra la entrada de material genético de otro

organismo, concretamente de virus bacteriófagos: se trata de los sistemas de

restricción-modificación o metilación-restricción. Para cada enzima de

restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de

restricción y une covalentemente grupos metilos a determinadas bases del DNA

en dicha secuencia. En el caso de enzimas tipo II, la metilasa es una proteína

independiente, mientras que las del tipo I y III poseen las actividades nucleasa y

metilasa en su molécula oligomerica, como subunidades que actúan

coordinadamente.

El DNA propio de la bacteria es metilado de una forma específica característica de

cada especie bacteriana. La metilación de las bases impide la unión de la enzima

de restricción, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al

entrar a la célula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrón de

metilación deferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restricción.

ACCION DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II

Son estas las reestrictasa estructuralmente mas simples y mejor estudiadas por su

utilidad en ingeniería genética, a modo de ‘tijera’ para el corte del DNA. El sitio de

restricción es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrólisis. Se hidrolizan de

forma muy especifica enlaces fosfodiester del DNA, uno en cada hebra

generándose dos fragmentos de restricción. El enlace hidrolizado es siempre el 3’-

P (son endonucleasas de tipo a) por lo que el fosfato queda unido a 5’, dejando en

ambos fragmentos extremos 3’-OH y 5’-P. la reacción no necesita ATP, lo que la

diferencia de la catalizada por las enzimas tipo I y III.

TIPOS DE CORTES DE LAS ENDONUCLEASAS

   Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:

 Cohesivos o pegajosos:

Cuando la enzima de restricción actua dejando dos extremos 5´que son

complementarios entre sí:

Estos extremos son creados por las endonucleasas tipo II, sin embargo no todas

las enzimas de restricción tipo II dejan así los extremos.

2.      Romos:

 

Diferencias entre los tipos de cortes de endonucleasas:

EcoRI BamHI HindIII

GAATTC GGATCC AAGCTT

CTTAAG CCTAGG AACGAA

SspI SmaI

AATATT CCCGGG

TTATAA GGGCCC

ENZIMASDE RESTRICCION TIPO II EMPLEADAS EN INGENIERIA GENETICA:

       APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

1.      Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

2.      Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern

Blot”.

3.      Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en

“Southern”y “Northern” blotting.

4.      Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,

creación de DNA recombinante.

  FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA ACTIVIDAD DE LAS

ENDONUCLEASAS

Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y

que pueden afectar la actividad de las mismas:

1.      Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza,

contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas

concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.

2.      Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en

lo que respecta a su estabilidad y actividad.

3.      DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .

4.      Contaminantes con carga (-).

5.      DNA contaminado con otro DNA.

6.      Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.

7.      Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es

reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej.

si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para

la enzima).

8.      Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para

trabajar en condiciones óptimas.

 

BIBLIOGRAFIA

Geo. F. Books. Ernest Jawetz MD. ¨Microbiología medica¨. 1ª Edición.

Manual Moderno. 1996. Pag. 107

Patrick R. Murray. Ken S Resenthal. ¨Microbiología Medica¨. 5ª Edición.

Elsevier Mosby. 2006. Pág. 177-178.

Basualdo Juan Ángel. ¨Microbiología Biomédica¨. Editorial Atlante. Buenos

Aires. 1996. Pag.106-107.

Lewis Benjamín. Genes. 2ª Edición. Editorial. Editorial REVERTE.

Barcelona España. 1996. 492-494.