bartonella quintana

OPTIMALISATIE EN VALIDATIE VAN

MEERDERE REAL-TIME PCRS VOOR

DE DETECTIE EN DISCRIMINATIE

VAN BARTONELLA HENSELAE EN

BARTONELLA QUINTANA

Aantal woorden: 27.941

Lisa Van Reeth Stamnummer: 01270050

Promotor: Prof. dr. A. Van Landschoot

Copromotoren: Dr. M. Reynders

Dr. sc. P. Descheemaeker

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science

in de industriële wetenschappen: biochemie

Academiejaar: 2016 - 2017

“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt

onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

“The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more

specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.”

9 juni 2017

Auteur

Lisa Van Reeth

Copromotor

Dr. sc. P. Descheemaeker

Promotor

Prof. dr. A. Van Landschoot

Copromotor

Dr. M. Reynders

Voorwoord

Vanaf het begin, toen de aard van dit onderzoek werd geschetst, werd mijn interesse in het

moleculair werk meteen opgewekt. De afgelegde weg heb ik als zeer leerrijk en boeiend

ervaren. Enkele mensen speelden een cruciale rol gedurende het volledige proces, door mij

keer op keer zowel emotioneel als mentaal bij te staan. Graag zou ik van de gelegenheid

gebruik willen maken om hen te bedanken.

In de eerste plaats dr. sc. Patrick Descheemaeker, wiens inzicht en raadgevingen dit werk tot

een goed einde hebben gebracht. Hij begeleidde mij in het AZ Sint-Jan te Brugge en ik kon

telkens op hem rekenen als ik een probleem had.

Ook dank aan mijn interne promotor prof. dr. Anita Van Landschoot voor de vele aanwijzingen

en hulp bij het vervolledigen van deze masterproef.

Hartelijk dank aan dr. Marijke Reynders die, als onuitputtelijke bron van kennis en

enthousiasme, het mogelijk maakte om dit thesisonderzoek uit te voeren. Bedankt ook aan de

mensen van het labo moleculaire diagnostiek, met name Thomas Van Landschoot, Laurien

Hoornaert, Sofie Maton, Ellen Van Neder, Charlotte Vercamer en Rani Goderis, die veel tips

gaven en geduld hadden om een nieuweling op te leiden. Iedere dag zorgden ze voor een

goede sfeer tijdens het praktisch werk en stelden ze mij op mijn gemak door hun vriendelijkheid

en behulpzaamheid.

Tot slot wil ik mijn ouders, familie en vrienden bedanken om mij te steunen tijdens het volledige

proces. Ze geloofden in mij en hadden veel geduld en begrip maar gaven mij vooral de moed

om tot het uiterste te gaan. Ze hebben elk op hun manier een steentje bijgedragen aan het

eindresultaat.

Abstract

Bartonellose wordt veroorzaakt door Bartonella species en kent een wereldwijde verspreiding.

De kattenkrabziekte of cat scratch disease is de meest voorkomende ziekte en wordt

veroorzaakt door Bartonella henselae. Het typisch humane ziektebeeld bestaat uit huidletsels

en lymfadenopathie, maar er kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen met een

waaier aan symptomen. Een ander species is Bartonella quintana die de verwekker is van de

loopgravenkoorts of trench fever. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de

ziekte. Vroegtijdige vaststelling aan de hand van serologische testen blijft voor beide species

een uitdaging.

Het doel van dit onderzoek is het ontwikkelen en valideren van een in-huis dual-target detectie-

en differentiatiemethode aan de hand van een multiplex real-time polymerase chain reaction.

Initieel worden functionaliteit en specificiteit van in silico ontwikkelde primers geëvalueerd

a.d.h.v. smeltcurveanalyse met de SYBR® Select Mastermix en vervolgens worden de

bijkomende probes geëvalueerd in een real-time PCR met de TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix. Met oog op hogere detectiesnelheid wordt de gevoeligste en meest specifieke

multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd en onderworpen aan een validatieplan. In

dit onderzoek werd geopteerd om twee duplex RT-PCRs toe te passen, nl. een generische

PCR voor de genus-specifieke Bartonella detectie op basis van het 16S rRNA gen

gecombineerd met Phocine herpesvirus-1 als interne extractie- en amplificatiecontrole en een

species-specifieke PCR voor de differentiatie tussen de twee meest voorkomende species B.

henselae en B. quintana op basis van de respectievelijke targetgenen pap31 en yopP.

Uit de validatie kon geconcludeerd worden dat een correcte staalname van uitermate groot

belang is, en het meest gevoelige staaltype voor Bartonella selectie door middel van

moleculaire techniek bleek klierbioptie of abcespunctaat te betreffen, idealiter in e-

swabmedium (Liquid Amies). Zeer etterige stalen kunnen resulteren in een iets lagere

gevoeligheid van de species-specifieke test terwijl de generische test gebaseerd op 16S rRNA

gen gevoeliger blijft. Beide duplex PCRs samen geven aldus aanleiding tot een goede

Bartonella diagnose met simultane speciesconfirmatie. Aanvullend confirmeerde 16S rRNA

sequentieanalyse de correcte speciesidentificatie.

Kernwoorden: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validatie, typering

English abstract

Bartonellosis is caused by Bartonella species and is spread worldwide. Cat scratch disease is

the most common disease and is caused by Bartonella henselae. The typical human symptoms

are skin lesions and lymphadenopathy, but atypical symptoms with clinical variation may also

occur. Another species is Bartonella quintana which is the cause of trench fever that occurs

both in an acute and chronic form. Early diagnosis with serological testing remains a challenge

for detection of both species.

The purpose of this research is to develop and validate an in-house dual-target detection and

differentiation method using a multiplex real-time polymerase chain reaction. Initially,

functionality and specificity of in silico developed primers are evaluated with the SYBR® Select

Mastermix for a melting curve analysis and subsequently the additional probes are evaluated

in a real-time PCR using the TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. To achieve higher

detection rates, the most sensitive and most specific multiplex composition for each organism

is selected and validated according to plan. In this study, two duplex RT-PCRs were used, i.e.

a generic PCR for the genus-specific Bartonella detection based on the 16S rRNA gene

combined with Phocine herpesvirus-1 as internal extraction and amplification control and a

species-specific PCR for the differentiation between the most common species B. henselae

and B. Quintana based on the respective target genes pap31 and yopP.

From the results of the validation, it could be concluded that correct sampling is of utmost

importance and the most sensitive sample type appeared to be a ganglion biopsy or punction,

preferentially in e-swab medium (Liquid Amies). Samples with a lot of pus may result in a

slightly lower sensitivity of the species-specific test while the generic assay based on 16S rRNA

gene stays more sensitive. Both duplex PCRs cause a good Bartonella diagnosis with

simultaneous species confirmation. In addition, 16S rRNA sequence analysis confirmed the

correct species identification.

Keywords: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validation, typing

8

Inhoudsopgave Inleiding ................................................................................................................................14

1. Bartonella species .........................................................................................................15

1.1. Classificatie ............................................................................................................15

2. Bartonella henselae .......................................................................................................16

2.1. Kenmerken en eigenschappen ...............................................................................16

2.2. Epidemiologie .........................................................................................................18

2.3. Humaan ziektebeeld ...............................................................................................20

2.4. Behandeling en preventie .......................................................................................23

3. Bartonella quintana .......................................................................................................24

3.1. Kernmerken en eigenschappen ..............................................................................24

3.2. Epidemiologie .........................................................................................................25

3.3. Pathogenese ..........................................................................................................26

3.4. Therapie .................................................................................................................26

4. Moleculaire diagnostiek .................................................................................................28

4.1. Polymerase chain reaction .....................................................................................28

4.2. Real-time PCR .......................................................................................................29

4.2.1. Primers en probes ...........................................................................................30

4.2.2. Principe van fluorescentie ...............................................................................31

4.2.3. Niet-specifieke labels ......................................................................................32

4.2.4. Specifiek gelabelde probes .............................................................................33

4.2.5. Fluorescentie detectie .....................................................................................35

4.2.6. Interpretatie ruwe data ....................................................................................36

4.3. Sanger sequencing ................................................................................................38

4.3.1. 16S rRNA sequenering ...................................................................................39

5. Materiaal en methoden ..................................................................................................40

5.1. AmpliRun® Bartonella DNA-controles .....................................................................40

5.2. Extractieprotocol ....................................................................................................40

5.3. Ontwikkeling van specifieke primers en probes ......................................................40

5.4. Klinische stalen ......................................................................................................42

5.5. Real-time PCR .......................................................................................................42

5.5.1. SYBR® Select Mastermix ................................................................................42

5.5.2. TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix ............................................................43

5.6. Validatiecriteria .......................................................................................................46

5.6.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................46

5.6.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................46

9

5.6.3. Juistheid ..........................................................................................................46

5.6.4. Interferentiestudie ...........................................................................................47

5.6.5. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................48


5.7.1. PCR-amplificatie .............................................................................................49

5.7.2. Agarosegelelektroforese .................................................................................50

5.7.3. DNA-sequentiebepaling ..................................................................................51

6. Resultaten en bespreking ..............................................................................................53

6.1. Selectie primers en probes .....................................................................................53

6.1.1. Bartonella spp. ................................................................................................53

6.1.2. Bartonella quintana .........................................................................................53

6.1.3. Bartonella henselae.........................................................................................53

6.2. Optimalisatie primers en probes aan de hand van uniplex PCR .............................53

6.2.1. Functionaliteit primers .....................................................................................53

6.2.2. PCR-efficiëntie ................................................................................................55

6.2.3. Smeltcurveanalyse ..........................................................................................57

6.2.4. Specificiteitscontrole........................................................................................58

6.2.5. Functionaliteit probe ........................................................................................59

6.2.6. Specificiteit probe ............................................................................................61

6.2.7. Primer/probeselectie .......................................................................................62

6.3. Multiplex PCR ........................................................................................................63

6.3.1. Efficiëntievergelijking .......................................................................................63

6.4. Validatie duplex PT-PCR ........................................................................................64

6.4.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................64

6.4.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................65

6.4.3. Juistheid ..........................................................................................................67

6.4.4. Klinische stalen ...............................................................................................68

6.4.5. Specificiteit ......................................................................................................69

6.4.6. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................70


6.5.1. Identificatie m.b.v. 16S rRNA sequenering ......................................................71

Algemeen besluit ..................................................................................................................73

Bibliografische lijst ................................................................................................................75

Bijlagen ................................................................................................................................81

10

Lijst met afkortingen

A Adenine

BHQ Black-hole quencher

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Bp Basenparen

C Cytosine

CCD Charge-coupled device

CT Threshold cycle

DNA Desoxyribonucleïnezuur

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

dsDNA Dubbelstrengig DNA (double-stranded DNA)

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

FRET Fluorescence resonance energy transfer

G Guanine

Hbp Hemin-bindende proteïnen

IFA Immunofluorescence assay

IgG Immunoglobuline G

IgM Immunoglobuline M

MGB Minor groove binder

NCBI National Center for Biotechnology Information

NFQ Nonfluorescent quencher

PCR Polymerase chain reaction

PhHV-1 Phocine herpesvirus-1

QCMD Quality Control for Molecular Diagnostics

qPCR Quantitative polymerase chain reaction

RBC Rode bloedcel

RFU Relatieve fluorescentie-eenheid

Rn Normalized reporter

RNA Ribonucleïnezuur

Rnase Ribonuclease

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

SHV Seal Herpesvirus

ssDNA Enkelstrengig DNA (single-stranded DNA)

T Thymine

Tm Smelttemperatuur (melting temperature)

UNG Uracil N-glycosylase

ΔG Gibbsvrije energie

11

Lijst met figuren

Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species.

Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer.

Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat.

Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens.

Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door

B. henselae bepaalt met (a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno

Sorbent Assay (ELISA) (n=44).

Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120).

Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction.

Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b).

Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).

Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken.

Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes.

Figuur 12: Werking TaqMan® probe.

Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera.

Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen.

Figuur 15: Voorstelling dNTPs en ddNTPs.

Figuur 16: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix uitgevoerd op

het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

Figuur 17: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix

uitgevoerd op het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

Figuur 18: Schematisch overzicht van de stappen die werden gevolgd volgens de reeds

beschreven SOP om het 774 bp fragment van het 16S rRNA gen van stalen te sequeneren en

het betrokken micro-organisme te identificeren.

Figuur 19: Amplificatie plot van alle primerparen na toepassing van SYBR® Select Mastermix

op Vircell AmpliRun® Bartonella quintana.

Figuur 20: Amplificatie plot van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix

op zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.

Figuur 21: Smeltcurve van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op

zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.

Figuur 22: Verschil tussen de amplificatie plot van 16S rRNA gene op mix 1 en 3 en positieve

Vircellcontrole.

Figuur 23: Multicomponent plot van de target 16S rRNA gene op de positieve Vircellcontrole,

negatieve controle en bacteriële mix 1-3.

Figuur 24: Verschil tussen de amplificatie plot en de multicomponent plot van beide duplex RT-

PCRs voor adenovirus en positieve controle Bartonella-plasmide (105).

Figuur 25: Controle PCR-amplificatie via agarosegelelektroforese.

Figuur 26: Het voorvallen van een dNTP-piek, grote roze piek, tijdens het sequeneren.

Figuur 27: Resultaat deel van het piekenpatroon van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae

DNA-controle na uitvoering op het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar).

12

Lijst met tabellen

Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving

van hun werking.

Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae.

Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers.

Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes.

Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR.

Tabel 6: AmpliRun® Bartonella DNA-controles aangeschaft via de firma Vircell.

Tabel 7: Geselecteerde primers en probes specifiek voor de verschillende targetorganismen.

Tabel 8: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix.

Tabel 9: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix.

Tabel 10: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met 16S rRNA gene en SHV

met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.

Tabel 11: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met yopP met pap31 met

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.

Tabel 12: Schema voor de verdunning van de mix gemaakt uit verschillende klinische stalen

positief voor B. henselae.

Tabel 13: De verschillende virussen en bacteriën die getest zijn om interferentie met de nieuwe

methode te onderzoeken.

Tabel 14: Overzicht timemanagement bewaarcondities voor validatie.

Tabel 15: Samenstelling van de AmpliTaq Gold PCR-mix voor één PCR-amplificatiereactie.

Tabel 16: Runprotocol om PCR-amplificatie uit te voeren met AmpliTaq Gold DNA polymerase.

Tabel 17: Runprotocol voor ExoSAP-IT voor de opzuivering van de PCR-producten.

Tabel 18: Samenstelling mastermix voor één sequentiereactie.

Tabel 19: Programma thermocycler voor de DNA-sequentiereactie.

Tabel 20: Efficiëntie van ieder primerpaar voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-

controle.

Tabel 21: CT-waarden en efficiëntie van de overgebleven primerparen, één voor ieder

organisme, op het Bartonella-plasmide.

Tabel 22: Efficiëntie van ieder primers/probe voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-

controle.

Tabel 23: Gemiddelde CT-waarden en efficiëntie van de primers/probe, één voor ieder

organisme, op het Bartonella-plasmide.

Tabel 24: Efficiëntie van zowel de duplex RT-PCRs als de primers/probe, één voor ieder

organisme uitgevoerd met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op het Bartonella-plasmide.

Tabel 25: Grove bepaling LOD.

Tabel 26: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald a. d. h. v. de variatiecoëfficiënt

(%CV).

Tabel 27: Overzicht BLAST-analyse van de finale sequentie van de stalen en positieve

controle.

13

Tabel 28: Overzicht klinische monsters en DNA-extracten AZ Sint-Lucas (Gent) als

referentiemateriaal met het resultaat van zowel AZ Sint-Lucas (Gent) als de nieuwe methode

met de beide duplex RT-PCRs van AZ Sint-Jan te Brugge.

Tabel 29: Overzicht klinische stalen AZ Sint-Jan (Brugge) met klinische vaststelling en

respectievelijke conclusie van de beide duplex RT-PCRs.

Tabel 30: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op beide

Vircell AmpliRun® DNA-controle in tweevoud.

Tabel 31: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de

verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.

Tabel 32: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de

verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle.

Tabel 33: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select

Mastermix op bacteriële mixen.

Tabel 34: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.

Tabel 35: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle

en tweemaal op negatieve controle.

Tabel 36: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast

Virus 1-Step Mastermix op bacteriële mixen.

Tabel 37: CT-waarden voor de efficiëntieberekening van de duplex RT-PCRs.

Tabel 38: Ruwe data (CT-waarden) van de beide duplex RT-PCR voor de bepaling van

herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid.

Tabel 39: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute

waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische

matrixen op de generische RT-PCR.

Tabel 40: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute

waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische

matrixen op de species-specifieke RT-PCR.

Tabel 41: Ruwe data (CT-waarden) specificiteitscontrole van de beide duplex RT-PCRs met

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op organismen aanwezig in klinische stalen en de

bacteriële mixen.

Tabel 42: Verder onderzoek voor de interferentiestudie op de bacteriële mixen, de bacteriële

culturen apart en het Human herpesvirus 6 (HHV-6).

Tabel 43: Resultaten CT-waarden onderzoek van de meest voorkomende bewaarcondities van

de staalflow binnen het AZ Sint-Jan te Brugge.

14

Inleiding

Bartonellose is een infectieziekte veroorzaakt door bacteriën van het geslacht Bartonella. De

bacterie kent een wereldwijde verspreiding en omvat een groot aantal species. Ze zijn elk op

zich, al dan niet accidenteel, veroorzakers van verschillende symptomen en ziektes bij zowel

mens als andere gastheren. De kattenkrabziekte, trench fever, de ziekte van Carrión,

endocarditis en lymfadenopathie zijn enkele voorbeelden van zo’n ziektes. Bartonella spp. zijn

facultatief intracellulaire bacteriën waarbij langdurige bacteriemie in hun reservoirgastheer

veelal het geval is. De bacteriële transmissie verloopt via een vector. Bij Bartonella spp. nemen

bloedzuigende insecten de rol van deze transmissie op zich (Jacomo et al., 2002; Müller et al.,

2016; Simard, 2015).

De kattenkrabziekte of cat scratch disease is veruit de meest voorkomende humane ziekte

gelinkt aan Bartonella, specifiek veroorzaakt door Bartonella henselae. Hoofdzakelijk worden

katten aangeduid als het reservoir voor de bacterie, zonder enige klinische en pathologische

aspecten te vertonen. Ook honden en hun vlooien, de kattenvlo, teken en andere

geleedpotigen kunnen een rol spelen in de epidemiologie. Huidletsels ter hoogte van de

handen en opzwellen van klieren zijn typische symptomen die gepaard gaan met de ziekte. Er

kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen die sterkt variëren op klinisch vlak (Chomel

et al., 2006).

Bartonella quintana is een ander species van het overkoepelend geslacht Bartonella en is de

verwekker van de loopgravenkoorts of trench fever. Tot nog toe is enkel de mens aangeduid

als reservoir/gastheer voor deze bacterie. De lichaamsluis is aangewezen als vector voor de

transmissie van mens op mens. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de ziekte,

elk met hun pathofysiologie (Rolain et al., 2004).

Vroegtijdig vaststellen van de ziekte blijft een uitdaging, maar door de ontwikkeling van

moleculaire detectiemethoden wordt de diagnose vergemakkelijkt. In het kader van deze

thesis werden moleculaire detectiemethodes voor de opsporing van B. henselae en B.

quintana gevalideerd en uitvoerig besproken. Het doel van het onderzoek is het ontwikkelen

van een brede en gevoelige in-huis methode voor het opsporen van Bartonella henselae en

Bartonella quintana in verschillende matrices.

De primers worden als eerste geoptimaliseerd met de SYBR® Select Mastermix. Daarna

worden de probes geoptimaliseerd en mogelijke samenstellingen uitgeprobeerd met de

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. Uit deze resultaten zal de gevoeligste

multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd worden. Tot slot wordt een

speciesconfirmatie van de bacterie uitgevoerd aan de hand van 16S rRNA sequenering.

Deze scriptie omvat verschillende hoofdstukken. Als eerste worden Bartonella spp., B.

henselae en B. quintana aangehaald waarbij een korte achtergrond wordt geschetst. Ook de

moleculaire methoden gehanteerd tijdens het praktisch werk worden nader toegelicht. In een

volgend hoofdstuk worden de gebuikte materialen en de gevolgde methoden behandeld.

Hierna volgen de resultaten van de optimalisatie, validatie en typering. Tot slot kan een

algemeen besluit gevormd worden betreffende de nieuw ontwikkelde methode.

15

1. Bartonella species

In volgend citaat van Robert Koch (1878) wordt vermeld dat er in normaal steriele sites geen

bacteriën gedetecteerd kunnen worden in gezonde personen of dieren. “I have, on many

occasions, examined normal blood and normal tissues using methods that ensure that such

organisms are not overlooked, and I have never, in a single instance, found bacteria. I therefore

conclude that bacteria do not occur in the blood or tissues of healthy animals or humans”.

Bartonella blijkt echter een uitzondering te zijn op deze regel. Er werden gevallen

waargenomen in zowel mensen als dieren zonder enige klinische symptomen waarbij

Bartonella toch aanwezig was. Voorbeelden zijn stammen van B. henselae en B. quintana die

in erythrocyten van respectievelijk katten en mensen werden teruggevonden (Jacomo et al.,

2002).

Bartonella species worden wereldwijd verspreid gevonden en sommigen van hen worden

gezien als opkomende en verontrustende (“emerging”) ziekteverwekkers. Mensen worden

grotendeels accidenteel besmet aangezien de bacterie vooral in reservoirgastheren zoals

honden en katten wordt teruggevonden. Dit zijn huisdieren die dicht bij de mens staan maar

die vaak zelf geen symptomen vertonen. Dit is een unieke eigenschap van Bartonella. De

bacteriën gebruiken een groot aantal zoogdieren als reservoirgastheren en diverse

geleedpotigen, zoals vlooien, luizen, mijten en teken, als vectoren (Jacomo et al., 2002; Müller

et al., 2016).

1.1. Classificatie

Alle Bartonella species zijn aeroob, Gramnegatief, facultatief intracellulair, staafvormige

bacteriën die zowel ziektes bij mens als dier veroorzaken. Ze behoren tot de klasse van de

alphaproteobacteria onder de orde Rhizobiales en tot de familie Bartonellaceae. Momenteel

zijn 31 soorten Bartonella beschreven waarvan ten minste 13 pathogeen zijn voor mensen

(Kaiser et al., 2011).

Figuur 1 geeft de fylogenese weer van de belangrijkste Bartonella spp. (Simard, 2015). Alle

species zijn nauw verwant met meer dan 98% homologe sequenties in het 16S rRNA en leiden

doorgaans tot aanhoudende en terugkerende bacteriemie (Jacomo et al., 2002). Hoofdzakelijk

zijn zoogdieren de reservoirgastheren en kan transmissie plaatsvinden door bloedzuigende

geleedpotigen. Incidentele besmetting kan door contact met de besmette geleedpotige, hun

uitwerpselen of met het besmette dier zelf. De twee meest prominente soorten in Europa zijn

Bartonella henselae, verwekker van de kattenkrabziekte, en Bartonella quintana, gekend voor

de loopgravenkoorts of 5-dagenkoorts (Müller et al., 2016). Daarom zullen deze twee species

uitvoerig besproken worden.

16

Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species. Deze fylogenetische boom,

volgens Engel et al. (2011), is gebaseerd op de sequentie van 478 genoomgenen en vier house-keeping genes nl., rpoB, gltA,

ribC en groEL (aangepast uit Pulliainen & Dehio, 2012).

2. Bartonella henselae

Bartonella henselae is wereldwijd gekend als de verwekker van cat scratch disease of

kattenkrabziekte. In 1950 werd in Frankrijk de ziekte voor het eerst beschreven door Debré en

zijn collega’s maar pas in 1992 werd de bacterie, toen nog Rochalimaea henselae genoemd,

serologisch gelinkt aan de kattenkrabziekte. In dat jaar isoleerden Regnery et al. (1992) tot

tweemaal toe B. henselae uit het bloed van klinisch gezonde katten. Hierdoor werd snel een

link gelegd tussen het voorkomen van de ziekte en de kat als hoofdreservoir. Bij het toepassen

van immunofluorescence assay (IFA) werden door Regnery en zijn team antilichamen tegen

B. henselae gevonden in 88% van vermoedelijk geïnfecteerde patiënten. In 1993 isoleerden

Dolan et al. de verwekker van de ziekte uit de lymfeklieren van een patiënt (Chomel et al.,

2006; Margileth, 2000).

2.1. Kenmerken en eigenschappen

Pas in 1983 werd de bacterie voor het eerst microscopisch aangetoond. B. henselae behoort

tot de alphaproteobacteria en is een aerobe, oxidase-negatieve, traag groeiende, licht

gebogen, Gramnegatieve staaf. De gemiddelde lengte is 2 µm en 0,5-0,6 µm in breedte. De

bacterie beschikt niet over flagellen om zich voort te bewegen maar beschikt over pili die

bewegelijkheid verschaffen en aanhechting aan doelwitcellen mogelijk maken (Müller et al.,

2016). B. henselae heeft een onvolledige glycolyse waardoor glucose niet gebruikt kan worden

als energiebron. Ter compensatie worden aminozuren afgebroken om energie te verkrijgen

met verbruik van zuurstof en vorming van koolstofdioxide (Chenoweth et al., 2004). Het

17

kweken van de bacterie is niet eenvoudig ten gevolge van de traag groeiende eigenschap. Dit

bemoeilijkt het onderzoek (Margileth, 2000).

Binnen het species B. henselae worden minstens twee genotypen geïdentificeerd nl., Houston

1 en Marseille, elk dominant in een verschillende kattenpopulatie. Het eerste type wordt vooral

teruggevonden in Azië, vooral in Japan en de Filipijnen. Het voorkomen van het tweede type

is in Australië, het westen van de Verenigde Staten en West-Europa. Echter het

overheersende type kan ook variëren binnen eenzelfde kattenpopulatie. Zo zijn in Australië en

West-Europa het Marseille type dominant maar wordt ook het andere type frequent

gerapporteerd als oorzaak van kattenkrabziekte. Er wordt gesuggereerd dat stammen van het

type Houston 1 virulenter zijn voor de mens dan het Marseille type (Chomel et al., 2006). Van

Houston 1 zijn er twee stammen gedeponeerd in de ATTC-bank namelijk B. henselae Houston

1 ATCC 49882 en gemodificeerde Bartonella adhesine A-negatieve stam B. henselae Houston

1 ATCC 49882. Het Marseille genotype heeft enkel de referentiestam URLLY8 verkregen bij

het Instituut voor Medische Microbiologie en Infectiecontrole (Müller et al., 2016).

B. henselae scheidt verschillende virulentiefactoren af (Tabel 1) waardoor de bacterie

ziekteverwekkend wordt voor de mens. Deze helpen ook mee om te ontsnappen aan het

immuunsysteem van de gastheer. Anderzijds wordt de bacterie voorzien van nutriënten via de

gastheer. B. henselae beschikt over mechanismen om die bepaalde voedingsstoffen te

verkrijgen en zo zijn metabolisme in stand te houden (Pulliainen & Dehio, 2012).

Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving van hun werking (Kaiser et

al., 2011; Pulliainen & Dehio, 2012; Simard, 2015).

Virulentiefactor Betekenis Omschrijving

BadA Bartonella adhesine

A

Onderdeel van de trimerische

autotransporter adhesines (TAA). Centrale

functie is adhesie aan gastheercellen.

Veroorzaken auto-aggregatie, binding aan

extracellulaire matrix en celoppervlak.

BepA-G Bartonella

effectorproteïne

BepC, BepF en BepG reorganiseren het

actinenetwerk waardoor de bacterie in

endotheelcel wordt opgenomen. BepA

inhibeert apoptose van endotheelcel.

Deformine Deformatiefactor Hydrofobe molecule betrokken bij de

invasie van RBC door het induceren van

kanalen in het membraan van RBC.

HbpB-E Hemine-bindende

proteïne B-E

Rol bij ijzerwinning.

IalA/ialB Invasiegeassocieerde

locusproteïne A en B

Buitenste membraancomponent betrokken

bij invasie van RBC. IalA is een nucleoside

fosfaathydrolase.

18

LPS Lipopolysaccharide Essentieel buitenste membraancomponent

met zeer lage endotoxiciteit. Zwakke

herkenning door toll-like receptor 4 (TLR4).

OMP43 Buitenste

membraanproteïne

Staat in voor de binding aan

endotheelcellen.

Pap31 Fibronectine-

bindende adhesine

Bindt BadA aan fibronectine en staat in

voor de ijzerwinning. Ook hemine-bindende

proteïne A (hbpA) genoemd.

Trw-T4SS complex Type IV

secretiesysteem

(T4SS)

Draagt bij tot de binding aan RBC en

endotheelcellen.

VirB/D4 T4SS Type IV

secretiesysteem

Zorgt voor de opname van de bacterie in

de endotheelcellen en remming van

apoptose van de endotheelcellen.

2.2. Epidemiologie

Kattenkrabziekte, ook al doet de naam anders vermoeden, wordt niet enkel door katten en

katachtigen veroorzaakt. Er zijn gevallen waarbij honden, en zeer zelden ook konijnen of

andere knaagdieren de bacteriële infectie overbrengen op de mens. DNA van B. henselae

werd gedetecteerd in enkele zieke honden die klinische abnormaliteiten vertoonden. Meestal

worden honden accidenteel besmet met B. henselae waardoor ze ook een infectiebron voor

mensen kunnen zijn (Chomel et al., 2006; Kaiser et al., 2011). Er wordt gesuggereerd dat de

bacterie ook via teken overgedragen kan worden aangezien het DNA van B. henselae

gedetecteerd werd tijdens het onderzoeken van teken uit Noord-Amerika, Oost- en Centraal-

Europa (Kaiser et al., 2011).

Besmetting met B. henselae gebeurt doorgaans door een intra- of subcutane inoculatie van

vlooienfaeces via kattenklauwen. Daarna zal een lag-fase plaatsvinden waar de bacterie zich

aanpast aan de gastheer en zich vermenigvuldigt. Enkele dagen na de infectie zal de bacterie

zich vanuit de primaire niche naar de bloedbaan verspreiden. De tijdspanne van verspreiding

kan een verklaring bieden aan het laat detecteren van de bacterie in het bloed. Kenmerkend

is een sterke stijging van het aantal bacteriën in de rode bloedcel na enkele dagen. Het

precieze migratieverloop is nog niet volledig onderzocht maar zou bestaan uit drie stappen nl.,

adhesie, invasie en intravacuolaire vermenigvuldiging (Figuur 2). Het prolifereren binnen de

rode bloedcel zal een plateau bereiken waarna de rode bloedcel afsterft. Tijdens een

bloedmaal kan de vector besmet raken en vervolgend een andere reservoirgastheer infecteren

(Simard, 2015).

19

Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer. Na de eerste inoculatie door vlooienfaeces via krassen

van een kattenklauw in de huid, verblijft de bacterie in een tot nog toe raadselachtige primaire niche. Deze toestand vertaalt zich

in de lag fase (lag phase). Na enkele dagen is een snelle stijging van het aantal bacteriën in de bloedbaan vast te stellen (1).

Hierbij vindt er adhesie plaats van de bacterie aan RBC gevolgd door invasie of binnendringen in RBC. De bacterie vermeerdert

in de RBC tot een stationair aantal wordt bekomen. Dit herhaalt zich verschillende malen (2-4) tot het moment dat een specifieke

antilichaamrespons de invasie in RBC blokkeert en zo ook de infectie tegenwerkt. Na een slapende fase van enkele weken tot

maanden (dormant phase) is het mogelijk dat de bacterie zich opnieuw manifesteert met een nieuwe bacteriële piek als resultaat

(5). Vermoedelijk komt dit door een klonale expansie van antigeen en/of fasevarianten die in de bloedbaan aanwezig zijn onder

de vorm van de primaire niche. Tijdens het verloop is transmissie van de ene naar de andere gastheer mogelijk via bloedzuigende

geleedpotigen, voornamelijk vlooien (Pulliainen & Dehio, 2012).

De kat wordt gezien als het hoofdreservoir voor B. henselae en is de belangrijkste verwekker

van het ziektebeeld bij de mens. De kat zelf ondervindt geen last van de bacterie die zich heeft

aangepast zodat ze kan overleven in de gastheer, en aldaar kolonisatie geeft. Door dit

commensalisme zal de langdurige bacteriële infectie niet merkbaar zijn bij de geïnfecteerde

kat. Doorgaans zijn katten slechts een week tot een maand besmettelijk maar volgens Chomel

et al. (2006) zijn er gevallen gerapporteerd waarbij een periode van langer dan één jaar wordt

aangehaald. Vaak speelt de leeftijd van de kat een rol in het risico op besmetting (Margileth,

2000). Een infectie oplopen door een krab of beet van jonge katten, jonger dan één jaar, is

meer waarschijnlijk dan door oudere katten (Figuur 3). In Nederland bijvoorbeeld wordt de helft

van de katten, meestal in de eerst 6 levensmaanden, besmet met de bacterie (Bergmans et

al., 1997). Ook de levenswijze van de kat is een aspect waar rekening mee moet gehouden

worden. Straatkatten zijn vaak een grotere bron van infectie dan huiskatten. Aangezien de

eerste groep geen adequate verzorging krijgt is de kans op het hebben van vlooien groter en

dus ook de kans op besmetting met B. henselae (Chomel et al., 2006). De bacteriële infectie

kan niet overgedragen worden door geslachtsgemeenschap noch verticaal door

zwangerschap. Andere katachtigen zoals cheeta, poema, panter en leeuw, testten positief

voor B. henselae (Jacomo et al., 2002).

20

Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat (Azzag et al., 2012). Er is een

duidelijk verband tussen de leeftijd van de kat en de kans op besmetting. Katten jonger dan één jaar dragen meer bij tot

bacteriemie dan oudere katten. Als de kat de leeftijd van 36 maanden en ouder heeft bereikt, is er geen spoor meer van B.

henselae. M.a.w. hoe jonger de kat, hoe groter de kans op een bacteriële infectie met B. henselae. Er is nooit een verband

gevonden tussen de aanwezigheid van de bacterie in de kat en het geslacht of fysiologische status van de kat.

B. henselae wordt onderling tussen katten overgedragen door een vector nl., de kattenvlo

(Ctenocephalides felis). Vermoedelijk wordt een huidwonde van de kat met besmette

vlooienfaeces geïnfecteerd. Deze kat kan door middel van een kattenklauw de bacterie

overdragen naar de mens en bartonellose bewerkstelligen. Ook kan rechtstreeks contact van

bloed van de gastheer met die van de vlo een mogelijke infectiemanier zijn. Een intra- of

subcutane inoculatie door een bloedzuigende vector wordt soms beschouwd als een

natuurlijke transmissieweg. B. henselae kan aanwezig zijn in de speekselklieren van C. felis

die tijdens een bloedmaal een infectie in de hand werkt, maar werd nog niet aangetoond.

Contaminatie van de op dat moment aanwezige huidwonde met vlooienfaeces is eerder te

begrijpen (Simard, 2015). Het direct overdragen van de ziekte via de vlo op de mens via

vlooienbeten is nooit experimenteel aangetoond en wordt vooral hypothetisch gestaafd

(Chomel et al., 2006).

In tegenstelling tot de kat, ondervindt de hond als gastheer een waaier aan klinische en

pathologische aspecten. De symptomen zijn te vergelijken met het menselijke ziektebeeld

voornamelijk, granulomateuze hepatitis, peliosis hepatitis van de lever en epistaxis

(neusbloeding) (Chomel et al., 2006).

Teken voeden zich met het bloed van mens en dier waardoor bacteriële besmetting kan

optreden. Dietrich et al. (2010) toonden aan dat in vier regio’s van Europa het DNA van B.

henselae in 40% van de tekenpopulatie aanwezig was. De link tussen een tekenbeet en het

optreden van de bacteriële infectie in mens en dier werd snel gelegd (Kaiser et al., 2011).

2.3. Humaan ziektebeeld

Meest voorkomend bij kattenkrabziekte is het ontstaan van een gering aantal rode papels 3

tot 10 dagen na de besmetting met B. henselae. Deze huidknobbeltjes kunnen overgaan in

vesikels die binnen 3 weken tot enkele maanden volledig verdwijnen zonder littekenweefsel.

21

Ze komen dikwijls voor op de handen aangezien de kattenkrab/-beet meestal op die plaats

gebeurt. Typerend is lymfadenopathie gekenmerkt door een nabije lymfeklierzwelling die

doorgaans 1 tot 3 weken na de inoculatie optreedt (Figuur 4). De klieren zijn meestal pijnloos

en 1 tot 5 cm groot. Soms kan de zwelling oplopen tot een grootte van 12 cm gepaard met

ettervorming. De locatie is meestal beperkt tot één regio nl., de plaats van besmetting. In het

algemeen verdwijnt de lymfadenitis binnen de 1 tot 4 maanden, uitzonderingen zijn gevallen

van 1 tot 3 jaar (Florin et al., 2008; Vermeulen et al., 2009).

Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens (Centers for Disease Control and Prevention, 2014).

Voornamelijk de handen komen in contact met de kat, de plaats waar de meeste huidknobbels worden vastgesteld. In een verder

stadium is lymfadenopathie of lymfeklierzwelling zeer typerend voor de ziekte en dit is een broeiplaats van B. henselae.

Atypische manifestaties worden bij circa 10% van de patiënten vastgesteld. De bacterie heeft

zich verspreid naar andere delen van het lichaam, vooral naar het orgaansysteem. In het

bijzonder worden de lever, de milt, het oog en centraal zenuwstelsel aangetast. Enkele

afwijkende symptomen staan opgelijst in Tabel 2. Na afweging van zowel klinische

bevindingen als een voorgeschiedenis met kattencontact, uitvoeren van specifieke

serologische testen, al dan niet aangevuld met PCR, kan een diagnose gesteld worden.

Mensen met zowel typische als atypische symptomen dienen niet in quarantaine gebracht te

worden aangezien de ziekte niet overdraagbaar is van mens op mens.

22

Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae (Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).

Symptoom

aanhoudende koorts van onbekende oorsprong

bacillaire angiomatosis (huidnodules)

peliosis hepatis (met bloed gevulde holtes in de lever)

granulomateuze hepatitis

hepatosplenomegalie (lever- en miltvergroting)

uveitis (inwendige oogontsteking)

neuroretinitis (ontsteking oogzenuw)

erytheem (roodheid)

glomerulonefritis (nierfilterontsteking)

endocarditis (ontsteking hartkleppen)

pneumonie (longontsteking)

hemolytische anemie

artritis of artralgie (ontsteking of pijnlijke gewrichten)

osteomyelitis (infectie van bot of beenmerg)

Het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae is afhankelijk van de onderliggende

immuunstatus van de gastheer. Deze status kan onderverdeeld worden in twee groepen nl.,

immunocompetente en immuungecompromitteerde patiënten.

In de eerste groep is de gastheer in staat om antistoffen aan te maken tegen de bacterie. De

infectie wordt dan meestal beperkt tot de huid en het goedaardig zwellen van de lymfeklieren,

lymfadenopathie genaamd. De huidzwelling (al dan niet met etter) ontwikkelt zich 3 tot 10

dagen na de aanvaring met de kat. Het opzetten van de lymfeklieren kan 1 tot 3 weken later

zichtbaar zijn en kan enkele weken tot maanden aanhouden. Frequent voorkomende

symptomen zijn verhoogde temperatuur, pijn, vermoeidheid en een onwel gevoel (Chomel et

al., 2006). Serologie toont aan dat er productie van IgM en IgG optreedt als respons op de

infectie met B. henselae (Figuur 5). Eerst wordt IgM geproduceerd dat gewoonlijk binnen 100

dagen verdwijnt. IgG zal iets later een stijging tonen maar kan tot 2 jaar of langer meetbaar

blijven. Zo blijkt dat B. henselae een levenslange immuniteit kan teweegbrengen (Vermeulen

et al., 2009).

23

Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae bepaalt met

(a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (n=44). De datum van de eerste

klinische symptomen van 41 patiënten (44 sera) is gekend zodat de duur van het ziektebeeld opgevolgd kan worden. Ondanks

de kleine aantallen kan er een bepaald patroon in serologische positiviteit opgesteld worden. Bij IFA neem de IgM af na 8 weken

terwijl voor IgG er een piek werd vastgesteld op 6-8 weken. Dit patroon is niet terug te vinden bij ELISA voornamelijk te wijten aan

de lage gevoeligheid voor IgG (Vermeulen et al., 2007).

Bij immuungecompromitteerde patiënten heeft de gastheer een verzwakt immuunsysteem met

een grotere kans op infecties met vaak een ernstiger verloop. De bacteriële infectie beperkt

zich niet enkel tot de huid en lymfeklieren maar ook atypische symptomen kunnen zich

voordoen (Tabel 2). B. henselae is de oorzaak van langdurige koorts en/of aanhoudende

bacteriemie en systemische infectie met aantasting van diverse orgaansystemen vindt plaats

(Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).

2.4. Behandeling en preventie

Bij patiënten met de klassieke knobbelvorming of lymfadenitis verdwijnen de symptomen

gewoonlijk zonder behandeling. Er werden verscheidene studies uitgevoerd om antibiotica als

therapie toe te passen en het effect te bestuderen. De meeste studies concludeerden dat B.

henselae niet adequaat reageert op de antibiotica maar enkelen gaven toch in vivo een effect

weer. Margileth (1992) testte de duur van de symptomen bij 268 patiënten met

kattenkrabziekte. De gemiddelde duur bij met antibiotica behandelde en niet behandelde

patiënten is respectievelijk 2,8 weken en 14,5 weken, dus toch significant verschillend. Tijdens

de studie werden verschillende antibiotica onderzocht waaruit rifampicine, ciprofloxacine,

gentamicine en trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMX) effectief bleken te werken tegen de

kattenkrabziekte met een range van 58% tot 87%. De niet behandelde patiënten werden in

iedere studie een placebo toegediend om een vergelijking te kunnen uitvoeren met de

behandelde patiënten. Een andere studie (Arisoy et al., 1999) toonde het verschil aan tussen

het gebruik van rifampicine, eventueel in combinatie met andere antibiotica, en gentamicine of

TMP-SMX. Bij de eerste groep van patiënten werd na 1 tot 5 dagen na de inname verbetering

van het ziektebeeld vastgesteld. Bij de tweede groep, met gentamicine of TMP-SMX, werd de

verbetering na 3 tot 4 dagen opgemerkt. Opmerkelijk is dat de aanbevolen behandeling met

azithromycine in één enkele studie (Rolain et al., 2004) wordt geëvalueerd als zijnde een

goede therapie. Er kan gesteld worden dat de keuze van de juiste (combinatie van) antibiotica

voor de behandeling van B. henselae voor ieder individu verschillend is, wat het vaak voor de

behandelende clinicus erg moeilijk maakt, naast het feit dat het geduld op de proef wordt

24

gesteld alvorens opklaring van de symptomen. Vaak reageren immuungecompromitteerde

patiënten onverwacht zeer goed op de antibiotica in vergelijking met de immunocompetente

mensen (Florin et al., 2008; Prutsky et al., 2013).

Het onder controle houden van vlooien op zowel katten als honden is een goede preventie

tegen kattenkrabziekte. Het verwijderen van de klauwen of regelmatig knippen van nagels van

jonge katten wordt ook voorgesteld. Andere mogelijke maatregelen zijn katten niet buiten laten,

vlooiencontrole, wassen van handen na contact met katten voornamelijk kittens, correcte

handeling van de kattenbak en na beten of krabben de wonde schoonmaken met water en

zeep (Margileth, 2000).

3. Bartonella quintana

Bartonella quintana is algemeen gekend als de verwekker van de loopgravenkoorts of trench

fever. Naast deze acute vorm van infectie met B. quintana bestaat ook een tweede, chronische

vorm die gedetecteerd werd bij immunocompetente personen. Tot nog toe is de mens het

enige reservoir voor de bacterie en de lichaamsluis, Pediculus humanus corporis, zorgt voor

het overdragen van patiënt op patiënt (Rolain et al., 2004).

DNA van B. quintana werd gedetecteerd in de pulpa van een 4000 jaar oude man (Drancourt

et al., 2005). In Litouwen identificeerden Raoult et al. (2006) het DNA van de bacterie in luizen

gevonden in graven van soldaten van Napoleon. Hierdoor werd gesuggereerd dat vele

soldaten geïnfecteerd waren met B. quintana. De naam van de acute vorm van de ziekte,

namelijk loopgravenkoorts, kwam er toen tijdens de Eerste Wereldoorlog zowel geallieerden

als Duitse troepen getroffen waren door de ziekte. Tijdens de twee wereldoorlogen, met name

in Rusland en op de Oost-, Midden- en West-Europese fronten, wordt geschat dat wereldwijd

enkele miljoenen mensen leden aan de ziekte. Na Wereldoorlog II namen incidenten van de

loopgravenkoorts steeds meer af. Tot in 1990 de ziekte terug de kop kwam opsteken vooral

bij dakloze mensen in ontwikkelde landen, die geconfronteerd worden met extreme armoede,

gebrek aan hygiëne én extreem lage temperaturen. De ziekte werd één van de belangrijkste

opduikende infectieziekten van de vroege jaren ’90 (Badiaga & Brouqui, 2012).

3.1. Kernmerken en eigenschappen

Bartonella quintana behoort, zoals B. henselae, tot de alphaproteobacteria en werd vroeger

Rochalimaea quintana genoemd. Het is een facultatief, intracellulaire, Gramnegatieve bacillus

die 0,3 tot 0,5 µm breed is en 1 tot 1,7 µm lang. Zowel katalase als oxidase is negatief

gebleken. De bacterie beschikt niet over flagellen maar wel over fimbria. Deze zijn korter en

dunner dan flagellen en zorgen voor de aanhechting aan andere bacteriën en aan dierlijke

cellen. Ze zijn enkel zichtbaar met een elektronenmicroscoop en kunnen recht of gebogen zijn.

Er zijn pili aanwezig die typerende spiertrekkingen veroorzaken voor de voortbeweging en die

zelf-aggregatie verwezenlijken. De bacterie haalt energie uit succinaat, pyruvaat en glutamaat

maar is niet in staat om glucose als energiebron te gebruikten. Net als B. henselae is B.

quintana een traag groeiende bacterie met bijgevolg moeizaam kweekbare kolonies. Slechts

12 tot 14 dagen na enten kunnen primaire isolaties gevonden worden en pas na een

25

incubatieperiode van 45 dagen kunnen isolaten verder gebruikt worden voor verscheidene

technieken. Daarom wordt het kweken van de bacterie niet routinematig toegepast waardoor

verder onderzoek bemoeilijkt wordt (Foucault, 2006; Thamawatanakul, 2010).

Vele bacteriële pathogenen zijn geëvolueerd zodat ze intussen heemverbindingen kunnen

accumuleren om hun ijzervoorraad op te bouwen. Er kan gesteld worden dat rode bloedcellen

of hemine-supplementen vereisten zijn om in vitro te kunnen groeien. De bacterie beschikt

over hemine-bindende proteïnen (Hbp), zoals bij B. henselae, die dienen als hemine-

receptoren (Thamawatanakul, 2010).

3.2. Epidemiologie

Bartonella quintana wordt vooral op de mens overgedragen door de lichaamsluis, Pediculus

humanus corporis (Figuur 6). De mens vormt het natuurlijk reservoir van de bacterie, die

resideert in de rode bloedcellen (Badiaga & Brouqui, 2012).

De lichaamsluis is afkomstig vanuit de hoofdluis, Pediculus humanus capitis, toen mensen

kleren begonnen te dragen. Beide luizentypes zijn eeuwenoude humane parasieten. De

lichaamsluis leeft onrechtstreeks in kleren van de mens en wordt geassocieerd met armoede,

gebrek aan hygiëne en koude weersomstandigheden. Door constant met mensen die luizen

met zich meedragen en hun kleren, wordt een luizenplaag of pediculose veroorzaakt. Dit komt

hoofdzakelijk voor bij de dakloze bevolking in grote steden (Badiaga & Brouqui, 2012), maar

tevens rapporten betreffende B. quintana infecties die prevalent zijn in nieuwe populaties in

het Andesgebergte en in HIV-geïnfecteerden die niet adequaat worden opgevolgd.

Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120) (Foucault, 2006). De luizen zitten op het lichaam van de mens

om zich zo van bloedmaaltijden te voorzien. Ze hechten zich ook vast aan kledij van de persoon in kwestie zodat contact de

verspreiding en het ontstaan van een luizenplaag vergemakkelijkt.

B. quintana vermenigvuldigt zich in de darm van de luis en wordt op de mens overgedragen

door uitwerpselen die door aangetaste huid migreren. Lichaamsluizen voeden zich tot wel

vijfmaal per dag met bloed. Hierbij worden eiwitten geïnjecteerd, waaronder een soort

verdovingsmiddel die een allergische reactie veroorzaakt met jeuk tot gevolg. Het krabben

brengt onvermijdelijk wondjes met zich mee die de fecale transmissie van de bacterie

26

vergemakkelijkt. De aanhoudende bacteriemie wordt bevorderd door voortdurende

verspreiding van de lichaamsluis (Foucault, 2006).

B. quintana werd ook reeds aangetoond in kattenvlooien en patiënten met lymfeklierzwelling

die een kat als huisdier hebben. Dit ligt in dezelfde trend als de transmissie van B. henselae.

Deze bevindingen suggereren dat ook andere vectoren de verspreiding van B. quintana, met

bijhorende symptomen, mogelijk maken (Foucault, 2006; Badiaga & Brouqui, 2012).

3.3. Pathogenese

Als een persoon geïnfecteerd is door B. quintana kan het even duren eer de ziekte tot uiting

komt. Dit door de lange incubatieperiode van 15 tot 25 dagen. De ziekte kan in twee vormen

voorkomen, een acute en chronische vorm (Badiaga & Brouqui, 2012).

De acute vorm, loopgravenkoorts in de volksmond, manifesteert zich door cyclisch

weerkerende hoge koorts (“relapsing fever”) die gewoonlijk 2 tot 4 dagen aanhoudt met

mogelijks terugval om de 4 tot 5 dagen. Ook hoofdpijn, duizeligheid, overgevoeligheid in het

scheenbeen en pijn in de spieren en rug zijn karakteristiek voor een primaire, acute infectie

met B. quintana. Het ziektebeeld kent geen continu verloop en wordt gekoppeld aan een

langdurig herstel tot enkele maanden. Hoewel dodelijke gevallen zeldzaam zijn, kan toch

gesteld worden dat de langdurige koorts secundair hartfalen met zich mee kan brengen

(Badiaga & Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).

Chronische bacteriemie is de andere vorm van infectie met B. quintana. In een studie in

Marseille werd bij 14% van de daklozen chronische B. quintana infectie gediagnostiseerd. Er

werd ook aangetoond dat de bacterie nog tot 8 jaar na infectie aanwezig kan zijn in het bloed

van de patiënt (Kostrzewski, 1949). Foucault et al. (2002) toonden aan dat 16 van de 24

patiënten geen ziekteverschijnselen vertoonden maar dat er wel een chronische bacteriemie

werd gedetecteerd. De ziekte bleef bij één van de patiënten 78 weken aanwezig, bij 2 andere

patiënten 53 en 17 weken en bij de overige 13 werd een range van 1 tot 8 weken vastgesteld.

Het linken van chronische bacteriemie aan endocarditis is nog niet volledig onderbouwd. Wel

werden in recente literatuur 38 van de 48 gevallen van endocarditis als gevolg van

Bartonellose toegeschreven aan B. quintana (Badiaga & Brouqui, 2012; Foucault, 2006).

3.4. Therapie

Vele gevallen van de loopgravenkoorts, voornamelijk de acute vorm, vonden plaats voor het

tijdperk van de antibiotica. De klinische manifestaties hielden 4 tot 6 weken aan gevolgd door

volledige genezing. De beste remedie om de pijn te onderdrukken was aspirine. Tijdens de

Tweede Wereldoorlog werden soldaten met trench fever vanuit ziekenhuizen naar een depot

verplaatst om te herstellen. Daar waren frisse lucht, goed gebalanceerd voedsel en

spierversterkende oefeningen om de zieke soldaten terug aan te sterken zodat ze snel terug

konden keren om hun plicht te vervullen. Ook tijdens Wereldoorlog I konden soldaten met B.

quintana infectie genezen zonder tussenkomst van enige antibioticakuur. Men rekende er toen

op dat een patiënt met loopgravenkoorts gemiddeld een 60-tal dagen ongeschikt zou zijn voor

zijn militaire taken. Na de wereldoorlogen kwamen verscheidene antibiotica ter beschikking en

27

werden deze middelen aan patiënten voorgesteld als therapie, hoewel daar geen specifieke

en overtuigende data van bestaan (Rolain et al., 2004).

Antibioticatherapie tegen de bestrijding van B. quintana blijft een uitdaging. De

voorgeschreven behandeling voor patiënten met chronische bacteriemie bestaat uit een

combinatie van gentamicine (3 mg/kg lichaamsgewicht intraveneus per dag) en doxycycline

(200 mg oraal per dag) gedurende 14 en 28 dagen respectievelijk. Patiënten met endocarditis

wordt een doxycyclinekuur van 42 dagen aangeraden om de genezing te versnellen (Badiaga

& Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).

28

4. Moleculaire diagnostiek

Voor de detectie en identificatie van Bartonella species wordt in dit werk de hieronder kort

beschreven moleculaire diagnostiek toegepast.

4.1. Polymerase chain reaction

Polymerase chain reaction (PCR) is een courante, moleculaire amplificatietechniek ontwikkeld

in 1983 door de Amerikaanse biochemicus Kary Mullis. Door deze techniek kunnen in korte

tijd kleine hoeveelheden DNA vermeerderd worden tot miljoenen kopijen.

Een DNA-doelwitstreng (=template) waaraan primers zijn verbonden dienen als basis voor

DNA-polymerasen om de template te verdubbelen of kopiëren. De te amplificeren sequenties,

targets genaamd, zijn uniek voor een bepaald micro-organisme. Verder dienen

deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs) aanwezig te zijn die de bouwstenen vormen van het

amplicon. Dit betreft de basen thymine (T), adenine (A), cytosine (C) en guanine (G).

Een PCR-reactie bestaat uit drie specifieke stappen (Figuur 7).

1) Denaturatie

De PCR-mix wordt verwarmd tot 95°C om de waterstofbruggen in de dubbele helix van

het dsDNA te verbreken. Zo wordt enkelstrengig DNA (ssDNA) gevormd waarvan elke

streng op zich geamplificeerd kan worden.

2) Annealing

De annealingstemperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur (Tm) van de primers

(± 50-70°C, ongeveer 5°C onder Tm). Bij deze temperatuur kunnen de primers hechten

aan het complementair deel van het template-DNA.

3) Elongatie

De DNA-polymerase hecht zich op het 3’-uiteinde van de primer/template dubbelstreng

bij een optimale temperatuur van 72°C. De synthese van het amplicon start en verloopt

volgens complementariteit van de basenparen.

Na één cyclus is de targetsequentie verdubbeld. Het meerdere malen herhalen van de cyclus

laat toe het doelwit-DNA exponentieel te vermeerderen. Uiteindelijk bereikt de PCR een

plateau aangezien de activiteit van het polymerase daalt, de dNTPs uitgeput raken en de

reactie geïnhibeerd raakt door een overmaat aan amplicon. Theoretisch worden 2n kopijen van

het target-DNA gevormd, met n het aantal doorlopen cycli (Joshi & Deshpande, 2011; Julin,

2014).

29

Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction (Jansma et al., 2014). De eerste stap bestaat uit de denaturatie van dsDNA

tot ssDNA. Vervolgens is de aanhechting van de primers aan de enkelstreng mogelijk bij een welbepaalde temperatuur, afhankelijk

van de gebruikte primers. Als laatste stap vindt er elongatie plaats waarbij DNA-polymerase zorgt voor de verlenging van de

streng zodat dsDNA wordt gevormd. Deze stappen worden een bepaald aantal keer herhaald waardoor een miljoenen kopijen

van het doelwit-DNA worden bekomen.

PCR is een snelle methode met goede gevoeligheid en specificiteit maar deze techniek kent

ook enkele nadelen. Er dienen correcte sequenties gekend te zijn om geschikte primers te

ontwikkelen. Visualisatie en evaluatie gebeurt door middel van gelelektroforese en er is echter

geen echte concentratiebepaling.

4.2. Real-time PCR

Kwantitatieve PCR (qPCR) of real-time PCR maakt het mogelijk om de hoeveelheid DNA of

RNA (na reversed transcriptie) te analyseren door tijdens het amplificatieproces de reactie te

meten. Er worden fluorescente probes of labels gebruikt om fluorescentieveranderingen te

detecteren.

Het verschil met de conventionele PCR ligt in het analyseren van het geamplificeerd DNA. Bij

de conventionele PCR kan pas na het beëindigen van de reactie via gelelektroforese een

beeldanalyse geëvalueerd worden: is er een bandje zichtbaar of niet. Hierdoor kan deze PCR-

methode omschreven worden als een kwalitatieve bepaling. Eventueel kan een semi-

kwantitatieve bepaling bekomen worden door de intensiteit van het bandje op de gel te

bestuderen. Bij real-time PCR is het mogelijk om, naast de kwalitatieve bepaling, ook een

kwantitatieve analyse te bekomen. Dit kan gerealiseerd worden door gebruik te maken van

fluorescente probes of labels. Na iedere cyclus zal het fluorescent signaal toenemen

proportioneel aan de hoeveelheid geamplificeerd product.

Een voordeel aan qPCR is dat zowel detectie als kwantificatie van het doelwit-DNA mogelijk

is in éénzelfde reactie. De verandering in fluorescentiesignaal is evenredig met de hoeveelheid

geamplificeerd product. Ook de accuraatheid en grote detectierange (lineair meetbereik) zijn

voordelen verbonden aan de techniek. Ook de kans op contaminatie door post-PCR-

handelingen kan voorkomen worden (Smith & Osborn, 2009).

Als er gebruik wordt gemaakt van RNA als template wordt de qPCR (RT-PCR) vooraf gegaan

door een reverse transcriptie stap. Deze twee termen worden door elkaar gebruikt. Het RNA

wordt door het enzym reverse transcriptase omgezet naar cDNA om vervolgens een PCR-

30

reactie op uit te voeren. Dit kan op twee verschillende manieren gebeuren met elk hun voor-

en nadelen. De voorafgaande stap kan samen met de qPCR in één en dezelfde reactietube

gebeuren en wordt dan one-step qRT-PCR genoemd. Er worden minder pipetteerstappen

gevergd waardoor een efficiëntere tijdsbesteding mogelijk is en ook is er geen contaminatie

tussen de twee verschillende reactiestappen. Maar doorgaans is deze methode minder

gevoelig. Als er wordt gewerkt in twee gescheiden reactiebuisjes wordt er gesproken van two-

step qRT-PCR. Het is een meer flexibele methode waarbij de keuze van de primers meer

gevarieerd is en er mogelijkheid is tot stockeren van cDNA om meerdere doelwitstrengen te

kwantificeren. Negatief is de invloed van Rnase inhibitoren op de eigenlijke PCR-reactie

(Vandesompele, 2013).

4.2.1. Primers en probes

Een PCR-reactie valt of staat met goed ontworpen primers. Er is zowel een forward als reverse

primer nodig om de amplificatie te vervolledigen. Primers zijn ssDNA oligonucleotiden

complementair aan de begin- en eindsequentie van het targetgenoom. Tijdens het ontwerpen

van het primerpaar, met forward- (fw) en reverse (rv) primer moeten volgende voorwaarden

(Tabel 3) in acht genomen worden.

Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).

Criterium Uitleg

Kruis homologie Te vermijden, primersequentie moet idealiter uniek zijn voor targettemplate

Lengte 18 tot 25 basen

GC-inhoud 40 tot 60%, verdeeld over de primersequentie

GC klem 2 tot 3 GC-nucleotiden aan 3’-uiteinde van de primer zorgt voor hogere templatebindingsspecificiteit.

Tm 55 tot 60°C, afhankelijk van de nucleotidensequentie Als Tm te hoog, dan is er neiging om secundaire structuren te vormen. Het verschil in Tm tussen fw en rv primer maximaal 5°C, anders bestaat de kans dat er geen amplificatie optreedt.

Secundaire structuren Door intra- of intermoleculaire interacties bij de primers die niet meer (of inefficiënt) aanhechten aan de template. Dit geeft aanleiding tot lagere productopbrengst. Voorbeelden zijn: - Hairpin/loop: complementaire basen in de primer waarbij een lus wordt gevormd - Self-dimer: twee gelijke primers hybridiseren met elkaar (fw-fw / rv-rv) - Cross-dimer: twee verschillende primers hybridiseren met elkaar (fw-rv)

Di-nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van di-nucleotiden vermijden, bv. CTCTCTCT , gezien verhoogde kans op aspecificiteit

Nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van gelijke nucleotiden vermijden, bv. AAAAA, gezien verhoogde kans op aspecificiteit

De probes worden gesynthetiseerd op basis van de sequenties die worden afgebakend

door het primerpaar. Ze dienen ook aan bepaalde voorwaarden (Tabel 4) te voldoen

vooraleer de PCR-reactie goed kan verlopen.

31

Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).

Criterium Uitleg

Lengte 18 tot 30 baseparen Langer dan 30 basen mogelijk, maar dan kan de quencher best in de probe geplaatst worden (en niet aan 3’ einde) op minder dan 18 tot 25 basen van de reporter

%GC 30 tot 80%

Tm 8 tot 10°C hoger dan Tm van de primers

Hybridisatielocatie Probe zo dicht mogelijk bij primers aanhechten, zonder overlap, om snelle detectie mogelijk te maken

Te vermijden - Mismatchen tussen probe en template - Repetities van eenzelfde nucleotide, vooral G - G op het 5’ einde aangezien deze base een quencherfunctie heeft die reporterfluorescentie zal doen afnemen

4.2.2. Principe van fluorescentie

Fluorescentie is een verschijnsel waarbij energie met een bepaalde golflengte door een

molecule wordt geabsorbeerd en terug uitgezonden met een langere golflengte. De excitatie-

energie zal elektronen van grondtoestand laten overgaan naar een schil met hoger

energieniveau. Dit is de aangeslagen of geëxciteerde toestand van een elektron. De stabiliteit

van deze toestand is laag waardoor het elektron terugkeert naar de grondtoestand. Hierbij zal

energie geëmitteerd worden onder de vorm van warmte of licht. In het laatste geval wordt van

fluorochromen gesproken en kan een fluorescentiespectrum ontstaan. Hierbij bestaat het

uitgezonden licht uit verschillende golflengtes als gevolg van de verschillende vibratieniveaus

met verschillende hoeveelheden emissie-energie (Lakowicz, 2013; Valeur & Berberan-Santos,

2012).

Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b). De blauwe pijl toont de excitatie-energie die nodig is

om een elektron in aangeslagen toestand te brengen. Na een klein energieverschil valt het elektron terug naar de grondtoestand.

De rode pijl stelt de energie voor die op dat moment nog vrij kan komen onder de vorm van ofwel licht ofwel warmte.

Om de fluorescentieverandering te kunnen meten wordt een fluorescent label of fluorochroom

toegevoegd aan de reactie. De fluorescentietechnieken maken hierin onderscheid tussen niet-

32

specifieke labels en specifieke probes. Voor de kwantitatieve bepaling van het amplicon moet

het te meten fluorescentiesignaal de achtergrond overschrijden (Vandesompele, 2013).

4.2.3. Niet-specifieke labels

Bij niet-specifieke labels wordt geen onderscheid gemaakt tussen target en eventueel

aanwezige aspecifieke amplificatieproducten. Ze binden zich op alle dsDNA sequenties zodat

alle aanwezige dsDNA een signaal genereert. Eén van de meest gebruikte fluorochromen is

SYBR® Green I (Smith & Osborn, 2009; Vandesompele, 2013).

4.2.3.1. SYBR® Green I

SYBR® Green I is een asymmetrische cyanine

kleurstof die bindt in de kleine groef van dsDNA.

De molecule absorbeert blauw licht (λmax = 497

nm) en emitteert groen licht (λmax = 520 nm). De

fluorescentie-intensiteit van de vrije molecule is

lager dan die van het gebonden fluorochroom.

Tijdens de PCR-reactie wordt het target-DNA per

cyclus verdubbeld waardoor steeds meer vrij

SYBR® Green I gebonden kan worden (Figuur 9).

Tot gevolg zal het fluorescent signaal stijgen in

functie van het aanwezige dsDNA.

Voordelen aan deze methode is dat het

goedkoop en makkelijk in gebruik is. Het grootste

nadeel is dat het signaal niet sequentie-specifiek

is. SYBR® Green I bindt met iedere dsDNA-

molecule, ook met eventueel aanwezig

gecontamineerd dsDNA of primer-dimeren. De

controle van contaminatie is mogelijk door

analyse van de smeltpiekcurve. Als meerdere

pieken aanwezig zijn, is er vermoedelijk

aspecifieke amplificatie opgetreden (Smith &

Osborn, 2009).

4.2.3.2. Smeltcurveanalyse

Om te bevestigen dat het gedetecteerd signaal bekomen door SYBR® Green I enkel afkomstig

is van de geamplificeerde doelwit-sequentie, wordt op het einde van de qPCR-cyclus een

smeltcurve analyse uitgevoerd. Dit geeft de verandering in fluorescentie-intensiteit weer in

functie van de temperatuur.

Om een smeltcurveanalyse te kunnen uitvoeren wordt het dubbelstrengig template-DNA verhit

over een temperatuurgradiënt waarbij telkens de fluorescentie wordt gemeten. Door de

opwarming zal dsDNA in het temperatuurgebied rond de smelttemperatuur van het amplicon

denatureren. Hierdoor zal meer gebonden SYBR® Green I vrijkomen met een daling in de

Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).

SYBR® Green I bindt in de kleine groef van dsDNA.

Naarmate de PCR-reactie vordert zal er meer vrij SYBR®

Green I gebonden kunnen worden. De fluorescentie-

intensiteit stijgt eens de molecule gebonden is.

33

fluorescentie-intensiteit als gevolg. De smelttemperatuur Tm is de temperatuur waarbij 50%

van de dsDNA gedenatureerd is en hangt af van de sequentielengte en het %GC van het

amplicon. Hoe langer de sequentie en hoe hoger het percentage aan nucleotiden G en C, des

te hoger de Tm van de template (Smith & Osborn, 2009).

Ook kunnen smeltpieken voorgesteld worden door de eerste afgeleide van de smeltcurve uit

te zetten in functie van de ingestelde temperatuur. Een ononderbroken, vloeiende smeltcurve

komt overeen met een unieke smeltpiek (Figuur 10 A). Dit wordt verkregen als het doelwit-

DNA bestaat uit één specifieke sequentie met een bepaalde smelttemperatuur Tm. Als

aspecifieke, ongewenste amplificatieproducten en/of primerdimeren aanwezig zijn in het staal

van het gewenste amplicon zullen bijkomende pieken met een afwijkende Tm opduiken.

Hierdoor zal de smeltcurve een discontinue daling vertonen (Figuur 10 B). Primerdimeren

smelten vroeg uit en vertonen een piek rond het temperatuurgebied van 60°C-70°C,

afhankelijk van de primersequentie. Hierdoor is deze piek meestal goed te onderscheiden van

de gewenste piek(en) van het amplicon (Life Technologies Corporation, 2013; Vandesompele,

2013).

Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken. A: Verschillende ononderbroken smeltcurven die overeenstemmen met

een unieke smeltpiek (Neuzil et al., 2010). B: Aspecifieke smeltcurve met een duidelijk discontinue daling. Hierdoor zullen

meerdere pieken opduiken in de smeltpiekcurve (Downey, 2014).

4.2.4. Specifiek gelabelde probes

Een sequentie specifieke probe bevat twee moleculen waarbij de emissiegolflengte van de

ene (donor) overeenstemt met de excitatiegolflengte van de andere (acceptor), respectievelijk

reporter en quencher genoemd. De quencher is aanwezig op het 3’-uiteinde en de reporter op

het 5’-uiteinde van de probe. De reporter wordt met licht van een specifieke golflengte

A

B

34

geëxciteerd om vervolgens licht van een hogere golflengte dan de gebruikte excitatiegolflengte

te emitteren. De quencher capteert de uitgezonden energie van de reporter waardoor de

fluorescentie van de reporter wordt onderdrukt. Het vrijgeven van de energie van de quencher

kan enerzijds onder de vorm van licht en wordt fluorescentiequencher genoemd, of anderzijds

onder de vorm van warmte in het geval van een black-hole quencher (BHQ). In het laatste

geval is er geen fluorescentieverschijnsel door de quencher waardoor een beter signal-to-

noise resultaat wordt bekomen. In dit onderzoek werd voornamelijk een BHQ gebruikt omwille

van het feit dat een verlaagd achtergrondsignaal typerend is. De wisselwerking tussen reporter

en quencher kan enkel plaatsvinden als de twee fluorochromen zich in elkaars onmiddellijke

nabijheid bevinden. Eens de te overbruggen afstand te groot is, zal enkel de emissiegolflengte

van de reporter te meten zijn als fluorescentie-intensiteit (en de quencher enkel in het geval

van fluorescerende quencher) (Hussain, 2009; Vandesompele, 2013).

Er zijn verschillende soorten probes die volgens verschillende principes werken, waarbij de

meest gebruikte reporters derivaten zijn van fluoresceïne, rhodamine of cyanine. In dit

onderzoek werden specifiek FAM, Cy5, VIC, ROX (internal reference dye) en ABY gebruikt,

hieronder weergegeven met specifieke golflengteprofiel (Figuur 11).

Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes (Thermo Fisher Scientific, 2015a).

Om de amplificatie te volgen d.m.v. specifiek gelabelde probes wordt gebruik gemaakt van het

principe van Förster resonance energy transfer, genoemd naar de Duitse wetenschapper

Theodor Förster, maar veelal wordt de term fluorescence resonance energy transfer (FRET)

gebruikt (Helms, 2008).

35

De TaqMan® probe maakt gebruikt van FRET en

bestaat uit korte DNA-sequenties (15-30 bp)

complementair aan de reporter (5’-uiteinde) en de

quencher (3’-uiteinde) van het te amplificeren

targetgenoom. Tijdens de annealing zal de probe

binden aan de doelwitsequentie waardoor reporter

en quencher nog steeds in elkaars nabijheid

aanwezig zijn. Pas in de elongatiestap zal het Taq-

DNA-polymerase in werking treden en de probe

vanaf het 5’-uiteinde losmaken. Door de 5’-3’

exonuclease activiteit van het enzym wordt de

TaqMan® probe afgebroken waardoor reporter en

quencher zich in oplossing en ver van elkaar

bevinden zodat het fluorescentiesignaal van de

reporter gedetecteerd wordt. Naarmate de PCR

vordert zullen meer TaqMan® probes afgebroken

worden en zal de fluorescentie-intensiteit toenemen

(Figuur 12). Als reporter en quencher worden

respectievelijk FAM en een niet-fluorescerende

(NFQ) of BHQ met een kleine groef-

bindingsmolecule (MGB) gebruikt. De MGB of minor

groove binder verhoogt de stabiliteit van de

quencher zonder de sequentielengte te vergroten,

m.a.w. een kortere probe met behoud van Tm. De afstand tussen de reporter en quencher is

op die manier dusdanig klein dat de fluorescentiegolflengte uitgezonden door de reporter via

FRET opgevangen wordt door de quencher waardoor geen signaal gedetecteerd wordt

(PREMIER Biosoft; Vandesompele, 2013).

4.2.5. Fluorescentie detectie

RT-PCR werd uitgevoerd met het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System van

Life Technologies dat werkt op basis van fluorescentietechieken. Een Tungsten-halogen lamp

exciteert licht dat via een filterwiel door een excitatiefilter gestuurd wordt en vervolgens door

een dichroïsche beam splitter op de plaat gericht wordt met excitatie van de probes tot gevolg.

Geëmitteerd licht wordt door een reeks van optische lenzen gestuurd met daaraan gekoppeld

de corresponderende emissiefilter. Een charge-coupled device (ccd) camera detecteert de

emissiegolflengte die aan de hand van een foto in beeld gebracht wordt (Figuur 13) (Nollet,

2013).

Figuur 12: Werking TaqMan® probe (Global Health,

2014). De annealingsfase zorgt voor binding van de

probe aan de target. Bij excitatie van de reporter wordt

energie via FRET aan de quencher doorgegeven.

Tijdens de elongatie wordt de probe los gemaakt en

afgebroken tot reporter en quencher in oplossing zijn.

Op dat moment wordt fluorescentie van de reporter

gemeten.

36

Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera (Nollet, 2013).

4.2.6. Interpretatie ruwe data

Tijdens en na de run wordt de fluorescentiedata verwerkt. De output van een qPCR geeft

grafisch de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU, Rn of ΔRn) weer t.o.v. de amplificatiecyclus.

Dit wordt eenvoudigweg de amplificatieplot genoemd. Er worden drie fasen onderscheiden nl.,

een lineaire fase als achtergrond, een exponentiële fase waarbij het product per cyclus

verdubbeld wordt en als laatste de plateaufase eens teveel amplicon aanwezig zodat inhibitie

optreedt (Figuur 14). In die laatste fase wordt er geen product meer bijgevormd wat eveneens

het eindpunt van de amplificatie aanduidt. Om meer accurate gegevens te bekomen wordt de

kwantificatie van de real-time PCR in de exponentiële fase uitgevoerd. In deze fase zijn alle

nodige reagentia aanwezig, is de efficiëntie van de polymerase het hoogst en de vorming van

primer-dimeren beperkt.

Een achtergrondsignaal of ruis afkomstig van veranderingen in reactie- en omgevingscondities

beïnvloedt het gemeten fluorescentiesignaal. In het begin van de qPCR, als nog geen

eigenlijke amplificatie gedetecteerd wordt, wordt de ruis omgezet in een baseline die dient als

grens waarboven de fluorescentie niet meer tot de achtergrond wordt gerekend.

De drempelwaarde of threshold ligt iets hoger dan het fluorescentieniveau van de baseline en

is de detectielimiet van het toestel voor iedere staal in eenzelfde qPCR. De threshold cycle of

CT-waarde is het aantal cycli nodig om de drempelwaarde te overschrijden en wordt gebruikt

voor de kwantificering van de template. Grafisch is dit de plaats waar de amplificatiecurve de

threshold snijdt (Figuur 14) (Applied Biosystems, 2008; Life Technologies Corporation, 2012).

37

Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen (Ahmed, 2005).

Verder kan een standaardcurve opgesteld worden die de uitvoering van een RT-PCR-reactie

evalueert aan de hand van bepaalde parameters (Tabel 5).

Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR (Vandesompele, 2013; Life Technologies Corporation, 2012).

Parameter Definitie

Dynamische range Het bereik van CT-waarden van opeenvolgende

verdunningen. Wordt gebruikt om resultaten te

standaardiseren. Idealiter: 7-8 waarden, minimum: 5

waarden.

Helling (slope) De richtingscoëfficiënt van de standaardcurve over de

dynamische range.

Efficiëntie = 10(-1/slope) -1

100% voor ideale omstandigheden gaat gepaard met een

helling van -3.32. Afwijkingen zorgen voor nuttige

amplificatie-informatie. Lengte, %GC, secundaire structuren

en concentraties zijn factoren die variatie kunnen

veroorzaken.

Ideaal: Eff=10(-1/-3.32) -1=1,00 100%

Correlatiecoëfficiënt (R²) Maat voor hoe goed de gemeten waarden op de ingestelde

standaardcurve liggen. Hoe groter de afwijking van de CT-

waarden, hoe meer de coëfficiënt onder de ideale waarde 1

ligt.

Y-intercept De theoretische detectielimiet. M.a.w. Ct-waarden als één

enkel target voor significante amplificatie zou zorgen.

Gevoeligheid of sensitiviteit De minimale hoeveelheid target te onderscheiden van het

achtergrondsignaal. Hoe lager de detecteerbare Ct-waarden

binnen dezelfde verdunning en omstandigheden, hoe hoger

de sensitiviteit.

Reproduceerbaarheid Het bekomen van eenzelfde resultaat bij het telkens

opnieuw uitvoeren van een PCR-reactie.

38

4.3. Sanger sequencing

De techniek werd de midden jaren ’70 ontwikkeld door Frederick Sanger en laat toe om de

DNA-sequentie te bepalen. De methode wordt ook dideoxy sequencing genoemd aangezien

dideoxynucleotiden (ddNTP) worden gebruikt voor de specifieke terminatie van een DNA-

synthesereactie. In vergelijking tot normale deoxynucleotiden (dNTPs) bevatten de vier

ddNTPs een H-groep op de 3'-plaats in plaats van een OH-groep (Figuur 15). Hierdoor kan

geen fosfodi-esterbinding gevormd worden en de streng niet verlengd worden. Iedere ddNTP

is fluorescent gelabeld met elk een specifieke emissiegolflengte. Het DNA-polymerase zorgt

voor de inbouw van dNTPs of ddNTPs en op basis van competitie tussen beide ontstaan

fragmenten van verschillende lengte (Applied Biosystems, 2009; Munshi, 2012).

Figuur 15: Voorstelling dNTPs en ddNTPs (Snipcademy). Er is een duidelijk verschil op de 3’ koolstofgroep waarbij ddNTPs

in plaats van een OH-groep een H-groep bevatten. Het DNA-polymerase kan hierdoor geen nieuwe nucleotiden aan de groeiende

streng bouwen. Per ingebouwd ddNTP is een fragment van bepaalde lengte gevormd.

Praktisch houdt de techniek bepaalde stappen in. Eerst wordt een PCR-amplificatie uitgevoerd

en gecontroleerd door agarosegelelektroforese. Vervolgens kan het bekomen

amplificatieproduct opgezuiverd worden door ExoSAP-IT. Bij deze zuivering wordt gebruik

gemaakt van twee enzymen nl., Exonuclease I en Shrimp Alkalisch Fosfatase. Exonuclease I

hydrolyseert enkelstrengig DNA in een 5’-3’ richting, waardoor de primers worden afgebroken.

Alkalisch Fosfatase verwijdert de fosfaatgroepen van de dNTPs zodat deze geïnactiveerd

worden. Een volgende stap houdt de eigenlijke sequentiereactie in waarbij specifieke primers

worden gebruikt. Zuivere sequentieproducten worden bekomen door gelfiltratie met

SephadexTM G-50 superfine (GE Healthcare) toe te passen. De componenten in het mengsel

worden gescheiden op basis van grootte. Sephadex bestaat uit dextraan en epichloorhydrine

waardoor, na toevoeging van water, de dextraanketens gecrosslinkt worden met

erepichloorhydrine. De gevormde poriën kunnen kleinere moleculen weerhouden terwijl

grotere uit de kolom elueren. De amplicons passeren langs de poriën en restanten worden

weerhouden.

39

Om verschillende fragmenten van elkaar te scheiden en te analyseren, wordt capillaire

elektroforese toegepast. De opgezuiverde fragmenten worden gescheiden op basis van het

gedrag in een gecreëerd elektrisch veld. Onder invloed van een aangelegde spanning,

opgewerkt tussen anode en kathode, zal het staal aangezogen worden en de geladen DNA-

fragmenten zullen migreren door het capillair gevuld met scheidingspolymeer. Aangezien DNA

bij een neutrale pH negatief geladen is, zal de anode aan het begin en de kathode aan het

einde van het capillair opgesteld staan. Kortste fragmenten zullen als eerste de detector

bereiken. Door excitatie met een laser en de daaropvolgende emissie van fotonen, wordt een

signaal gedetecteerd. De verschillende ddNTPs met elk hun specifieke fluorescente label

zullen licht van een verschillende golflengte emitteren. Deze detector window bevindt zich

voor een CCD (Charge Coupled Device Detector) camera. In deze toepassing werd ABI

3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems®) gebruikt voor staalanalyse (Applied

Biosystems, 2009; Franca et al., 2002).

4.3.1. 16S rRNA sequenering

In ieder bacterieel ribosoom is een stuk RNA aanwezig dat uitermate geschikt is voor

microbiële identificatie. Dit stuk RNA wordt 16S ribosomaal RNA (rRNA) genoemd en is

ongeveer 1500 basenparen lang. De relatief korte sequentie heeft verschillende functies die

noodzakelijk zijn voor het overleven en in stand houden van de cel. Hierdoor wordt het 16S

rRNA gen als een huishoudgen beschouwd. Gedurende de evolutie is de sequentievolgorde

slechts weinig veranderd maar de variabele regio’s maken bacteriële identificatie mogelijk. De

basenvolgorde aan het begin en einde van het gen zijn in alle bacteriecellen geconserveerd

en dienen als primerbindingsplaatsen. Het 16S rRNA gen bevat 9 variabele regio’s tussen de

geconserveerde regio’s (Illumina). Sequenering van het 16S rRNA gen is de meest

voorkomende methode voor bacteriële identificatie en kan eenvoudig en snel uitgevoerd

worden (Pauwels, 2012; Wiersema, 2005; Yang et al., 2016).

Om bacteriën aanwezig in een gegeven staal te identificeren, wordt vooral 16S rRNA

sequenering toegepast. Het te sequeneren fragment moet voldoende groot zijn om de nodige

informatie uit af te kunnen leiden maar mag niet groter zijn dan 1000 basenparen aangezien

de snelheid van de test in het gedrang zou komen. Het onderscheiden van alle mogelijke

bacteriën is echter niet mogelijk met de variabele regio’s op zich. De genetische variatie binnen

de variabele regio’s is vaak niet hoog genoeg voor exacte differentiatie. Aangezien de techniek

een snelle en vrij betrouwbare methode is om verscheidene bacteriën te identificeren, wordt

16S rRNA nog steeds gebruikt binnen de moleculaire microbiologie (Illumina; Janda & Abbott,

2007; Pauwels, 2012).

40

5. Materiaal en methoden

5.1. AmpliRun® Bartonella DNA-controles

Gezuiverd microbieel DNA van twee stammen van verschillende species, namelijk van

Bartonella quintana en Bartonella henselae, werden aangekocht bij de firma Vircell (Tabel 6).

Dit referentiemateriaal bevat het targetgenoom, uitgedrukt in kopieën/µl, en werd gebruikt als

positieve controle tijdens de validatie van de verschillende primer/probeparen voor RT-PCR.

Ook werd aan de hand van deze controles de limit of detection (LOD) bepaald. Ze werden

bewaard bij -35°C en werden voor kwaliteitsbehoud aan zo weinig mogelijk vries-dooicycli

blootgesteld.

Tabel 6: AmpliRun® Bartonella DNA-controles aangeschaft via de firma Vircell.

Naam Lotnummer Concentratie

AmpliRun® Bartonella quintana

DNA control 16MBC006001 13000 copies/µl

AmpliRun® Bartonella henselae

DNA control 16MBC005001 17500 copies/µl

5.2. Extractieprotocol

Om het DNA te extraheren uit klinische stalen, verschillende matrixen, verdunningsreeksen,

e.d. werd gebruik gemaakt van QiaSymphony SP (Qiagen) en het “pathogen complex 800”

protocol. 800 µl staal wordt geëxtraheerd en na opzuivering finaal geëlueerd in 130 µl.

Rekening houdend met het doodvolume van de QiaSymphony SP (ca. 150 µl) moet een

staalvolume van minimaal 950 µl geladen worden op het toestel. Tijdens het extractieproces

wordt Phocine herpesvirus-1 (PhHV-1) toegevoegd aan ieder te extraheren staal als interne

amplificatie- en inhibitiecontrole. PhHV-1 is een DNA-virus afkomstig van zeehonden, ook Seal

Herpesvirus (SHV) genoemd, zonder enige gelijkenis met de sequenties van andere virussen

of humane pathogenen van interesse (Dorak, 2007).

5.3. Ontwikkeling van specifieke primers en probes

Rekening houdend met de voorwaarden voor zowel primers als probes, aangehaald in

onderdeel 4.2.1 (Tabel 3 en Tabel 4), kunnen primers en probes ontworpen worden.

Via Primer Express® Software v3.0.1, een commercieel programma, konden primers en probes

ontwikkeld worden. Aan de hand van een literatuurstudie worden de meest geschikte

doelwitgenen opgelijst. Met BLAST analyses worden de corresponderende doelwitsequenties

opgezocht en aangeboden aan het programma dat volledig automatisch (met de mogelijkheid

om eventueel handmatig te werken) de nodige primers en probes ontwikkelt met behoud van

de ontwikkelingscriteria (Thermo Fisher Scientific, 2015c).

Vervolgens werden de bekomen sequenties onderzocht via Basic Local Alignment Search

Tool (BLAST). Dit is een computeralgoritme dat de DNA-sequentie of eiwitsequentie vergelijkt

met verschillende databanken. Regio's van lokale gelijkenis tussen sequenties worden

doorzocht en de statistische significantie van resultaten worden berekend (Madden, 2013).

41

Zowel de forward primer als reverse primer werden ingegeven en vergeleken met een lijst van

sequentiedatabanken. Organismen die de opgegeven sequenties bevatten werden

weergegeven met het aantal optredende mismatches. Hierdoor konden goede primers en

probes geselecteerd en besteld worden met een hoge specificiteit voor het detecteren van de

doelwitorganismen.

OligoAnalyzer 3.1 werd gebruikt om de ontworpen primersequenties verder te onderwerpen

aan specificaties. Via het programma kan een oligonucleotidesequentie onderzocht worden

op hairpin/loop, self-dimer, cross-dimer en Tm-mismatch. Alle mogelijke secundaire structuren

worden weergegeven met bijhorende specificaties. Een algemene analyse van de sequentie

toont informatie over o.a. lengte, %GC, moleculair gewicht, Tm en extinctiecoëfficiënt bij 260

nm (Owczarzy et al., 2008; Youtsey, 2012).

Er werden verschillende primers en probes ontworpen per organisme. Ieder primer/probepaar

werd voor een specifieke targetsequentie gehanteerd (Tabel 7). Sequenties worden om

confidentialiteitsredenen niet weergegeven.

Tabel 7: Geselecteerde primers en probes specifiek voor de verschillende targetorganismen.

Organisme Doelwitgen Naam Type Tm (°C) Lengte

(bp)

Bartonella spp.

16S-23S RNA intergenic

region

p715 Bart Fw Forward 59,5

76 p716 Bart Rv Reverse 59

p717 Bart Pr Probe 68,2

16S rRNA gene

p718 Bart 16 Fw Forward 60-58,9

77 p719 Bart 16 Rv Reverse 58,2-61

p720 Bart 16 Pr Probe 69,5

Bartonella quintana

Hypothetical intracellular

effector (yopP)

p721 Bq Yop Fw Forward 58,8

77 p722 Bq Yop Rv Reverse 58,7

p723 Bq Yop Pr Probe 68,5

Transcriptional regulatory

protein gene (bqtR)

p724 Bq bqtr Fw Forward 58

85 p725 Bq bqtr Rv Reverse 58,3

p726 Bq bqtr Pr Probe 68,1

Bartonella henselae

Fibronectin binding adhesin (pap31)

p727 Bh pap Fw Forward 58,8

67 p728 Bh pap Rv Reverse 57,3-58,1

p729 Bh pap Pr Probe 68,7-71,6

42

Citrate synthase-encoding

gene (gltA)

p730 Bh glta Fw Forward 59,1

83 p731 Bh glta Rv Reverse 58,7

p732 Bh glta Pr Probe 68,6

Om de juiste targetsequentie te amplificeren worden specifieke primers en probes

geselecteerd. De primers en probes zijn aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA

Technologies) aan een concentratie van 100 μM. Om eenvoudiger te werken werden de

primers en probes verdund tot 20 µM.

5.4. Klinische stalen

Naast de AmpliRun® Bartonella DNA-controles werden als positief referentiemateriaal ook

klinische monsters (Tabel 28, Bijlage I) gebruikt. Ten eerste vond er een retrospectief luik

plaats, nl. klinische monsters die in het verleden reeds correct geïdentificeerd waren door AZ

Sint-Lucas (Gent) werden binnen dit onderzoek getest in AZ Sint-Jan te Brugge. Tijdens een

verder stadium van het onderzoek (prospectief luik) werden klinische stalen (Tabel 29, Bijlage

I) getest met de nieuwe methode en vergeleken met de vastgestelde klinische interpretatie.

5.5. Real-time PCR

5.5.1. SYBR® Select Mastermix

SYBR® Select Mastermix (Life Technologies) voor RT-PCR wordt bewaard bij 4°C en is

samengesteld uit:

- SYBR® GreenERTM Dye (SYBR®Green)

- AmpliTaq® DNA-Polymerase (hot start)

- Hitte-labiele Uracil-N-Glycosylase (UNG)

- Passieve referentie ROXTM Dye

- dNTP mix met dUTP en dTTP

- Geoptimaliseerde buffer componenten

De SYBR® Select Mastermix werd gebruikt om de functionaliteit en specificiteit van de

ontworpen primers na te gaan op basis van smeltcurveanalyse van het bekomen amplicon.

Tabel 8 geeft de samenstelling van deze mix weer die werd gehanteerd voor één reactie. Het

aantal gewenste reacties werd hiermee omgerekend naar de juiste hoeveelheden. Na

homogeniseren en kort centrifugeren (short spin) werd de reactieplaat samengesteld met

enerzijds 15 µl mix en anderzijds 5 µl van het geëxtraheerd DNA. Na sluiten van de reactieplaat

werd er nogmaals een short spin uitgevoerd om vervolgens het runprotocol (Figuur 16) in het

Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies) te doorlopen. De

eerste stap van het protocol dient voor de activatie van het UNG-enzym die ervoor zorgt dat

er geen kruiscontaminatie kan plaatsvinden. Als in een wildtype genoom een U (RNA) wordt

geamplificeerd i.p.v. T dan wordt dit door het enzym opgemerkt en wordt de contaminatie eruit

geknipt.

43

Tabel 8: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix.

Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie

SYBR® Select

Mastermix 2x 10 1x

Enzym mix 125x 0,16 1x

Forward primer 20 pmol/µl 0,3 300 nM

Reverse primer 20 pmol/µl 0,3 300 nM

H2O 4,4

Volume 15

DNA 5

Totaal volume 20

Figuur 16: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix uitgevoerd op het Applied Biosystems®

ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

5.5.2. TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix wordt bewaard bij -20°C en dient eerst te ontdooien

alvorens bruikbaar in de test. Belangrijk is dat de mastermix zo weinig mogelijk vries-dooicycli

ondergaat. De mix is zeer viskeus en is samengesteld uit:

- AmpliTaq® Fast DNA-Polymerase

- Thermostabiel MMLV enzym (reverse transcriptase)

- dNTPs mix met dATP, dGTP, dCTP, and dTTP

- RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor

- Passieve referentie ROX™ dye

- Geoptimaliseerde buffer componenten (maximale gevoeligheid en inhibitietolerantie)

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix werd gebruikt om een mix te maken met de ontworpen

primers en de corresponderende probe. Tabel 9 geeft de samenstelling van deze mix voor één

RT-PCR reactie weer. De volumes werden omgerekend naargelang het gewenste aantal

reacties. Na homogeniseren en kort centrifugeren (short spin) werd de reactieplaat

44

samengesteld met enerzijds 30 µl mix en anderzijds 20 µl van het geëxtraheerd DNA. Bij

iedere run werd er een positieve en negatieve controle (no template) of blanco meegenomen.

Bij een negatieve controle werd 20 µl water toegevoegd dat hetzelfde extractieproces doorliep

als de DNA-stalen wat dient als controle op het extractieverloop en op kruiscontaminatie. Ter

controle van de mastermix werd een blanco meegelopen waarbij 20 µl puur water werd

gebruikt. Als positieve controle werd gebruik gemaakt van de AmpliRun® controls van Vircell.

Na sluiten van de reactieplaats werd er nogmaals een short spin uitgevoerd om vervolgens

het runprotocol (Figuur 17) in het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life

Technologies) te doorlopen. De eerste stap in het protocol dient om het enzym reverse

transcriptase te activeren.

Tabel 9: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.


TaqMan® Fast Virus

1-Step Mastermix 4x 12,5 1x

Forward primer 20 pmol/µl 0,75 300 nM

Reverse primer 20 pmol/µl 0,75 300 nM

Probe 20 pmol/µl 0,625 250 nM

H2O 15,375

Totaal 30

DNA 20

Totaal volume 50

Figuur 17: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix uitgevoerd op het Applied

Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

45

Tabel 10 geeft de samenstelling weer van de mix voor de duplex 16S rRNA gene en SHV RT-

PCR, Tabel 11 geeft de gebruikte samenstelling weer van de mix van de duplex yopP met

pap31 RT-PCR. Er werd voor beiden gebruik gemaakt van TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix waardoor het voorgaande runprotocol behouden werd (Figuur 17).

Tabel 10: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met 16S rRNA gene en SHV met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix. SHV werd gebruikt als interne controle.


TaqMan® Fast Virus


p718 Bart 16 Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p719 Bart 16 Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p720 Bart 16 Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM

P019 PhHV-1FW VD 20 pmol/µl 0,25 100 nM

P020 PhHV-1RV VD 20 pmol/µl 0,25 100 nM

P021.4 PhHV-1YY

zen probeVD 20 pmol/µl 0,375 150 nM

H2O 14,5

Totaal 30

DNA 20

Totaal volume 50

Tabel 11: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met yopP met pap31 met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix.


TaqMan® Fast Virus


p721 Bq Yop Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p722 Bq Yop Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p723 Bq Yop Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM

p727 Bh pap Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p728 Bh pap Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM

p729 Bh pap Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM

H2O 13,25

Totaal 30

DNA 20

Totaal volume 50

46

5.6. Validatiecriteria

5.6.1. Limit of detection (LOD)

De detectielimiet of “Limiet of detection” (LOD) is de laagste concentratie of de kleinste

hoeveelheid analyt waarbij ≥95% van de testen een positief resultaat geven, toegepast op een

verdunningsreeks van referentiemateriaal onder routinematige laboratoriumomstandigheden.

In dit onderzoek werd een verdunningsreeks van zowel de Vircell AmpliRun® Bartonella

quintana als Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle (5.1, Tabel 6) gebruikt als

referentiemateriaal.

5.6.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid

Om de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de techniek te onderzoeken werden

respectievelijk een intrarun en interrun evaluatie uitgevoerd met Liquid Amies medium als

matrix. Iedere verdunning werd in drievoud ingezet om nazicht van herhaalbaarheid (intrarun)

te bekomen en werd samen met twee andere runs als evaluatie van reproduceerbaarheid

(interrun) gezien.

5.6.3. Juistheid

Om een correcte validatie voor een klinische setting te vervolledigen werden verschillende

klinische matrixen onderzocht om te achterhalen of een bepaalde matrix invloed heeft op de

gevoeligheid van de ontworpen RT-PCR.

De matrixen die gebruikt werden zijn:

- Liquid Amies medium (Copan): E-SwabTM is een vloeistof-gebaseerd systeem voor

staalcollectie, transport en bewaring. De staalname wordt verwezenlijkt door het

bestrijken van de geïnfecteerde plaats met de Nylon® Flocked Swab in een poging om

genoeg (cellulair) materiaal te bekomen. De wisser wordt terug in de huls gebracht die

1 ml Liquid Amies medium (Copan) bevat.

- Klierweefsel/weefselbiopt: een veel voorkomend symptoom, voornamelijk bij B.

henselae, is klierzwelling. Deze matrix werd meegenomen in de testreeks. Ter

voorbereiding werd het weefsel in een tube gebracht voor dissociatie van het weefsel

tot aparte cellen, met de gentleMACSTM dissociator (GentleMacs programma

m_spleen_01, 60 s).

- Etter: bartonellose veroorzaakt vaak wonden (en secundaire abcessen) met

pusvorming. Dit wondvocht is dikwijls de broedplaats van Bartonella spp. maar ook van

andere bacteriën en pathogenen. Het is van groot belang dat deze matrix onderzocht

wordt op eventuele reductie van de gevoeligheid.

- Volbloed: ook al wordt Bartonella spp. nauwelijks gedetecteerd in bloedstalen, werd

deze matrix toch meegenomen ter controle van de test. Theoretisch wordt Bartonella

spp. gekenmerkt door een intra-erytrocytaire replicatie.

47

Verschillende klinische stalen: klierweefsel, wondvocht en e-swab, positief voor Bartonella

henselae werden gemengd en gehomogeniseerd in één enkele tube. Vanuit dit B. henselae

positief mengstaal werd een verdunningsreeks opgesteld in 1X Tris-EDTA-buffer (1X TE)

volgens Tabel 12 zodat er 5 stalen bekomen werden (S0-S4) in een totaalvolume van 3 ml.

Tabel 12: Schema voor de verdunning van de mix gemaakt uit verschillende klinische stalen positief voor B. henselae.

Notatie Verdunnings-

factor Staalvolume

(µl) 1X TE (µl)

Totaal volume (µl)

Eindvolume (µl)

S0 0 3000 0 3000 2700

S1 10 300 dilutie 0 2700 3000 2100

S2 33 900 dilutie 1 2100 3000 2100

S3 100 900 dilutie 2 2100 3000 2700

S4 1000 300 dilutie 3 2700 3000 3000

Het eindvolume werd verdeeld in hoeveelheden van 100 µl om de verschillende matrixen mee

te spiken. Van iedere matrix werd 900 µl toegevoegd aan de respectievelijke mixverdunning

(S0 t.e.m. S4) zodat een eindvolume van 1 ml werd bekomen om te extraheren. Na het

uitvoeren van de RT-PCR konden de bekomen CT-waarden vergeleken worden met een

referentie, namelijk elke verdunning (S0 t.e.m. S4, 100 µl) met 900 µl 1X TE-buffer.

5.6.4. Interferentiestudie

Om de specificiteit van de RT-PCR te testen werden virussen, bacteriële culturen en protozoa

onderworpen aan de test. Tabel 13 toont de lijst van klinische pathogenen die getest zijn.

Tabel 13: De verschillende virussen en bacteriën die getest zijn om interferentie met de nieuwe methode te onderzoeken.

Virussen Bacteriën Protozoa

Adenoviridae Acinetobacter Toxoplasma

Cytomegalovirus (CMV) Atopobium vaginae

Enterovirus Enterococcus faecalis

Epstein–Barr virus (EBV) Escherichia coli

Human herpesvirus 1 (HHV-1) Gardnerella vaginalis

Human herpesvirus 2 (HHV-2) Haemophilus influenzae

Human herpesvirus 6 (HHV-6) Lactobacillus crispatus

Respiratoir Syncytiaal virus (RSV) Lactobacillus iners

Rhinovirus Pseudomonas aeruginosa

Varicella-zostervirus (VZV) Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

Streptococcus dysgalactiae

Streptococcus pneumoniae

Drie bacteriële suspensies (mix 1-3) werden aangemaakt (samenstelling hieronder) door met

een entlus bacteriële cultuur van de respectievelijke gegroeide agarplaat te schrapen en te

suspenderen in 1 ml fysiologisch water. Deze suspensie werd opgewarmd tot ongeveer 95°C

48

om de cellen open te breken. Na centrifugeren werd 500 µl supernatans gebruikt om extractie

op uit te voeren. De mixen bestonden uit:

- Mix 1: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus dysgalactiae

- Mix 2: Escherichia coli, Streptococcus agalactiae

- Mix 3: Acinetobacter, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus

De andere pathogenen vermeld in Tabel 13 werden getest door verschillende klinische stalen,

reeds positief bevonden aan bepaalde organismen, te hertesten tijdens de interferentiestudie.

5.6.5. Bewaarcondities monstermateriaal

Om de bewaarcondities van het monstermateriaal te onderzoeken werd de staalflow binnen

het ziekenhuis en van een extern afgenomen staal, inclusief transport, nagebootst. Dit werd

toegepast op zowel 1X TE als Liquid Amies medium (LA) als matrix. Tabel 14 geeft een

overzicht van de planning die gevolgd werd tijdens het uitvoeren van de testen.

Tabel 14: Overzicht timemanagement bewaarcondities voor validatie. Alle stalen werden op dezelfde dag onderworpen aan

RT-PCR. Reeds geëxtraheerde stalen werden in de koelkast bewaard.

Legende: oranje=extractie, groen=RT-PCR, KT=kamertemperatuur, 3-8°C=koelkasttemperatuur, -20°C=diepvriestemperatuur.

Staaln° Samenstelling Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6 Dag 7

1 100µL S0 + 900µL LA

KT

2 100µL S0 + 900µL LA

KT 3-8°C 3-8°C

3 100µL S0 + 900µL LA

KT -20°C -20°C

4 100µL S0 + 900µL LA

KT 3-8°C 3-8°C KT KT

5 100µL S0 + 900µL LA

KT -20°C -20°C KT KT -20°C

6 100µL S0 +

900µL punctie KT

7 100µL S0 +

900µL punctie KT 3-8°C 3-8°C

8 100µL S0 +

900µL punctie KT -20°C -20°C

9 100µL S0 +

900µL punctie KT 3-8°C 3-8°C KT KT

10 100µL S0 +

900µL punctie KT -20°C -20°C KT KT -20°C


Tijdens het uitvoeren van de sequenering werd gewerkt volgens de standard operating

procedure (SOP) die reeds gebruikt wordt in het AZ Sint-Jan te Brugge. De SOP beschrijft de

methode ter identificatie van onbekende bacteriële isolaten aan de hand van 16S rRNA-

gensequenering. Deze methode is gebaseerd op een PCR reactie voor het specifiek

amplificeren van een 774 bp fragment van het 16S rRNA-gen. Na amplificatie werd het

bekomen fragment gesequeneerd. Als de definitieve sequentie gekend is, werd identificatie

bekomen door te vergeleken t.o.v. een database met sequenties van 16S rRNA gen

49

fragmenten van gekende bacteriën. Hiervoor werd Basic Local Alignment Search Tool

(BLAST) gebruikt. Figuur 18 geeft een schematische voorstelling van alle stappen.

Figuur 18: Schematisch overzicht van de stappen die werden gevolgd volgens de reeds beschreven SOP om het 774 bp

fragment van het 16S rRNA gen van stalen te sequeneren en het betrokken micro-organisme te identificeren.

5.7.1. PCR-amplificatie

Er werd een reactiemix (20 µl/reactie) aangemaakt volgens Tabel 15. De volumes werden

vermenigvuldigd met het aantal reacties die uitgevoerd werden. Bij iedere toevoeging aan de

mix werd gemengd door telkens op en neer te pipetteren. Aan iedere MicroAMP reaction tube

werd 5 µl DNA toegevoegd.

Tabel 15: Samenstelling van de AmpliTaq Gold PCR-mix voor één PCR-amplificatiereactie.


AmpliTaq Gold DNA

polymerase 0,2

Buffer 10x 2,5 1x

dNTP 5 mM 1 200 µM

Forward primer (140-27F) 20 pmol/µl 1 0,8 µM

Reverse primer (141-801R) 20 pmol/µl 1 0,8 µM

MgCl2 25 mM 1,5 1,5 mM

RNase/DNase vrij water 12,8

Volume 20

DNA 5

Totaal volume 25

Praktische opmerkingen:

DNA-polymerase werd kort voor gebruik uit de diepvries gehaald en na gebruik onmiddellijk

terug geplaatst. Als negatieve controle werd 5 µl pure water toegevoegd i.p.v. DNA.

Alle MicroAMP reaction tubes werden in de blok van de thermocycler (GeneAmp® PCR

System 9700, Applied Biosystems®) geplaatst en volgens onderstaand programma (Tabel 16)

uitgevoerd.

50

Tabel 16: Runprotocol om PCR-amplificatie uit te voeren met AmpliTaq Gold DNA polymerase.

Stap Tijd Temperatuur # cycli

Hot start 5 min 95°C

Denaturatie 45 s 95°C

35 Annealing 45 s 50°C

Extensie 1 min 30 72°C

Einde PCR-cyclus/

bewaring ∞ 4°C

5.7.2. Agarosegelelektroforese

Er werd een 1.5 % agarosegel aangemaakt volgens onderstaande werkwijze:

- Weeg 1,5 g agarosegel af in een erlenmeyer.

- Voeg 40 ml TBE-buffer en 4 µl SYBR SAFE toe.

- Verwarm nu de agaroseoplossing in de microgolf op 900 W gedurende 2 min.

- Neem een gelhouder en plak af met plakband.

- Haal de warme erlenmeyer met de agaroseoplossing uit de microgolf en laat

gedeeltelijk afkoelen.

- Giet de erlenmeyer leeg in de afgeplakte gelhouder zodat alles goed verdeeld is.

(Vermijd luchtbellen)

- Plaats de kam in de gel (voordat de gel stolt).

- Laat de gel gedurende minstens 20 minuten en maximum 60 minuten stollen.

De gel werd geladen door het uitvoeren van volgende stappen:

- Neem een microtiterplaat, de bekomen amplicons en een tube Nucleic Acid Sample

Loading Buffer.

- Breng 3 µl 5x loading buffer over in een microtiterplaat op evenveel cupjes als er stalen

zijn.

- Voeg 5 µl amplicon toe en meng goed op.

- Plaats nu de vooraf gemaakt agarosegel in de elektroforesetank zodat deze volledig

onder de buffer zit.

- Voeg 2 µl 100 bp ladder (EZ loadTM 100 bp PCR Molecular Ruler, Bio-Rad) in het eerste

welletje.

- Voeg 8 µl van het amplicon-Nucleic Acid Sample Loading Buffer-mengsel toe aan de

volgende welletjes, zorg dat alles in het overeenkomstig welletje terecht komt.

- Eindig door terug 2 µl 100 bp ladder aan te brengen.

De elektroforesetank (Bio-Rad) werd gesloten en de elektroforese werd gedurende 50 min. bij

150 V uitgevoerd. Het DNA (negatieve fosfaatgroepen) loopt van de negatieve pool naar de

positieve pool. De elektroforesetank is goed gemonteerd als aan de kant van de stalen (de

negatieve pool) belletjes verschijnen als de spanning aangelegd wordt.

51

Er werd een foto van het gel gemaakt met behulp van het aanwezige camerasysteem

(GenoSmart2, VWR®). Banden van ongeveer 774 bp moeten zichtbaar zijn om de procedure

verder te kunnen zetten.

5.7.3. DNA-sequentiebepaling

5.7.3.1. Opzuiveren van het PCR-product

Er werden eenzelfde aantal 200 µl MicroAMP reaction tubes met dekseltje als bij de PCR-

amplificatie in een 96-well PCR-cooler geplaatst. Vervolgens werd ExoSAP-IT uit de diepvries

gehaald en op een Mini Cooler geplaatst gedurende de ganse procedure. In ieder tube werd

3,0 µl ExoSAP-IT® en 7,5 µl PCR-amplificatieproduct toegevoegd. Aangezien ExoSAP-IT zeer

visceus is, werd goed gemengd. Onmiddellijk na de uitvoering werd ExoSAP-IT in de diepvries

en de tubes in de thermocycler geplaatst. Tabel 17 toont het uitgevoerde runprotocol voor

ExoSap-IT.

Tabel 17: Runprotocol voor ExoSAP-IT voor de opzuivering van de PCR-producten.

Stap Tijd Temperatuur

Degradatie van primers en dNTP’s 30 min 37°C

Degradatie van enzymen 20 min 80°C

Einde PCR-cyclus/bewaring ∞ 4°C

Na het beëindigen van het programma zijn de producten klaar om gebruikt te worden voor

DNA-sequentiebepaling. Opgezuiverde producten werden bewaard gedurende enkele dagen

bij 2°C-8°C, indien langer bij -20°C tot -24°C.

5.7.3.2. DNA-sequentiereactie

Voor iedere primer apart (één forward en één reverse) werd een sequencing mastermix (9

µl/reactie) aangemaakt volgens Tabel 18. Het aantal reacties werden vermenigvuldigd met de

volumes om een correct eindvolume te bekomen. De mix werd verdeeld (9 µl/tube) over het

nodige aantal 200 µl MicroAMP reaction tube met dekseltje. Er werd 1 µl gezuiverd PCR-

product toegevoegd per reagensmix (FW en RV).

Tabel 18: Samenstelling mastermix voor één sequentiereactie. Er moet voor elke primer apart een mix aangemaakt worden.


BigDye Mix v1,1 1

BigDye buffer 1

FW/RV-primer* 20 pmol/µl 1 2 µM

RNase/DNase vrij water 6

Volume 9

DNA 1

Totaal volume 10

* FW-primer = p140-27F; RV-primer = p141-801R

52

De stalen werden in de blok van de thermocycler gebracht en het programma volgens

onderstaande tabel (Tabel 19) werd gestart.

Tabel 19: Programma thermocycler voor de DNA-sequentiereactie.

Stap Tijd Temperatuur # cycli

Hot start 6 min 98°C

Denaturatie 10 s 96°C

25 x Annealing 10 s 50°C

Extensie 2 min 60°C

Bewaring ∞ 4°C

5.7.3.3. Sephadex kolomzuivering

Een Sephadex kolom werd aangemaakt volgens onderstaande werkwijze:

- Neem de Multiscreen 45 µl Column loader en de Scraper en plaats op een wit, proper

papier.

- Giet SephadexTM G-50 op de Multiscreen 45 µl Column loader en vul de wells van de

door open te wrijven/ schrapen met behulp van de bijgeleverde Scraper.

- Plaats multiscreen HV plaat op de Multiscreen 45 µl Column loader en draai in een

vlotte beweging om. De SephadexTM G-50 zou in de multiscreen HV plaat moeten

vallen. Tik nog even op de Multiscreen 45 µl Column loader om zeker te zijn dat alles

uit de Multiscreen 45 µl Column loader is overgebracht.

De Sephadex kolom ‘wellen’ werd bekomen door 300 µl gedeïoniseerd water toe te voegen

aan iedere well die men wenst te gebruiken. De kolommen vormden zich door de plaat

gedurende minimum 3 uur en maximum 24 uur afgedekt met EASYseal kleeffolie te laten staan

in de koelkast. De Multiscreen HV plate werd op een 96 well microtiterplaat geplaatst met een

Multiscreen Align Frame Blue er tussenin. Er werd gecentrifugeerd bij 2500 rpm (= 750 x g)

gedurende 5 minuten. Aan ieder sequencingproduct werd 20 µl gedeïoniseerd water

toegevoegd. Vervolgens werd de Multiscreen HV plate op een 96-well PCR-plaat geplaatst en

werd 20 µl van het respectievelijke staal over gepipetteerd op de overeenkomstige Sephadex

kolom in het midden van de well. De platen werden bij 2500 rpm (= 750 x g) gedurende 5

minuten gecentrifugeerd. Aangezien de apparatuur (3500XL) 3 kolommen (24 injecties) per

run gebruikt en omdat de capillairen niet droog mogen staan, werd in de nodige lege cupjes

water toegevoegd. Indien de 96-well PCR-plaat niet onmiddellijk op de sequencer werd

geplaatst, werd de plaat bewaard in de koelkast (2°C tot 8°C). Indien het tijdsinterval langer

dan 24 uur was, werd het in de diepvries (-20°C tot -24°C) bewaard.

Na de run op ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems®) werd de bekomen

sequentie geanalyseerd door het softwareprogramma SeqMan Pro, aangeboden door

DNAstar. De finale sequenties worden verwerkt aan de hand van het BLAST-programma

aangeboden door de website van National Center for Biotechnology Information (NCBI).

53

6. Resultaten en bespreking

6.1. Selectie primers en probes

In deze studie werd voor elk organisme telkens twee primer/probeparen ontworpen met elk

hun specifieke target. De sequenties en details van de hieronder geselecteerde primers en

probes worden niet weergegeven wegens confidentialiteit.

6.1.1. Bartonella spp.

In de literatuur worden voornamelijk het 16S rRNA-gen en de regio tussen het 16S- en

23S rRNA-gen als mogelijke doelwitsequentie beschreven (Johnson et al., 2003) voor het

ontwikkelen van een generische Bartonella PCR. Het ontwikkelen van een PCR-analyse op

basis van deze targets is complex aangezien in deze regio’s van het genoom enige

heterogeniteit bestaat tussen verschillende Bartonella-species. Het zoeken naar

geconserveerde regio’s, eventueel in combinatie met degeneraties in primers en probes, laat

het toe om een generische PCR te ontwikkelen. Edouard et al. (2015) omschrijft de RT-PCR

techniek als een bruikbare, gevoelige, specifieke en snelle tool voor de diagnose van

Bartonella endocarditis op basis van hartklepbiopten, dit in tegenstelling tot de mindere

gevoeligheid indien rechtstreeks op bloed of serum gewerkt wordt.

6.1.2. Bartonella quintana

Michelet et al. (2014) beschrijft het bqtR gen als doelwitsequentie en dient als basis voor de

ontwikkeling van de primers voor de TaqMan RT-PCR. Het bqtR gen werd ook al bij Arvand

et al. (2010) beschouwd als mogelijk target aangezien die regio constant blijft over

verschillende stammen van B. quintana. Uit het onderzoek van Liberto et al. (2013) bleek dat

de ontwikkelde primers voor het bqtR gen zowel B. quintana als B. henselae amplificeren. Een

mogelijke verklaring is dat het bqtR gen van B. quintana homoloog is aan het batR gen van B.

henselae.

Naast bqtR als target werd ook yopP gen omschreven als doelwitsequentie voor amplificatie

van B. quintana (Angelakis et al., 2011; Edouard et al., 2015). In deze studies werden de

regio’s dermate geselecteerd dat de in silico gegenereerd primers species-specifiek waren,

geconfirmeerd met de BLAST-analyse.

6.1.3. Bartonella henselae

Een onderzoek van Michelet et al. (2014) toonde aan dat het pap31 gen als target toelaat om

B. henselae te detecteren. Een ander doelwitsequentie, nl. het gltA gen wordt beschreven door

Klangthong et al. (2015) en Fard et al. (2016). In de laatst genoemde studie gaf slechts 7,14%

van de nagelstalen en 1,42% van de speekselstalen positieve resultaten voor B. henselae.

6.2. Optimalisatie primers en probes aan de hand van uniplex PCR

6.2.1. Functionaliteit primers

In eerste instantie werden de aangekochte primers (5.3, Tabel 7) getest op hun functionaliteit

door gebruik te maken van een RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix. Alle primers

werden aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA Technologies) aan een concentratie van

54

100 μM. Tijdens de RT-PCR-reactie bedroeg de finale concentratie van iedere primer 300 nM.

De test werd in tweevoud uitgevoerd op zowel de Vircell AmpliRun® Bartonella quintana als

Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle (resultaten in Bijlage II, Tabel 30). Het

beoogde resultaat is, per uniplex, het optreden van amplificatie met CT-waarde onder 30 en

zonder indicatie van aspecifieke amplificatie tijdens de smeltcurve-analyse.

Alle primerparen voldoen aan het vooropgestelde doel en gaven een goede amplificatiecurve

(Figuur 19), uitgezonderd voor de primerparen pap31 en gltA waarvoor minstens 50% vals

positieve waarden werden bekomen voor de Vircell AmpliRun® Bartonella quintana.

Om mogelijke fouten uit te sluiten werd er op alle primerparen nogmaals een RT-PCR met

SYBR® Select Mastermix uitgevoerd, ditmaal op een verdunningsreeks van de Vircellcontroles.

Voor uitgebreide resultaten wordt verwezen naar Tabel 31 en Tabel 32 in Bijlage II.

Opnieuw werden goede resultaten bekomen behalve voor de primerparen pap31 en gltA als

de test werd uitgevoerd op Vircell AmpliRun® Bartonella quintana. Opmerkelijk was dat de CT-

waarden voor het primerpaar pap31 ongeveer gelijk waren en rond een gemiddelde waarde

van 38 lagen. Nader onderzoek toonde aan dat de forwardprimer van pap31 een self-dimer

kan vormen, wat mogelijks de reden is van de bekomen vals positieve resultaten. Na het

uitvoeren van een negatieve controle werd vastgesteld dat een CT-waarde van 38,56 werd

bekomen. De bijhorende smelttemperatuur van 73,4°C stemt overeen met de

smelttemperatuur van het primer-dimeer van de forwardprimer. Er werd verondersteld dat het

probleem eventueel opgelost zou worden door gebruikt te maken van een probe in RT-PCR

met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De vals positieve resultaten voor het primerpaar

gltA lag minder voor de hand aangezien de CT-waarden niet overeenstemden. Na enig

opzoekingswerk bleek dat het doelwitsequentie leek op een sequentie van Bartonella

quintana. Met slechts één mismatch in de forwardprimer en twee mismatches in de

reverseprimer kon ook Vircell AmpliRun® Bartonella quintana geamplificeerd worden.

Er kan besloten worden dat de primers bruikbaar zijn voor verdere evaluatie en functioneel zijn

mits verder onderzoek aan de hand van probes. Voor B. henselae gaat de voorkeur uit naar

de primerparen pap31 maar het andere primerpaar wordt nog niet verworpen en wordt

meegenomen in verder onderzoek.

55

Figuur 19: Amplificatie plot van alle primerparen na toepassing van SYBR® Select Mastermix op Vircell AmpliRun®

Bartonella quintana.

6.2.2. PCR-efficiëntie

Per pathogeen werden meerdere primerparen getest op hun functionaliteit. De volgende stap

in het optimalisatieproces was per pathogeen en per target het meest gevoelige en efficiëntste

paar te selecteren. Om de resultaten te evalueren werd rekening gehouden met

vooropgestelde voorwaarden voor meetbereik en lineariteit. Deze voorwaarden zijn:

- Meetbereik: 102-106 kopijen/ml

- Regressiecoëfficiënt R² > 0,95 (over minstens 4 diluties)

- 0,9 ≤ efficiëntie ≤ 1,1

Er werd een zesvoudige verdunningsreeks aangemaakt van de twee Vircellcontroles. Voor

iedere verdunning werden de bekomen CT-waarden geregistreerd (ruwe data Bijlage II, Tabel

31 en Tabel 32) en in functie van log10 van de concentratie grafisch uitgezet. Uit deze

grafische weergave kan de efficiëntie van de betreffende RT-PCR berekend worden, welke

gecorreleerd is met de gevoeligheid van de test (Tabel 20). De efficiëntie wordt berekend aan

de hand van volgende formule:

E = 10(-1/helling) – 1

gltA

pap31

16S-23S RNA

16S rRNA gene

yopP

bqtR

56

Tabel 20: Efficiëntie van ieder primerpaar voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-controle.

groen: voldoet aan de voorwaarde; rood: voldoet niet aan de voorwaarde.

Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA-controle

Bartonella quintana Bartonella henselae

Helling R² E Helling R² E

Bartonella spp.

p715 Bart Fw -3,69 1,00 0,87 -3,81 1,00 0,83

p716 Bart Rv

p718 Bart 16 Fw -3,35 1,00 0,99 -3,42 1,00 0,96

p719 Bart 16 Rv

Bartonella quintana

p721 Bq Yop Fw -3,08 0,99 1,11 - - -

p722 Bq Yop Rv

p724 Bq bqtr Fw -3,67 1,00 0,87 - - -

p725 Bq bqtr Rv

Bartonella henselae

p727 Bh pap Fw - - - -3,71 1,00 0,86

p728 Bh pap Rv

p730 Bh glta Fw - - - -3,72 0,98 0,86

p731 Bh glta Rv

Zowel 16S rRNA gene voor Bartonella spp. als yopP voor B. quintana geeft de gevoeligste en

efficiëntste RT-PCR-resultaten. Voor B. henselae is er nog steeds een probleem van de

forwardprimer die een self-dimer kan vormen bij pap31 waardoor een lage efficiëntie bekomen

wordt. Aan dit primerpaar werd nog een kans gegeven wegens het eventueel wegvallen van

het probleem eens een probe gebruikt zal worden. Het andere primerpaar, nl. gltA, heeft ook

een efficiëntie die afwijkt van de vooropgestelde voorwaarde. Ook de andere primerparen voor

Bartonella spp. en B. quintana, respectievelijk 16S-23S RNA intergenic region en bqtR gaven

geen optimale efficiëntiewaarden.

De overgebleven primerparen, één voor ieder organisme, werden nogmaals onderworpen aan

een RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix maar ditmaal op een verdunningsreeks van

Bartonella-plasmide DNA. Hieruit werden opnieuw een grafische weergave bekomen door de

CT-waarden uit te zetten in functie van log10 van de concentratie. Na efficiëntieberekening kon

geconcludeerd worden dat alle geselecteerde primerparen tussen de opgestelde grenzen

lagen (Tabel 21).

57

Tabel 21: CT-waarden en efficiëntie van de overgebleven primerparen, één voor ieder organisme, op het Bartonella-

plasmide.

groen: goed resultaat/voldoet aan de voorwaarde.

Organisme Naam CT-waarden Parameter

107 106 105 104 103 Helling R² E

Bartonella

spp.

p718 Bart 16 Fw 21,13 24,70 28,49 31,20 35,89 -3,56 0,98 0,91

p719 Bart 16 Rv

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw 21,77 25,13 28,98 31,89 35,15 -3,44 1,00 0,95

p722 Bq Yop Rv

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw 22,62 26,49 30,61 33,19 37,63 -3,44 1,00 0,95

p728 Bh pap Rv

6.2.3. Smeltcurveanalyse

Volgend op de efficiëntiebepaling van de RT-PCR-reactie (6.2.2) werd de smeltcurve

geëvalueerd. Er is een mogelijkheid dat aspecifieke amplificatie optreedt door een afnemende

targetconcentratie ten opzichte van een constante primerconcentratie. Relatief gezien, in een

verdunningsreeks, neemt de primerconcentratie toe ten opzichte van de dalende

targetconcentratie waardoor aspecifieke fragmenten zoals primer-dimeren sneller gevormd

kunnen worden. In deze analyse wordt de amplificatiecurve samen met de respectievelijke

smeltcurve bekeken (Figuur 20 en Figuur 21).

Bij de smeltcurveanalyse van primerpaar pap31 werd al snel een aspecifieke piek opgemerkt

bij 73,5°C voor verdunning 102. Dit bevestigt nogmaals het vermoeden van de forwardprimer

van pap31 die een self-dimer kan vormen.

Figuur 20: Amplificatie plot van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op zesvoudige verdunning

van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.

58

Figuur 21: Smeltcurve van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op zesvoudige verdunning van

Vircell AmpliRun® Bartonella henselae. Er is duidelijk een aspecifieke piek bij 73,5°C voor verdunning 102 wat wijst op het

primer-dimeer.

6.2.4. Specificiteitscontrole

De specificiteit van de primerparen werd getest door gebruik te maken van bacteriële culturen.

Van deze culturen werden 3 mixen aangemaakt met volgende samenstelling:

- Mix 1: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus dysgalactiae

- Mix 2: Escherichia coli, Streptococcus agalactiae

- Mix 3: Acinetobacter, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus

De mixen werden onderworpen aan de RT-PCR met SYBR® Select Mastermix in combinatie

met alle primerparen. De bekomen resultaten zijn terug te vinden in Bijlage III, Tabel 33. De

verwachting bij een zeer specifieke reactie is dat geen amplificatie plaatsvindt in aanwezigheid

van vreemd DNA.

Voor beide primerparen van het organisme B. quintana, nl. yopP en bqtR werd het vreemd

DNA niet geamplificeerd waardoor besloten kan worden dat beide primerparen zeer specifiek

zijn. Ook het primerpaar gltA voldeden aan de specificiteitscontrole maar het primerpaar pap31

vertoonde wel amplificatie bij mix 1. Hierbij viel op dat de CT-waarde 39 is, wat in de buurt ligt

van het reeds bekomen CT-waarden van de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun®

Bartonella quintana (Tabel 31, Bijlage II). Uit verder onderzoek werd vastgesteld dat zowel de

vooraf opgemerkte CT-waarden als het voorval van de amplificatie bij mix 1 eenzelfde

smelttemperatuur van 73°C vertonen. Deze temperatuur stemt namelijk overeen met de

59

smelttemperatuur van het primer-dimer van de forwardprimer. Dit bevestigt nogmaals het

vermoeden van self-dimeervorming als er te weinig target aanwezig is. Verder onderzoek moet

gebeuren en het probleem kan eventueel opgelost worden door gebruik te maken van een

probe.

16S-23S RNA intergenic region vertoont bij elke bacteriële mix amplificatie. Voor target 16S

rRNA gene is dit minder het geval, nl. enkel mix 3 gaf een vals positief resultaat. Dit dient

verder onderzocht te worden en kan eventueel ook met tussenkomst van een probe vermeden

worden.

6.2.5. Functionaliteit probe

Na de eerste optimalisatiestap waarbij SYBR® Select Mastermix werd gebruikt, kon

overgegaan worden naar een verdere optimalisatie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix. Deze mastermix wordt gebruikt voor virale DNA en RNA targets met als gevolg

een hoge gevoeligheid, minder inhibitie en een snellere amplificatierun.

Het toevoegen van een fluorescente probe dient om, in combinatie met de geselecteerde

primers, absolute specificiteit te garanderen. Voor ieder primerpaar, twee per organisme, werd

een probe ontworpen (5.3, Tabel 7) en aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA

Technologies) aan een stockconcentratie van 100 µM. Vanaf deze stap wordt overgeschakeld

op TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix waarbij vaste concentraties voor zowel primers en

probe worden aangehouden, respectievelijk 300 nM en 250 nM. Opnieuw werden de beide

verdunningsreeksen van de Vircell DNA-controles gebruikt (ruwe data Tabel 34 en Tabel 35

in Bijlage IV).

Uit deze preliminaire resultaten kan er voor Bartonella spp. besloten worden dat enkel met

16S rRNA gene verder kan gewerkt worden. Het andere doelwitgen, nl. 16S-23S RNA

intergenic region, gaf goede resultaten voor de beide Vircellcontroles maar gaf een vals positief

resultaat voor de negatieve controle. Bij een tweede maal uitvoeren van de test dook dit

probleem nogmaals op.

Voor Bartonella quintana trad bij doelwitgen bqtR slechts éénmaal amplificatie op. Dit duidt op

slechte gevoeligheid. Bij doelwitgen yopP werd eenzelfde gevoeligheid bekomen als voor

doelwitgen 16S rRNA gene bij Bartonella spp. waaruit besloten kan worden dat de probe zorgt

voor een goede gevoeligheid van de test.

Als laatste werden de resultaten van Bartonella henselae geanalyseerd en werd geconstateerd

dat doelwitgen pap31 ongeveer 100x gevoeliger is dan doelwitgen gltA.

Vervolgens werd opnieuw per pathogeen en per target de meest gevoelige en efficiëntste

primers-probe geselecteerd door de resultaten te evalueren. Hierbij werd rekening gehouden

met vooropgestelde voorwaarden voor meetbereik en lineariteit:




60

Net zoals in 6.2.2 werd aan de hand van een verdunningsreeks van de twee Vircell DNA-

controles de efficiëntie berekend. De bekomen CT-waarden (Bijlage IV, Tabel 34 en Tabel 35)

voor iedere verdunning werd in functie van log10 van de concentratie grafisch uitgezet waarbij

de efficiëntie werd berekend (Tabel 22) aan de hand van de reeds gegeven formule:

E = 10(-1/helling) – 1

Tabel 22: Efficiëntie van ieder primers/probe voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-controle.

groen: voldoet aan de voorwaarde; rood: voldoet niet aan de voorwaarde.

Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA-controle


Helling R² E Helling R² E

Bartonella spp.

p715 Bart Fw

-2,05 0,86 2,07 -2,63 0,97 1,40 p716 Bart Rv

p717 Bart Pr

p718 Bart 16 Fw

-3,62 1,00 0,89 -3,66 1,00 0,88 p719 Bart 16 Rv

p720 Bart 16 Pr

Bartonella quintana

p721 Bq Yop Fw

-3,32 0,94 1,00 - - - p722 Bq Yop Rv

p723 Bq Yop Pr

p724 Bq bqtr Fw

Niet voldoende

data - - - p725 Bq bqtr Rv

p726 Bq bqtr Pr

Bartonella henselae

p727 Bh pap Fw

- - - -3,88 1,00 0,81 p728 Bh pap Rv

p729 Bh pap Pr

p730 Bh glta Fw

- - - Niet voldoende

data p731 Bh glta Rv

p732 Bh glta Pr

Uit de resultaten kan besloten worden dat met de primers/probe van zowel bqtR als gltA niet

kan verder gewerkt worden in het validatieplan aangezien de bekomen data van die mate zijn

dat er geen efficiëntie kan berekend worden. De efficiëntie van het doelwitgen yopP is in

vergelijking met de vorige berekeningen (Tabel 20) verbeterd. De efficiëntie van het doelwitgen

pap31 geeft na vergelijking ongeveer hetzelfde resultaat.

Voor Bartonella spp. is duidelijk dat er geen betrouwbare waarde voor de efficiëntie aanwezig

is bij 16S-23S RNA intergenic region.

Om de volledigheid van de optimalisatie te bekomen werden, net zoals in 6.2.2, de

primers/probe van 16S rRNA gene, yopP en pap31 opnieuw onderworpen aan een test met

de TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix, maar dit maal werd een verdunningsreeks van

Bartonella-plasmide DNA gebruikt en werd in tweevoud uitgetest. Na efficiëntieberekening

(Tabel 23) werden de resultaten vergeleken met de efficiëntieresultaten van Tabel 21 waaruit

bleek dat de efficiëntie nog beter is door gebruik te maken van een probe voor detectie.

61

Tabel 23: Gemiddelde CT-waarden en efficiëntie van de primers/probe, één voor ieder organisme, op het Bartonella-

plasmide.

groen: goed resultaat/voldoet aan de voorwaarde.

Organisme Naam CT-waarden Parameter

107 106 105 104 103 Helling R² E

Bartonella

spp.

p718 Bart 16 Fw

21,47 25,21 28,19 31,06 35,53 -3,40 0,99 0,97 p719 Bart 16 Rv

p720 Bart 16 Pr

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw

20,88 24,49 27,63 31,05 34,47 -3,37 1,00 0,98 p722 Bq Yop Rv

p723 Bq Yop Pr

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw

21,71 25,48 28,52 31,68 35,31 -3,34 1,00 0,99 p728 Bh pap Rv

p729 Bh pap Pr

6.2.6. Specificiteit probe

De specificiteitscontrole gerelateerd aan de tussenkomst van de probes werd op dezelfde

manier getest als deze van de primers. De drie bacteriële mixen aangehaald in 6.2.4 werden

onderworpen aan TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De bekomen resultaten zijn

opgenomen in Bijlage V, Tabel 36.

Voor de beide primers/probe van zowel B. quintana als B. henselae trad geen amplificatie op

bij de bacteriële mixen. Dit lost de verwachting van een zeer specifieke reactie in, ook in

aanwezigheid van vreemd DNA. Ook is op te merken dat voor pap31 geen vals positief

resultaat meer te bespeuren is bij zowel de negatieve controle als mix 1. Dit duidt op het

wegvallen van het eerder vastgestelde probleem toen enkel primers gebruikt werden. De

primer-dimeren zijn waarschijnlijk nog aanwezig maar worden niet gedetecteerd door de

probe, in tegenstelling tot de toepassing met SYBR® Select Mastermix. De probe kan het

primer-dimeer omzeilen zodat de test een hogere specificiteit vertoont.

16S-23S RNA intergenic region geeft, in vergelijking met de specificiteitscontrole met SYBR®

Select Mastermix (6.2.4), enkel een vals positief resultaat bij mix 2. Een groter probleem stelt

zich bij 16S rRNA gene waarbij zowel bij mix 1 als mix 3 een vals positief resultaat opduikt,

wat in tegenstrijd is met de specificiteitscontrole met SYBR® Select Mastermix (6.2.4). Nader

onderzoek wees uit dat een verhoging van de threshold van 0,05 naar 0,225 het probleem van

de vals positieve resultaten van mix 1 en mix 3 wegwerkt. Figuur 22 toont aan dat bij een

threshold van 0,225 mix 1 en mix 3 niet meer gedetecteerd worden maar de positieve controle

wel nog stand houdt. Figuur 23 benadrukt het belang van het bekijken van de multicomponent

plot om mogelijke aspecifieke amplificatie uit te sluiten, die makkelijk te onderscheiden is van

de positieve controles door hun lage ΔRn. Deze vaststellingen dienen meegenomen te worden

in het verder onderzoek.

62

Figuur 22: Verschil tussen de amplificatie plot van 16S rRNA gene op mix 1 en 3 en positieve Vircellcontrole.

A: Amplificatie plot van 16S rRNA gene als de threshold zoals anders op 0,05 wordt gehouden. B: : Amplificatie plot van 16S

rRNA gene met een verhoogde threshold naar 0,225.

Figuur 23: Multicomponent plot van de target 16S rRNA gene op de positieve Vircellcontrole, negatieve controle en

bacteriële mix 1-3.

6.2.7. Primer/probeselectie

Op basis van de voorgaande testen werd per organisme een verdere selectie doorgevoerd. Er

werd telkens één primerpaar met respectievelijke probe aangewezen als beste methode om

multiplex op toe te passen.

Aangezien het primerpaar van de doelwitsequentie 16S-23S RNA intergenic region bij de

specificiteitscontrole voor alle bacteriële mixen vals positieve resultaten gaf en dit probleem

niet werd opgelost door tussenkomst van een probe, werd dit paar verworpen om nog verdere

testen mee uit te voeren. Bartonella spp. zal door het primerpaar en de probe van het target

A B

Positieve

Vircellcontrole

Mix 1

Mix 3

Mix 2

Negatieve controle

63

16S rRNA gene gedetecteerd kunnen worden mits verder onderzoek in verband met de

specificiteit.

Voor B. quintana kan geconcludeerd worden dat het primerpaar en de probe yopP behouden

wordt gezien betere efficiëntie dan het primerpaar en de probe bqtR. Er werd voor

primers/probe bqtR geen efficiëntie teruggevonden door te weinig betrouwbare data wat wijst

op lage gevoeligheid.

Als laatste werd voor B. henselae het primerpaar pap31 uitgekozen. De veronderstelling dat

het probleem van self-dimer opgelost zou worden door een probe te gebruiken, werd

bevestigd. Het andere primerpaar, nl. gltA, gaf vals positieve waarden voor Vircell AmpliRun®

Bartonella quintana en dit kon niet opgelost worden met tussenkomst van een probe. Ook de

efficiëntie van primers/probe kon niet berekend worden door een gebrek aan resultaten wat

wijst op lagere gevoeligheid.

Samengevat, wordt mee verder gewerkt:

- Uniplex 16S rRNA gene voor de detectie van Bartonella spp.

- Uniplex yopP voor de detectie van B. quintana

- Uniplex pap31 voor de detectie van B. henselae

6.3. Multiplex PCR

Om de reactie- en detectiesnelheid op te drijven, werden de geselecteerde primers en probe

per organisme onderworpen aan een multiplex RT-PCR setting. Dit betekent dat de uniplex

RT-PCRs samen worden genomen tot twee, drie of zelfs vier testen in één PCR-reactie. Er

werd tijdens het onderzoek, naast de geselecteerde uniplex RT-PCRs, gebruik gemaakt van

een reeds gevalideerde interne inhibitie- en amplificatiecontrole, nl. SHV.

In dit onderzoek werd geopteerd om twee duplex RT-PCRs toe te passen aangezien triplex of

quadruplex vermoedelijk interferentie met zich mee zou brengen. M.a.w. het zou een te

complexe optimalisatie inhouden met een hogere kans op onderlinge interactie van de primers.

Er werd gewerkt met een generische RT-PCR voor algemene gevoelige detectie van 16S

rRNA gene gecombineerd met SHV als detectie van de interne controle. Als tweede duplex

RT-PCR werd een species-specifieke methode toegepast door zowel pap31 als yopP in één

reactie te verwerken. De beide duplex RT-PCRs moeten elkaar confirmeren voordat een

conclusie kan getrokken worden.

Vanaf dit onderdeel wordt de duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV vaak besproken als

“generische RT-PCR” terwijl aan de duplex RT-PCR yopP en pap31 de term “specifieke RT-

PCR” wordt gegeven.

6.3.1. Efficiëntievergelijking

Om de efficiëntie van de duplex RT-PCRs te vergelijken met deze van de respectievelijke

uniplex RT-PCR (Tabel 23), wordt voor iedere duplex RT-PCR een verdunningsreeks van

Bartonella-plasmide DNA onderworpen aan de TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De

ruwe data van de bekomen CT-waarden voor iedere duplex RT-PCR zijn opgenomen in Bijlage

VI (Tabel 37). Tabel 24 geeft een vergelijkende studie van de efficiëntie bekomen door uniplex

64

en duplex RT-PCR. Ook hier werd rekening gehouden met vooropgestelde voorwaarden voor

meetbereik en lineariteit:




De efficiëntie werd berekend aan de hand van de formule:

E = 10(-1/helling) – 1

Tabel 24: Efficiëntie van zowel de duplex RT-PCRs als de primers/probe, één voor ieder organisme uitgevoerd met

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op het Bartonella-plasmide.

Duplex RT-PCR Uniplex RT-PCR

Generisch Specifiek

Bartonella spp. B.

quintana

B.

henselae

Bartonella

spp.

B.

quintana

B.

henselae

Helling -3,23 -3,31 -3,23 -3,40 -3,37 -3,34

R² 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00

E 1,04 1,01 1,04 0,97 0,98 0,99

Er is duidelijk een gelijkaardige efficiëntie als er duplex RT-PCR wordt toegepast t.o.v. de

aparte uniplex RT-PCRs, ook al gaven deze PCRs reeds de gewenste efficiëntieresultaten

binnen de afgesproken grenzen. Er wordt in de moleculaire diagnostiek steeds gestreefd naar

de efficiëntste en gevoeligste methode om organismen te detecteren. Hierbij kan besloten

worden dat het toepassen van de beide duplex RT-PCRs een geschikte, gecombineerde test

is om zowel op generiek als op species-specifiek niveau organismen op te sporen.

6.4. Validatie duplex PT-PCR

Om beide duplex RT-PCRs te integreren in de dagdagelijkse routine van het AZ Sint-Jan te

Brugge, dient er een intensieve validatie uitgevoerd te worden. Elke parameter van het

validatieplan moet behandeld en besproken worden vooraleer de test kan opgenomen worden

in het ziekenhuis.

6.4.1. Limit of detection (LOD)

De detectielimiet of “Limiet of detection” (LOD) wordt gedefinieerd als de laagste concentratie

van een stof die kan onderscheiden worden van de afwezigheid van die component (blanco)

binnen een 95% betrouwbaarheid. M.a.w. de concentratiegrens waaronder de component niet

meer betrouwbaar kan gemeten worden. De verdunningsreeks van de Vircell AmpliRun®

Bartonella quintana en de Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle werd 20 maal

uitgevoerd met beide duplex RT-PCRs. Minstens 19 van de 20 keer (95%) dient er amplificatie

op te treden waarbij de LOD ligt tussen de verdunningen waar dit wel, en niet meer het geval

is.

65

Tabel 25 geeft per Vircellcontrole en bijhorende duplex RT-PCR het resultaat aan aanwezige

amplificatie weer. Van iedere verdunning werd de concentratie omgerekend naar aantal

kopieën/ml staal.

Tabel 25: Grove bepaling LOD. Groen is de aanvaardbare amplificatiegrens. Rood duidt op niet voldoende

amplificatiepercentage.

Generische RT-PCR

Concentratie (kopieën/ml)

10563 5281 2113 1056 528 106


DNA control 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 14/20


DNA control 20/20 20/20 17/20 16/20 6/20 5/20

Specifieke RT-PCR


DNA control 20/20 20/20 16/20 6/20 4/20 1/20


DNA control 20/20 19/20 12/20 11/20 8/20 0/20

Hieruit kan besloten worden dat de generische PCR ongeveer een factor 10 gevoeliger is dan

de specifiek PCR voor de detectie van B. quintana en dit verschil in gevoeligheid is minder

uitgesproken voor de detectie van B. henselae. Deze verhoogde gevoeligheid wordt

toegeschreven aan de detectie van het 16S rRNA gen in de generische PCR, die multicopy is

ten opzichte van de specifieke PCR van het yopP gen en het pap31 gen, respectievelijk voor

de detectie van B. quintana en B. henselae. Bij AmpliRun® Bartonella henselae DNA control

is er op het eerste zicht geen duidelijk onderscheid tussen de twee duplex RT-PCRs. Er is wel

een daling in aantal positieve testen als de specifieke PCR yopP en pap31 wordt toegepast.

De LOD voor de detectie van B. quintana aan de hand van de generische duplex RT-PCR 16S

rRNA gene en SHV ligt tussen 528 en 106 kopieën/ml terwijl voor de detectie van B. henselae

ligt de LOD tussen 5281 en 2113 kopieën/ml.

Voor de specifieke duplex RT-PCR yopP en pap31 werd voor de twee targetgenen dezelfde

LOD bekomen, nl. tussen 5281 en 2113 kopieën/ml.

Uit deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de generische RT-PCR een algemeen

globale techniek is om Bartonella spp. op te sporen met SHV als interne controle. De specifieke

RT-PCR is een verdere discriminatie van twee species met een gelijke gevoeligheid voor beide

targetgenen. Deze tweede duplex RT-PCR is minder gevoelig dan de eerste maar wel

specifieker voor de te detecteren doelwitsequentie, en zal dus voornamelijk species-

identificatie als doel hebben.

6.4.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid

Vier klinische stalen (klierweefsel, wondvocht en e-swab) positief voor Bartonella henselae

werden gemengd en gehomogeniseerd in één enkele tube. Hiervan werd een

66

verdunningsreeks aangemaakt (5.6.3, Tabel 12) en elke verdunning werd met de matrix Liquid

Amies medium (e-swab) vijfmaal onderworpen aan de beide duplex RT-PCRs. Iedere

verdunning werd drie keer binnen eenzelfde run doorgevoerd (herhaalbaarheid, intrarun) en

twee keer herhaald in twee bijkomende runs (reproduceerbaarheid, interrun). Ruwe data

beschikbaar in Bijlage VII, Tabel 38. Het doel is de variatie op de verschillende resultaten te

bepalen. De variatie, bepaald aan de hand van de variatiecoëfficiënt %CV, mag voor

herhaalbaarheid niet meer dan 5% bedragen en voor reproduceerbaarheid niet meer dan 10%.

De formule voor de variatieberekening is:

%CV = 100 * 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑡𝑖𝑒

𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒

De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per verdunning en per RT-PCR worden samen

met bijhorende standaarddeviatie (stdev) en variatiecoëfficiënt samengevat in Tabel 26.

Aangezien de klinische stalen om de verdunningsreeks S0 tot S4 aan te maken enkel

Bartonella henselae bevatten, werd geen amplificatie gevonden voor Bartonella quintana. Voor

dit targetgen werd geen CT-waarden gevonden en werd dus bijgevolg ook niet opgenomen in

de tabel.

Tabel 26: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald a. d. h. v. de variatiecoëfficiënt (%CV).

Gem = gemiddelde waarde; een streepje duidt op niet gedetecteerde amplificatie waardoor geen resultaat gevonden werd.

Generische RT-PCR

Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid

S0 S1 S2 S3 S4 S0 S1 S2 S3 S4

Bartonella spp.

Gem 27,38 32,17 33,87 35,93 39,14 27,34 32,10 33,98 36,31 39,54

Stdev 0,09 0,38 0,40 0,61 1,20 0,22 0,30 0,46 0,68 1,09

%CV 0,34 1,19 1,17 1,69 3,06 0,80 0,95 1,34 1,86 2,77

SHV

Gem 28,78 29,21 29,65 29,74 29,94 28,73 29,23 29,82 30,04 30,24

Stdev 0,14 0,30 0,34 0,37 0,43 0,14 0,22 0,35 0,49 0,54

%CV 0,49 1,03 1,14 1,24 1,43 0,48 0,75 1,18 1,63 1,79

Specifieke RT-PCR

Bartonella henselae

Gem 29,01 33,58 35,72 37,83 - 28,96 33,70 35,66 38,04 -

Stdev 0,08 0,34 0,45 0,56 - 0,22 0,35 0,48 0,65 -

%CV 0,29 1,02 1,27 1,47 - 0,77 1,04 1,34 1,71 -

Zowel voor herhaalbaarheid als reproduceerbaarheid blijven de bekomen waarden onder de

vooraf opgestelde percentages. Dit wijst op een goede test wat betreft de validatiecriteria

herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Er werd opgemerkt dat een hogere

verdunningsgraad gepaard gaat met een stijgende %CV.

67

6.4.3. Juistheid

De term juistheid wordt gedefinieerd als de mate van overeenstemming van een gemeten of

berekende hoeveelheid naar de werkelijke waarde en kan aan de hand van analyses van

referentiemateriaal geschat worden.

Om de juistheid van de test te bepalen wordt verondersteld een kwaliteitscontrole uit te voeren.

Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) heeft geen dergelijke controles voor

Bartonella ter beschikking. Als alternatief werden vijf reeds positief geteste stalen en vier

Bartonella DNA-extracten van AZ Sint-Lucas aan de test onderworpen. De resultaten (Bijlage

I, Tabel 28) hiervan bevestigden de positieve resultaten.

Om het matrix geïnduceerd effect te onderzoeken werd een mix gemaakt van verschillende

klinische stalen positief voor Bartonella henselae. Deze werd verdund (5.6.3, Tabel 12) en

gespiked met verschillende matrixen en vervolgens geëxtraheerd met het complex 800

protocol van de QiaSymphony SP (behalve voor bloed werden 2 extractieprotocollen

toegepast). De betreffende matrixen zijn: Liquid Amies medium (e-swab), lumbaal vocht (LV),

etter (pus1, pus2, pus3), volbloed geëxtraheerd met protocol complex 800 (VB1), volbloed

geëxtraheerd met DNA blood 200 protocol (VB0,2), gewrichtsvocht (GV1, GV2), klierweefsel

met 106 cellen/cm3 (kl106) en klierweefsel met 105 cellen/cm3 (kl105). De CT-waarden werden

vergeleken met deze van een referentie, nl. de doorverdunning van de mix met 1x TE-buffer.

Tabel 39 en Tabel 40 in Bijlage VIII geven de ruwe data en de vergelijkende CT-waarden voor

beide duplex RT-PCRs weer. Aangezien opnieuw gewerkt werd met de verdunningsreeks S0

tot S4 zal voor Bartonella quintana geen resultaat gevonden worden. Voor dit targetgen

werden de resultaten niet opgenomen in de tabel.

Er kan geconcludeerd worden of er inhibitie optreedt ten gevolge van de gekozen matrix.

Inhibitie treedt op als het verschil in CT-waarden groter is dan 3. Bij het overlopen van de

resultaten wordt rekening gehouden met het feit dat een verschil van 3 CT-waarden

overeenstemt met één logaritme van de concentratie, m.a.w. een staal dat tien keer meer

verdund is.

Bij de eerste duplex RT-PCR treedt voor matrixen e-swab, lumbaal vocht en de twee

klierverdunningen weinig opvallende variatie op zowel bij 16S rRNA gene als target als bij de

interne controle SHV. De gevoeligheid is echter erg gedaald als er gebruik wordt gemaakt van

de andere matrixen. De drie etter/pusmixen wegen hierbij het zwaarst door qua interfererende

matrix, wat eventueel te wijten is aan achtergrond ten gevolge van een grote hoeveelheid

inhiberende substanties zoals bijvoorbeeld dode weefselcellen, witte bloedcellen en bacteriën.

Bij de twee gewrichtsvochten werd een verschil waargenomen van bijna 2 CT-waarden. Dit

kan toe te schrijven zijn aan het verschil in samenstelling, kleur en consistentie, van de

gebruikte klinische stalen. GV1 was een geel etterig vocht met bloedklonters en GV2 was een

dieprood vocht (mogelijks afkomstig van een traumatische punctie of van haemarthros ter

hoogte van het gewricht).

68

Bij de tweede duplex RT-PCR is er een duidelijke reductie van de sensitiviteit. Bij alle matrixen,

uitgezonderd e-swab, wordt bijna geen amplificatie meer waargenomen. Er kan eenzelfde

uitleg aan gegeven worden als reeds beschreven voor de eerste RT-PCR.

Er is een duidelijke verschil in het matrix geïnduceerd effect tussen de beide duplex RT-PCRs.

Er kan vastgesteld worden dat de species-specifieke RT-PCR meer inhibitie ondervindt door

de gebruikte matrixen dan de generische RT-PCR.

Over het algemeen is e-swab met Liquid Amies medium de beste methode om stalen te nemen

waarbij geen matrix geïnduceerd effect is aangetoond. Ook klierweefsel kan gebruikt worden

aangezien er geen uitgesproken probleem opduikt. Er moet echter wel voor RT-PCR yopP en

pap31 rekening gehouden worden met een kleine daling in gevoeligheid. Er wordt actueel

weinig aandacht besteedt aan de verminderde sensitiviteit van de PCR in volbloed als matrix

aangezien detectie van Bartonella spp. op volbloed weinig gebruikt wordt door de clinici. In

West-Europa, en zeker in de regio West-Vlaanderen worden we meestal geconfronteerd met

B. henselae infecties. Meestal confirmeert men het klinisch vermoeden daarvan aan de hand

van een combinatie van serologische bepaling van anti-Bartonella antistoffen en een PCR-

analyse op punctievocht (afkomstig van adenopathie of abces). Het grootste probleem bevndt

zich ter hoogte van de matrix etter/pus. Aangezien pusvorming een veel voorkomend

symptoom is, wordt verondersteld dat deze matrix een goede indicatie is voor het vaststellen

van de ziekte. Uit de resultaten van het onderzoek blijkt echter dat er inhibitie optreedt en de

bacterie niet gedetecteerd wordt ook al is die aanwezig. Als dit het geval is, kan het staal 10x

verdund en vervolgens hertest worden in de hoop dat de inhiberende substanties tevens

voldoende gedilueerd zijn opdat de PCR-reactie toch adequaat kan opgaan. Een andere

mogelijke oplossing is het gebruik van een e-swab die men aanbrengt in de geïnfecteerde

zone.

6.4.4. Klinische stalen

Er werden klinische stalen van het AZ Sint-Jan te Brugge onderworpen aan de nieuwe

methode. Tabel 29 (Bijlage I) geeft een overzicht van het soort staalmateriaal met de

bijhorende klinische interpretatie en het respectievelijke resultaat van de RT-PCRs. Het is

belangrijk dat er een juiste correlatie wordt vastgesteld tussen de klinische interpretatie en de

conclusie van de RT-PCR. Hieronder worden de stalen kort besproken.

Voor staal 2732302 (vocht leverabces) werd de test aangevraagd ter uitsluiting van een

Bartonella infectie wat klopt met de kliniek. Voor patiënt 2504065 (longbiopt) bleek achteraf

gezien meest waarschijnlijk dat de serologische handtekening van voorgaande Bartonella

infectie ging over een doorgemaakt probleem en klinisch perfect compatibel was met een

atypische Mycobacteriële infectie met B-symptomen. Beide kiemen werden echter wel volledig

behandeld. De aanvraag voor patiënt 2663842 (klierweefsel) diende enkel ter uitsluiting van

bartonellose. Uit de resultaten (2209798, 2273998, 2399868, 2521239) kon ook besloten

worden dat serum van de patiënt met chronische bartonellose (2293890) geen ideale matrix

is om B. henselae, die intracellulair voorkomt in RBC, te detecteren. Dit duidt het belang aan

van de correcte staalname en matrix. Staal 2740200 (volbloed) geeft een negatief resultaat

69

maar is B. henselae positief op de punctie (2749731), wat wijst op een weinig gevoelige matrix

als volbloed wordt gekozen. Als laatste is staal 2742003 een complex geval aangezien er een

onzeker PCR-resultaat was voor B. henselae, maar kon zonder differentiatie en met de juiste

kliniek wel behandeld worden als B. henselae.

6.4.5. Specificiteit

Voor de validatie werd nagegaan of kruiscontaminatie optreedt met andere mogelijke klinische

pathogenen. Zowel de aangemaakte bacteriële mixen als andere organismen aanwezig in

klinische stalen (5.6.4, Tabel 13) werden aan een interferentiestudie onderworpen. Ruwe data

zijn terug te vinden in Tabel 41 in Bijlage IX.

Voor de bacteriële mixen (mix1-mix3) werden geen vals positieve reacties gedetecteerd

behalve bij duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV werd voor mix 1 en mix 3 amplificatie

waargenomen. Deze twee mixen werden nogmaals in drievoud uitgevoerd alsook de

bacteriële culturen apart (Bijlage IX, Tabel 42). Als resultaat werd bij geen enkele mix of aparte

cultuur amplificatie vastgesteld.

Een ander probleem stelde zich bij Human herpesvirus 6 (HHV-6) waarbij voor beide duplex

RT-PCRs een vals positief resultaat werd bekomen. Uit verder onderzoek (Bijlage IX, Tabel

42), van zowel vijftal herhalingen van de HHV-6 als vier klinische HHV-6-stalen, bleek dat er

geen amplificatie meer optrad bij duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV en slechts 1/9 keer

werd een vals positief resultaat bekomen bij duplex RT-PCR yopP en pap31. Deze laatste

vaststelling dient verder onderzocht te worden binnen het AZ Sint-Jan.

Voor adenovirus, dat een vals positief resultaat gaf voor duplex RT-PCR 16S rRNA gene en

SHV, werd de amplificatie plot met respectievelijke multicomponent curve bekeken en

vergeleken met het Bartonella-plasmide (105) (Figuur 24). Er werd vastgesteld dat slechts een

zeer zwak signaal gedetecteerd wordt t.o.v. de positieve controle en het vals positief resultaat

niet bevestigd wordt door de species-specifieke duplex RT-PCR. Hierdoor kon het vals positief

resultaat verwaarloosd en als negatieve amplificatie beschouwd worden.

A B

70

Figuur 24: Verschil tussen de amplificatie plot en de multicomponent plot van beide duplex RT-PCRs voor adenovirus

en positieve controle Bartonella-plasmide (105). A: amplificatie plot van de duplex RT-PCRs voor adenovirus. B: amplificatie

plot van de duplex RT-PCRs voor de positieve controle Bartonella-plasmide (105). C: multicomponent plot van de duplex RT-

PCRs voor adenovirus. D: multicomponent plot van de beide duplex RT-PCRs voor de positieve controle Bartonella-plasmide

(105).

(Legende multicomponent plot: rood=ROX; roze=CY5; geel=ABY; blauw=FAM)

6.4.6. Bewaarcondities monstermateriaal

De bedoeling van deze onderzoekstap is het nabootsen van de verschillende transport- en

bewaarcondities die stalen kunnen ondergaan alvorens ze in het labo van AZ Sint-Jan

belanden om zo de mogelijke variatie in resultaten, voor deze verschillende condities, na te

gaan. Er werd een staalflow voor interne en externe stalen nagebootst volgens Tabel 14

(5.6.5). Interne routine binnen AZ Sint-Jan Brugge omvat staalafname, transport naar centrale

receptie bij kamertemperatuur, ontvangst in core labo waar het klinisch monster in een grote

koelkast zal geplaatst worden (2-8°C) en vervolgens ontvangst op labo moleculaire

microbiologie, verdeling van het staal, één deel in archief bij -20°C, ander deel extraheren. Als

de extractie de dag zelf nog zal plaatsvinden dan wordt het staal bewaard in de koelkast, zo

niet wordt het in de diepvries bewaard. Er werd opnieuw gewerkt met de verdunning van de

aangemaakte mix (5.6.3, Tabel 12) gespiked met Liquid Amies medium (e-swab) en

gewrichtsvocht (GV2), aangezien gebleken is dat er bij deze matrixen geen inhibitie optreedt.

Uit de algemene resultaten (Bijlage X, Tabel 43) kan geconcludeerd worden dat er geen

problemen opduiken bij de verschillende, meest voorkomende bewaarcondities.


Aan de hand van 16S rRNA-gensequenering kon de identificatie van Bartonella uitgevoerd

worden. De specifieke amplificatie van het 16S rRNA-gen maakt het mogelijk om, na controle

via agarosegelelektroforese, het fragment van 774 bp te sequeneren.

Er werd gewerkt volgens de reeds aanwezige, gevalideerde SOP van het AZ Sint-Jan. In dit

onderzoek werden zowel de positieve Vircell DNA-controles als klinische stalen gebruikt als

templatemateriaal. Het staalmateriaal was abcesvocht op e-swab (staal 1), lymfeklierpunctie

(staal 2), e-swab (staal 3) en spuit abcesvocht lymfadenitis (staal 4). Als positieve controle

werd Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle gebruikt.

Het resultaat na amplificatie en controle door gelelektroforese wordt weergegeven in Figuur

25. Door het gebruik van een 100 bp ladder kon de grootte van de verkregen banden geschat

worden. Voor alle positieve stalen werd een lengte tussen 700 en 800 bp bekomen, behalve

C D

71

voor staal 2 wat wijst op onvoldoende geamplificeerd DNA om mee verder te werken. De

geanalyseerde lengtes stemmen overeen met de gebruikte forward- en reverse primer (140-

27F en 141-801R) die een fragment van 774 bp genereren. Voor staal 3 en 4 zijn de bandjes

minder helder dan voor staal 1 en de positieve controle (PC), hier Vircell AmpliRun® Bartonella

henselae DNA-controle. Hoe helder de band, hoe meer geamplificeerd fragment-DNA

aanwezig is in het PCR-product. Een blanco wordt bij iedere run meegenomen om te

controleren of er geen contaminatie optrad. Uit dit resultaat zijn er bij de blanco geen bandjes

zichtbaar en is er dus nergens contaminatie opgetreden.

Figuur 25: Controle PCR-amplificatie via agarosegelelektroforese.

Ladder = EZ loadTM 100 bp PCR Molecular Ruler, Bio-Rad; NC = negatieve controle; PC = Vircell AmpliRun® Bartonella henselae

DNA-controle.

6.5.1. Identificatie m.b.v. 16S rRNA sequenering

Na PCR-amplificatie en controle via gelelektroforese kunnen de positieve

amplificatieproducten onderworpen worden aan een opzuiveringsproces met ExoSAP-IT.

Nadat de DNA-sequentiereactie uitgevoerd is, vindt een volgende opzuivering plaats aan de

hand van SephadexTM G-50 superfine. Met behulp van capillaire elektroforese werden de

fragmenten gescheiden en geanalyseerd.

De output van het programma DNA Sequencing Analysis Software (Applied Biosystems®)

genereert de pieken die geanalyseerd werden in de ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied

Biosystems®). Ook in het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar) worden dezelfde pieken

weergegeven. Een voorbeeld van zo’n piekenpatroon wordt voorgesteld in Bijlage XI, Figuur

27. Elke piek heeft een bepaalde kleur eigen aan het nucleotide. Deze vaste kleurencode is

over heel de wereld gelijk en wordt door iedere wetenschapper begrepen. Dit werd ook

uitgevoerd voor de verschillende Bartonella-stalen en de positieve controle Vircell AmpliRun®

Bartonella henselae DNA.

72

Soms was een grote piek te zien op het piekenpatroon wat wijst op een dNTP-piek (Figuur

26). Dit kan enkel voorvallen als een slechte opzuivering met SephadexTM G-50 superfine heeft

plaats gevonden. Als het staal niet precies in het midden van de kolom wordt gepipetteerd,

dan kunnen dNTPs langs de zijkant van de kolom in het te sequeneren welletje komen. Vaak

zijn de pieken van de nucleotiden van deze mate dat er toch een sequentievolgorde met

voldoende zekerheid kan bekomen worden.

Figuur 26: Het voorvallen van een dNTP-piek, grote roze piek, tijdens het sequeneren.

Resultaten bekomen na het uitvoeren van een BLAST op de finale sequentie zijn weergegeven

in Tabel 27 (ruwe data in Bijlage XII). De geanalyseerde lengtes zijn korter dan de

amplificatielengte (774 bp) aangezien de primerlengtes en de onbetrouwbare uiteinden van de

sequentie achterwege werden gelaten. Over het algemeen wordt met zekere betrouwbaarheid

de juiste identificatie bekomen voor alle stalen en de positieve controle Vircell AmpliRun®

Bartonella henselae DNA.

Tabel 27: Overzicht BLAST-analyse van de finale sequentie van de stalen en positieve controle.

Naam Species Sequentie-

lengte (bp)

BLAST

identificatie

Identiteits-

score (%)

Staal 1 (2749731) B. henselae 716 B. henselae 99

Staal 2 (2742003) Bartonella spp. - - -



PC B. henselae 665 B. henselae 100

73

Algemeen besluit

Ter validatie van een multi-target real-time PCR voor de detectie en differentiatie van

Bartonella species konden vier grote fasen in het onderzoek onderscheiden worden. De

uniplex evaluatie met SYBR® Select Mastermix van de verschillende ontwikkelde primers,

gevold door de evaluatie van de primer-probe mix aan de hand van de TaqMan® Fast Virus 1-

Step Mastermix. In een derde fase werd de reactie- en detectiesnelheid opgedreven door het

samenstellen van twee duplex real time PCRs, een generische en species-specifieke duplex

RT-PCR, gevolgd door een intensieve validatie van deze laatste. Tot slot werd de typering van

het organisme onderzocht aan de hand van 16S rRNA sequenering.

Bij de aanvang van het project werden per organisme, Bartonella henselae en Bartonella

quintana, twee paar primerparen ontworpen die werden getest op hun functionaliteit,

specificiteit en gevoeligheid door gebruik van het niet-specifieke label SYBR® Green.

Aan de hand van TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix werden de respectievelijke probes

getest op functionaliteit en specificiteit. Hierbij werd voor de detectie van Bartonella spp. enige

niet verklaarbare en niet herhaalbare kruisreactie waargenomen met een zwak

fluorescentiesignaal tijdens amplificatie. Deze vaststelling benadrukt het belang van het

bekijken van de multicomponent plot om mogelijke aspecifieke amplificatie uit te sluiten. Na

deze evaluatiestap konden per organisme een primerpaar met respectievelijke probe

geselecteerd worden, nl. uniplex 16S rRNA gene voor de detectie van Bartonella spp., uniplex

yopP voor de detectie van B. quintana en uniplex pap31 voor de detectie van B. henselae.

Vervolgens werd er gewerkt met twee duplex RT-PCRs, nl. een generische en species-

specifieke PCR, die geëvalueerd werden in combinatie met de TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix. Naast de geselecteerde uniplex RT-PCRs werd gebruik gemaakt van een reeds

gevalideerde interne controle PCR die Phocine herpesviris-1 detecteert, toegevoegd aan ieder

monster gedurende extractie. De generische duplex RT-PCR voor algemene gevoelige

detectie van Bartonella species a.d.h.v. 16S rRNA gene werd gecombineerd met SHV. Als

species-specifieke duplex RT-PCR werden pap31 en yopP in één reactie verwerkt. De beide

duplex RT-PCRs moeten elkaar confirmeren voordat een conclusie kan genomen worden.

Aansluitend werd een volledig validatieplan doorlopen. Uit de resultaten van LOD werd

geconcludeerd dat de generische duplex RT-PCR een algemeen globale techniek is om

Bartonella spp. op te sporen met SHV als interne controle. De specifieke duplex RT-PCR is

een verdere discriminatie van twee species met een lagere gevoeligheid dan de generische

test maar wel specifieker voor de te detecteren doelwitsequentie. Voor de parameters

herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden telkens resultaten bekomen die binnen de

aanvaardbare grenzen lagen. Na het onderzoek op het matrix geïnduceerd effect kan

vastgesteld worden dat de species-specifieke RT-PCR meer inhibitie ondervindt dan de

generische RT-PCR. Over het algemeen is e-swab met Liquid Amies medium de beste

methode om stalen te nemen en ook klierweefsel kan gehanteerd worden rekening houdend

met een kleine daling in gevoeligheid bij de species-specifieke duplex RT-PCR. Uit de

resultaten van het onderzoek blijkt echter dat de bacterie minder gevoelig gedetecteerd wordt

74

als etter/pus als matrix wordt gespiked. Als oplossing kan enerzijds het staal 10x verdund

worden om inhibiterende substanties te verdunnen en hertest worden of anderzijds een e-

swab op de geïnfecteerde zone gebruikt worden. Bij de specificiteitscontrole werd voor Human

herpesvirus 6 (HHV-6) 2/10 keer een vals positief resultaat bekomen bij duplex RT-PCR yopP

en pap31 op aangekocht HHV-6 DNA maar niet op HHV-6 positieve klinische monsters en

dient verder onderzocht te worden binnen het AZ Sint-Jan. De bewaarconditie van het

monstermateriaal werd onderzocht aan de hand van meest voorkomende interne en externe

bewaarcondities waaruit geconcludeerd kon worden dat er geen problemen opduiken.

Bijkomend aan het onderzoek werden verschillende stalen onderworpen aan een

typeringsmethode, nl. 16S rRNA sequenering. Het is een robuuste amplificatiemethode en

leidde tot de correcte species-identificatie, wat de geschiktheid van de methode bevestigde.

De gevalideerde duplex RT-PCRs worden in het moleculair labo van AZ Sint-Jan Brugge in

gebruik genomen en maakt het mogelijk om Bartonella spp. op een snelle, sensitieve en

specifieke manier te detecteren. De methode zal door gebruik in het labo keer op keer blijvend

gevalideerd worden met mogelijkheid tot verdere optimalisatie.

75

Bibliografische lijst

Ahmed, F. E. (2005). Quantitative real-time RT-PCR: application to carcinogenesis. Cancer

Genomics-Proteomics, 2(6), 317-332.

Angelakis, E., Rolain, J. M., Raoult, D., & Brouqui, P. (2011). Bartonella quintana in head louse

nits. Pathogens and Disease, 62(2), 244-246.

Applied Biosystems (2008). Real-Time PCR: Understanding CT.

Applied Biosystems (2009). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.

Arisoy, E. S., Correa, A. G., Wagner, M. L., & Kaplan, S. L. (1999). Hepatosplenic cat-scratch

disease in children: selected clinical features and treatment. Clinical Infectious

Diseases, 28(4), 778-784.

Arvand, M., Raoult, D., & Feil, E. J. (2010). Multi-locus sequence typing of a geographically

and temporally diverse sample of the highly clonal human pathogen Bartonella quintana. PLoS

One, 5(3), e9765.

Azzag, N., Haddad, N., Durand, B., Petit, E., Ammouche, A., Chomel, B., & Boulouis, H. J.

(2012). Population structure of Bartonella henselae in Algerian urban stray cats. PloS

one, 7(8), e43621.

Badiaga, S., & Brouqui, P. (2012). Human louse‐transmitted infectious diseases. Clinical

Microbiology and Infection, 18(4), 332-337.

Bergmans, A. M., De Jong, C. M., Van Amerongen, G., Schot, C. S., & Schouls, L. M. (1997).

Prevalence of Bartonella species in domestic cats in The Netherlands. Journal of clinical

microbiology, 35(9), 2256-2261.

Centers for Disease Control and Prevention. (2014). Cat-Scratch Disease. Geraadpleegd op

5 februari 2017 via https://www.cdc.gov/healthypets/diseases/cat-scratch.html.

Chenoweth, M. R., Somerville, G. A., Krause, D. C., O'Reilly, K. L., & Gherardini, F. C. (2004).

Growth characteristics of Bartonella henselae in a novel liquid medium: primary isolation,

growth-phase-dependent phage induction, and metabolic studies. Applied and environmental

microbiology, 70(2), 656-663.

Chomel, B. B., Boulouis, H., Maruyama, S., & Breitschwerdt, E.B. (2006). Bartonella Spp. in

Pets and Effect on Human Health. Emerging infectious disease, 12(3), 389.

Dietrich, F., Schmidgen, T., Maggi, R. G., Richter, D., Matuschka, F. R., Vonthein, R.,

Breitschwerdt, E. B., & Kempf, V. A. J. (2010). Prevalence of Bartonella henselae and Borrelia

burgdorferi Sensu Lato DNA in Ixodes ricinus ticks in Europe. Applied and environmental

microbiology, 76(5), 1395-1398.

https://www.cdc.gov/healthypets/diseases/cat-scratch.html

76

Dolan, M. J., Wong, M. T., Regnery, R. L., Jorgensen, J. H., Garcia, M., Peters, J., & Drehner,

D. (1993). Syndrome of Rochalimaea henselae adenitis suggesting cat scratch

disease. Annals of internal medicine, 118(5), 331-336.

Dorak, M. T. (2007). Real-time PCR. Taylor & Francis.

Downey, N. (2014). Interpreting melt curves: An indicator, not a diagnosis. Integrated DNA

Technologies, Inc. Geraadpleegd op 30 oktober 2016 via

http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-

concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis.

Drancourt, M., Tran-Hung, L., Courtin, J., de Lumley, H., & Raoult, D. (2005). Bartonella

quintana in a 4000-year-old human tooth. Journal of Infectious Diseases, 191(4), 607-611.

Edouard, S., Nabet, C., Lepidi, H., Fournier, P. E., & Raoult, D. (2015). Bartonella, a common

cause of endocarditis: a report on 106 cases and review. Journal of clinical microbiology, 53(3),

824-829.

Engel, P., Salzburger, W., Liesch, M., Chang, C. C., Maruyama, S., Lanz, C., Calteau, A.,

Lajus, A., Médigue, C., Schuster, S. C., & Dehio, C. (2011). Parallel evolution of a type IV

secretion system in radiating lineages of the host-restricted bacterial pathogen

Bartonella. PLoS Genet, 7(2), e1001296.

Fard, R. M. N., Vahedi, S. M., Ashrafi, I., Alipour, F., Sharafi, G., Akbarein, H., & Aldavood, S.

J. (2016). Molecular identification and phylogenic analysis of Bartonella henselae isolated from

Iranian cats based on gltA gene. In Veterinary Research Forum (Vol. 7, No. 1, p. 69). Faculty

of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran.

Florin, T. A., Zaoutis, T. E., & Zaoutis, L. B. (2008). Beyond cat scratch disease: widening

spectrum of Bartonella henselae infection. Pediatrics, 121(5), e1413-e1425.

Foucault, C. (2006). Bartonella quintana Characteristics and Clinical Management. Emerging

infectious disease, 12(2), 217.

Foucault, C., Barrau, K., Brouqui, P., & Raoult, D. (2002). Bartonella quintana bacteremia

among homeless people. Clinical infectious diseases, 35(6), 684-689.

Franca, L. T., Carrilho, E., & Kist, T. B. (2002). A review of DNA sequencing

techniques. Quarterly reviews of biophysics, 35(02), 169-200.

Global Health, Division of Parasitic Diseases and Malaria (2014). Diagnostic Procedures: Stool

Specimens. Geraadpleegd op 26 oktober 2016 via

https://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/stool/moleculardx.html.

Helms, V. (2008). Principles of computational cell biology. John Wiley & Sons.

http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis

http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis

https://www.cdc.gov/globalhealth/

mailto:[email protected]?subject=Parsites%20Website

https://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/stool/moleculardx.html

77

Hussain, S. A. (2009). An introduction to fluorescence resonance energy transfer

(FRET). arXiv preprint arXiv:0908.1815.

Illumina, Inc. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. Geraadpleegd op 22 april

2017 via https://www.illumina.com/content/dam/illumina-

support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-

prep-guide-15044223-b.pdf.

Jacomo, V., Kelly, P. J., & Raoult, D. (2002). Natural history of Bartonella infections (an

exception to Koch’s postulate). Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(1), 8-18.

Janda, J. M., & Abbott, S. L. (2007). 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in

the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of clinical microbiology, 45(9),

2761-2764.

Jansma, M., Aalbers, F. S., & Poolman, B. (2014). Zelf kopiëren, knippen en plakken. Stichting

Biowetenschappen en Maatschappij. Geraadpleegd op 6 oktober 2016 via

https://www.nemokennislink.nl/publicaties/zelf-kopieren-knippen-en-plakken.

Johnson, G., Ayers, M., McClure, S. C. C., Richardson, S. E., & Tellier, R. (2003). Detection

and identification of Bartonella species pathogenic for humans by PCR amplification targeting

the riboflavin synthase gene (ribC). Journal of clinical microbiology, 41(3), 1069-1072.

Joshi, M., & Deshpande, J. D. (2011). Polymerase chain reaction: methods, principles and

application. International Journal of Biomedical Research, 2(1), 81-97.

Julin, D. (2014). Polymerase Chain Reaction. USA, University of Maryland, College Park,

Department of Chemistry & Biochemistry, 3blz. New York, Springer Science+Business Media.

Kaiser, P. O., Riess, T., O’Rourke, F., Linke, D., & Kempf, V. A. (2011). Bartonella spp.:

throwing light on uncommon human infections. International Journal of Medical

Microbiology, 301(1), 7-15.

Klangthong, K., Promsthaporn, S., Leepitakrat, S., Schuster, A. L., McCardle, P. W., Kosoy,

M., & Takhampunya, R. (2015). The distribution and diversity of Bartonella species in rodents

and their ectoparasites across Thailand. PloS one, 10(10), e0140856.

Kostrzewski, J. (1949). The epidemiology of trench fever. Bull. Internat. Acad. Polonaise des

Sci. et des Lettres., (7/10), 233-263.

Lakowicz, J. R. (Ed.) (2013). Principles of fluorescence spectroscopy. Springer Science &

Business Media.

Liberto, M. C., Matera, G., Lamberti, A. G., Quirino, A., Barreca, G. S., Marascio, N., Baudi, F.,

Caroleo, B., Staltari, O., & Focà, A. (2013). Diagnosis and follow-up of Bartonella henselae

infection in the spleen of an immunocompetent patient by real-time quantitative PCR. Journal

of medical microbiology, 62(7), 1081-1085.

https://www.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf



https://www.nemokennislink.nl/publicaties/zelf-kopieren-knippen-en-plakken

78

Life Technologies Corporation (2012). Real-time PCR handbook.

Life Technologies Corporation (2013). SYBR® Select Master Mix User Gide.

Madden, T. (2013). The BLAST sequence analysis tool.

Margileth, A. M. (1992). Antibiotic therapy for cat-scratch disease: clinical study of therapeutic

outcome in 268 patients and a review of the literature. The Pediatric infectious disease

journal, 11(6), 474-478.

Margileth, A. M. (2000). Recent advances in diagnosis and treatment of cat scratch

disease. Current Infectious Disease Reports, 2(2), 141-146.

Michelet, L., Delannoy, S., Devillers, E., Umhang, G., Aspan, A., Juremalm, M., Chirico, J.,

van der Wal, F. J., Sprong, H., Pihl, T. P. B., Klitgaard, K., Bødker, R., Fach, P., & Moutailler,

S. (2014). High-throughput screening of tick-borne pathogens in Europe. Frontiers in cellular

and infection microbiology, 4(103).

Müller, A., Reiter, M., Mantlik, K., Schötta, A. M., Stockinger, H., & Stanek, G. (2016).

Development of a serum-free liquid medium for Bartonella species. Folia microbiologica, 61(5),

393-398.

Munshi, A. (2012). DNA Sequencing-Methods and Applications.

Neuzil, P., Cheng, F., Soon, J. B. W., Qian, L. L., & Reboud, J. (2010). Non-contact fluorescent

bleaching-independent method for temperature measurement in microfluidic systems based

on DNA melting curves. Lab on a chip, 10(20), 2818-2821.

Nollet, F. (2013). ViiA7 Life Technologies. Eerste druk. AZ Sint-Jan Brugge: Dienst

Laboratoriumgeneeskunde.

Owczarzy, R., Tataurov, A. V., Wu, Y., Manthey, J. A., McQuisten, K. A., Almabrazi, H. G.,

Pedersen, K. F., Lin, Y., Garretson, J., McEntaggart, N. O., Sailor, C. A., Dawson, R. B., &

Peek, A. S. (2008). IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid

oligomers. Nucleic Acids Research, 36(suppl 2), W163-W169.

Pauwels, E. (2012). Identificatie van nonfermenters en mycobacteria. Thesis, Gent,

Hogeschool Gent, 93 blz.

Pestana, E., Belak, S., Diallo, A., Crowther, J. R., & Viljoen, G. J. (2010). Early, rapid and

sensitive veterinary molecular diagnostics-real time PCR applications. Springer Science &

Business Media, 310 blz.

Pieters, J. (2014). Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van

seksueel overdraagbare pathogenen. Thesis, Gent, Universiteit Gent, 108 blz.

PREMIER Biosoft. TaqMan® Probes. Gereedpleegd op 1 november 2016 via

http://premierbiosoft.com/tech_notes/TaqMan.html.

http://premierbiosoft.com/tech_notes/TaqMan.html

79

Prutsky, G., Domecq, J. P., Mori, L., Bebko, S., Matzumura, M., Sabouni, A., Shahrour, A.,

Erwin, P. J., Boyce, T. G., Montori, V. M., Malaga, G., & Murad, M. H. (2013). Treatment

outcomes of human bartonellosis: a systematic review and meta-analysis. International

Journal of Infectious Diseases, 17(10), e811-e819.

Pulliainen, A. T., & Dehio, C. (2012). Persistence of Bartonella spp. stealth pathogens: from

subclinical infections to vasoproliferative tumor formation. FEMS microbiology reviews, 36(3),

563-599.

Raoult, D., Dutour, O., Houhamdi, L., Jankauskas, R., Fournier, P. E., Ardagna, Y., Drancourt,

M., Signoli, M., Dang La, V., Macia, Y., & Aboudharam, G. (2006). Evidence for louse-

transmitted diseases in soldiers of Napoleon’s Grand Army in Vilnius. Journal of Infectious

Diseases, 193(1), 112-120.

Regnery, R. L., Olson, J. G., Perkins, B. A., & Bibb, W. (1992). Serological response to. The

Lancet, 339(8807), 1443-1445.

Rolain, J. M., Brouqui, P., Koehler, J. E., Maguina, C., Dolan, M. J., & Raoult, D. (2004).

Recommendations for treatment of human infections caused by Bartonella

species. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(6), 1921-1933.

Simard, J. (2015). KATTENKRABZIEKTE Belang bij mens en dier. Thesis, Gent, Universiteit

Gent, 2015, 54 blz.

Smith, C. J., & Osborn, A. M. (2009). Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-

based approaches in microbial ecology. FEMS microbiology ecology, 67(1), 6-20.

Snipcademy. Sanger sequencing - chain-termination method. Geraadpleegd op 14 april 2017

via https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-

dideoxynucleotide.

Thamawatanakul, R. (2010). Bartonella quintana. Geraadpleegd op 25 februari 2017 via

https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bartonella_quintana.

Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015a). 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR Systems Support

- Getting Started. Geraadpleegd op 30 oktober 2016 via

http://www.thermofisher.com/be/en/home/technical-resources/technical-reference-

library/real-time-digital-PCR-instruments-support-center/7500-real-time-pcr-systems-

support/7500-real-time-pcr-systems-support-getting-started.html.

Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015b). Fluorescent Probes. Geraadpleegd op 8 oktober 2016

via https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-

learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/fluorescent-

probes.html.

https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide

https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide

https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bartonella_quintana

http://www.thermofisher.com/be/en/home/technical-resources/technical-reference-library/real-time-digital-PCR-instruments-support-center/7500-real-time-pcr-systems-support/7500-real-time-pcr-systems-support-getting-started.html



https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/fluorescent-probes.html



80

Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015c). Getting Started Guide: Primer Express® Software

Version 3.0. Geraadpleegd op 6 maart 2017 via

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_041902.pdf.

Valeur, B., & Berberan-Santos, M. N. (2012). Molecular fluorescence: principles and

applications. John Wiley & Sons.

Vandesompele, J. (2013). qPCR Guide. Eurogentec.

Vermeulen, M. J., Herremans, M., Verbakel, H., Bergmans, A. M. C., Roord, J. J., Van Dijken,

P. J., & Peeters, M. F. (2007). Serological testing for Bartonella henselae infections in The

Netherlands: clinical evaluation of immunofluorescence assay and ELISA. Clinical

microbiology and infection, 13(6), 627-634.

Vermeulen, M. J., Roord, J.J., & Peeters, M.F. (2009). Kattenkrabziekte: infectie door

Bartonella henselae. Ned Tijdschr Infect, 4, 18-23.

Wiersema, I. (2005). Identificatie door vergelijking ribosomaal bacterieRNA (16S-rRNA).

Geraadpleegd op 22 april 2017 via http://www.microbiologie.info/16s%20rrna.html#.

Yang, B., Wang, Y., & Qian, P. Y. (2016). Sensitivity and correlation of hypervariable regions

in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC bioinformatics, 17(1), 135.

Youtsey, S. (2012). Determining the physical characteristics of your oligos—the OligoAnalyzer

Tool. Geraadpleegd op 7 maart 2017 via https://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-

articles/web-tools/decoded/2012/06/15/using-the-oligoanalyzer-program.

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_041902.pdf



http://www.microbiologie.info/16s%20rrna.html

https://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/web-tools/decoded/2012/06/15/using-the-oligoanalyzer-program

https://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/web-tools/decoded/2012/06/15/using-the-oligoanalyzer-program

81

Bijlagen

Bijlage I Tabel 28: Overzicht klinische monsters en DNA-extracten AZ Sint-Lucas (Gent) als referentiemateriaal met het resultaat

van zowel AZ Sint-Lucas (Gent) als de nieuwe methode met de beide duplex RT-PCRs van AZ Sint-Jan te Brugge.

ID nummer Soort materiaal Conclusie AZ Sint-

Lucas Conclusie PCR

2293890 Letsel linker lever-lob

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

2462291 Klier

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

2740748 e-swab

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Staal 1

(1609-13005) /

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Staal 2

(1610-08479) /

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

1512-11920 DNA-extract

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief


Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief


Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief


Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

Bartonella positief

Bartonella henselae

positief

82

Tabel 29: Overzicht klinische stalen AZ Sint-Jan (Brugge) met klinische vaststelling en respectievelijke conclusie van de

beide duplex RT-PCRs.

ID

nummer

Soort

materiaal Klinische interpretatie Conclusie RT-PCR

2749731 Punctie

abces oksel

1ste positieve serologie: IgG 1/16000, IgM

1/200. Serologisch duidelijk recente of

actieve Bartonellose. Opnieuw positieve

serologie op moment van unilaterale

cervicale lymfeklier.

Bartonella spp.:

positief

Bartonella henselae:

positief

2732302 Vocht

leverabces

Progressief gunstige evolutie na extractie

van choledocholithiasen en antibiotische

therapie onder vorm van Meropenem. Geen

Bartonella-infectie

Bartonella spp.:

negatief

2504065 Longbiopt

Definitieve diagnose na chirurgische

mediastinoscopie en longbiopsie:

sarcoïd-like niet-necrotiserende

granulomateuze inflammatie in de long

(rechter bovenkwab vermoedelijk secundair

aan B. henselae gezien positieve serologie

1m vroeger maar dit kan eveneens passen

bij doorgemaakte Bartonellose in een ver

verleden, en compatibele kliniek met koorts,

nachtzweten en vermagering). Dit was initiële

besluit van pneumologe.

Maar laattijdige kweek van M. xenopi, die

eveneens een causale rol kan gespeeld

hebben, dus wordt eveneens behandeld.

Bartonella spp.:

negatief

2209798

2273998

2399868

2521239

Serum

Patiënt (idem patiënt 2293890 Tabel 28)

heeft een indrukwekkende

ziektegeschiedenis met chronische

Bartonellose

(nachtzweten, >17kg vermagering, diffuse

klieren en lever-/miltabcessen, geen

bewezen immuundeficiëntie).

Bartonella spp.:

negatief

2663842 Klierweefsel

nodules oksel = folliculair non-Hodgkin

lymfoom. Geen Bartonella infectie, zat in

differentiaal diagnose.

Bartonella spp.:

negatief

2655574 Lymfadenitis

abcesvocht

Suppuratieve lymphadenitis ter hoogte van

de linkerlies op basis van een

kattenkrabziekte. Patiënt kreeg een

voorschrift voor Azitromycine 500 mg/dag

gedurende vijf dagen.

Bartonella spp.:

positief


positief

83

2532413 Wondvocht Acute kattenkrabziekte, met torenhoge

serum antistofspiegels

Bartonella spp.:

positief


positief

2740200 Volbloed

Idem patiënt 2749731

Het betrof hier wel een recente/actieve

Bartonellose, maar een B. henselae

serologische, waar je dus geen langdurige

persisterende bacteriemie kan verwachten

(in tegenstelling tot B. quintana)

Bartonella spp.:

negatief

2742003

Lymfeklier

hals/

lymfoom

Grote harde pijnloze halsklier zone I links van

ongeveer 4cm, kleinere zachte adenopathie

anterieur van m. SCM links.

6 weken geleden gebeten door kitten.

Klinische Bartonella infectie, maar bacteriële

lading van B. henselae te laat voor detectie.

Bartonella spp.:

positief


onzeker

84

Bijlage II Tabel 30: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op beide Vircell AmpliRun® DNA-controle

in tweevoud.

- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.

Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA controle


Bartonella

spp.

p715 Bart Fw 31,54 31,75 29,89 29,87

p716 Bart Rv

p718 Bart 16 Fw 31,07 32,35 29,65 29,54

p719 Bart 16 Rv

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw 32,58 32,63 - -

p722 Bq Yop Rv

p724 Bq bqtr Fw 31,99 31,51 - -

p725 Bq bqtr Rv

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw 37,55 39,30 31,64 32,40

p728 Bh pap Rv

p730 Bh glta Fw 41,85 - 31,15 31,18

p731 Bh glta Rv

Tabel 31: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell

AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.


Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella quintana

107 106 105 104 103 102

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw 21,13 24,70 28,49 31,20 35,89 39,70

p716 Bart Rv

p718 Bart 16 Fw 21,77 25,13 28,98 31,89 35,15 -

p719 Bart 16 Rv

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw 22,62 26,49 30,61 33,19 37,63 -

p722 Bq Yop Rv

p724 Bq bqtr Fw 21,93 25,32 29,58 31,59 36,30 36,51

p725 Bq bqtr Rv

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw 37,31 39,75 38,82 39,89 36,97 38,15

p728 Bh pap Rv

p730 Bh glta Fw 35,37 36,27 42,58 - - -

p731 Bh glta Rv

85

Tabel 32: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell

AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle.


Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella henselae

107 106 105 104 103 102

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw 20,11 23,75 27,02 31,05 35,73 38,79

p716 Bart Rv

p718 Bart 16 Fw 20,91 24,09 27,98 31,00 - -

p719 Bart 16 Rv

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw - - - - - -

p722 Bq Yop Rv

p724 Bq bqtr Fw - - - - - -

p725 Bq bqtr Rv

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw 21,66 25,13 28,85 32,12 36,92 39,89

p728 Bh pap Rv

p730 Bh glta Fw 20,92 24,33 27,58 30,50 36,42 -

p731 Bh glta Rv

86

Bijlage III Tabel 33: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op bacteriële

mixen.


Organisme Naam Mix 1 Mix 2 Mix 3

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw 18,38 35,59 35,78

p716 Bart Rv

p718 Bart 16 Fw - - 37,94

p719 Bart 16 Rv

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw - - -

p722 Bq Yop Rv

p724 Bq bqtr Fw - - -

p725 Bq bqtr Rv

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw 39,19 - -

p728 Bh pap Rv

p730 Bh glta Fw - - -

p731 Bh glta Rv

87

Bijlage IV Tabel 34: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op de verdunningsreeks

van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.


Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella quintana

106 105 104 103 102

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw

23,51 27,39 30,16 31,93 31,50 p716 Bart Rv

p717 Bart Pr

p718 Bart 16 Fw

23,30 27,39 31,10 34,12 - p719 Bart 16 Rv

p720 Bart 16 Pr

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw

26,67 32,49 33,77 37,31 - p722 Bq Yop Rv

p723 Bq Yop Pr

p724 Bq bqtr Fw

29,10 - - - - p725 Bq bqtr Rv

p726 Bq bqtr Pr

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw

- - - - - p728 Bh pap Rv

p729 Bh pap Pr

p730 Bh glta Fw

- - - - - p731 Bh glta Rv

p732 Bh glta Pr

88

Tabel 35: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op de verdunningsreeks

van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle en tweemaal op negatieve controle.


Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella henselae

106 105 104 103 102 nc1/nc2

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw

23,82 27,75 30,76 32,10 34,81 32,25/

37,51 p716 Bart Rv

p717 Bart Pr

p718 Bart 16 Fw

23,59 27,48 31,14 34,58 - -/- p719 Bart 16 Rv

p720 Bart 16 Pr

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw

- - - - - -/- p722 Bq Yop Rv

p723 Bq Yop Pr

p724 Bq bqtr Fw

- - - - - -/- p725 Bq bqtr Rv

p726 Bq bqtr Pr

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw

24,21 28,16 31,96 35,89 - -/- p728 Bh pap Rv

p729 Bh pap Pr

p730 Bh glta Fw

25,39 30,14 - - - -/- p731 Bh glta Rv

p732 Bh glta Pr

89

Bijlage V Tabel 36: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op

bacteriële mixen.


Organisme Naam Mix 1 Mix 2 Mix 3

Bartonella

spp.

p715 Bart Fw

- 24,93 - p716 Bart Rv

p717 Bart Pr

p718 Bart 16 Fw

23,41 - 19,36 p719 Bart 16 Rv

p720 Bart 16 Pr

Bartonella

quintana

p721 Bq Yop Fw

- - - p722 Bq Yop Rv

p723 Bq Yop Pr

p724 Bq bqtr Fw

- - - p725 Bq bqtr Rv

p726 Bq bqtr Pr

Bartonella

henselae

p727 Bh pap Fw

- - - p728 Bh pap Rv

p729 Bh pap Pr

p730 Bh glta Fw

- - - p731 Bh glta Rv

p732 Bh glta Pr

90

Bijlage VI Tabel 37: CT-waarden voor de efficiëntieberekening van de duplex RT-PCRs.

groen: goed resultaat.

Bartonella-

plasmide

(conc.)

Generische RT-PCR Specifieke RT-PCR

Bartonella spp. SHV Bartonella

quintana

Bartonella

henselae

107 20,76 32,15 20,27 21,26

106 24,42 31,56 23,97 24,88

105 27,56 31,16 27,24 28,11

104 30,66 31,18 30,34 30,90

103 35,37 31,03 33,62 34,38

91

Bijlage VII Tabel 38: Ruwe data (CT-waarden) van de beide duplex RT-PCR voor de bepaling van herhaalbaarheid en

reproduceerbaarheid.


Generische RT-PCR

S0 S1 S2 S3 S4

Bartonella spp.

Interrun

Intrarun

CT 1 27,29 32,60 33,61 35,36 39,17

CT 2 27,39 32,05 33,68 36,57 37,92

CT 3 27,47 31,86 34,36 35,87 40,32

CT 4 27,00 31,85 33,67 36,95 39,54

CT 5 27,57 32,13 34,60 36,81 40,73

SHV

Interrun

Intrarun

CT 1 28,65 29,07 29,93 30,05 30,43

CT 2 28,77 29,55 29,27 29,85 29,61

CT 3 28,93 29,00 29,75 29,33 29,79

CT 4 28,56 29,34 29,94 30,42 30,43

CT 5 28,72 29,20 30,22 30,57 30,95

Specifieke RT-PCR

Bartonella henselae

Interrun

Intrarun

CT 1 28,93 33,36 35,46 37,44 -

CT 2 29,10 33,97 36,24 38,47 -

CT 3 28,99 33,40 35,45 37,59 -

CT 4 28,60 34,15 35,09 38,96 -

CT 5 29,18 33,60 36,06 37,74 -

92

Bijlage VIII Tabel 39: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute waarde van het verschil in

CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische matrixen op de generische RT-PCR. Voor e-swab werden

de gemiddelde CT-waarden genomen van de verschillende inter- en intraruns, idem voor de kliermatrix.

- : geen amplificatie bij de matrix; groen: goed resultaat; oranje: twijfelgeval; rood: slecht resultaat.

CT-waarde Vergelijkende CT-waarde

(absolute waarde)

Matrix Verdunning

Doelwitgen

16S rRNA

gene SHV

16S rRNA

gene SHV

1x TE-buffer

(referentie)

S0 27,30 28,78

S1 30,65 28,90

S2 32,74 28,72

S3 33,98 28,89

S4 36,89 29,10

e-swab

S0 27,34 28,73 0,04 0,03

S1 32,10 29,23 1,45 0,34

S2 33,98 29,82 1,24 1,10

S3 36,31 30,04 2,33 1,16

S4 39,54 30,24 2,64 1,14

LV

S0 27,74 28,99 0,44 0,23

S1 30,99 28,92 0,34 0,02

S2 33,45 28,80 0,71 0,08

S3 35,00 28,83 1,02 0,06

S4 38,50 28,95 1,61 0,15

pus1

S0 29,72 32,01 2,42 3,25

S1 32,94 32,12 2,29 3,22

S2 34,69 32,34 1,95 3,61

S3 - 32,53 - 3,65

S4 - 32,54 - 3,44

pus2

S0 28,59 31,22 1,30 2,46

S1 33,05 31,52 2,39 2,63

S2 33,92 31,81 1,18 3,08

S3 39,39 31,51 5,41 2,62

S4 - 31,88 - 2,78

93

pus3

S0 30,49 32,56 3,19 3,80

S1 34,12 32,56 3,46 3,67

S2 39,61 33,56 6,87 4,83

S3 - 33,76 - 4,87

S4 - 32,86 - 3,76

VB1

S0 28,89 31,16 1,59 2,40

S1 32,59 30,97 1,93 2,08

S2 34,51 31,29 1,77 2,57

S3 35,67 31,15 1,69 2,26

S4 - 30,73 - 1,63

VB0,2

S0 28,92 29,80 1,62 1,04

S1 31,48 29,54 0,83 0,64

S2 33,18 29,76 0,43 1,03

S3 35,53 29,81 1,55 0,92

S4 - 29,92 - 0,83

GV1

S0 29,25 31,13 1,95 2,37

S1 32,45 31,45 1,80 2,56

S2 34,57 31,44 1,83 2,72

S3 - 31,26 - 2,38

S4 - 31,70 - 2,60

GV2

S0 27,36 29,15 0,06 0,39

S1 31,52 29,44 0,87 0,55

S2 32,70 29,30 0,04 0,57

S3 35,27 29,47 1,29 0,58

S4 - 29,31 - 0,21

kl106

S0 27,22 28,54 0,07 0,22

S1 29,96 28,93 0,70 0,03

S2 32,26 28,51 0,48 0,21

S3 35,50 28,87 1,52 0,02

S4 38,16 28,88 1,26 0,22

kl105

S0 26,84 28,59 0,46 0,17

S1 30,24 28,79 0,42 0,10

S2 31,85 28,80 0,89 0,08

S3 33,42 28,74 0,56 0,14

S4 38,65 28,74 1,76 0,35

94

Tabel 40: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute waarde van het verschil in

CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische matrixen op de species-specifieke RT-PCR. Voor e-swab

werden de gemiddelde CT-waarden genomen van de verschillende inter- en intraruns, idem voor de kliermatrix.

- : geen amplificatie bij de matrix; groen: goed resultaat; oranje: twijfelgeval; rood: slecht resultaat.

CT-waarde Vergelijkende CT-waarde

(absolute waarde)

Matrix Verdunning Doelwitgen

pap31 pap31

1x TE-buffer

(referentie)

S0 28,87

S1 32,06

S2 34,49

S3 36,00

S4 -

e-swab

S0 28,96 0,09

S1 33,70 1,63

S2 35,66 1,17

S3 38,04 2,04

S4 - -

LV

S0 28,94 0,06

S1 32,95 0,89

S2 - -

S3 - -

S4 - -

pus1

S0 - -

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

pus2

S0 35,60 6,72

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

95

pus3

S0 - -

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

VB1

S0 32,09 3,22

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

VB0,2

S0 30,94 2,07

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

GV1

S0 31,45 2,58

S1 - -

S2 - -

S3 - -

S4 - -

GV2

S0 29,49 0,61

S1 35,48 3,41

S2 - -

S3 - -

S4 - -

kl106

S0 30,15 1,28

S1 34,05 1,99

S2 36,66 2,17

S3 - -

S4 - -

kl105

S0 29,61 0,74

S1 33,43 1,36

S2 35,30 0,82

S3 - -

S4 - -

96

Bijlage IX Tabel 41: Ruwe data (CT-waarden) specificiteitscontrole van de beide duplex RT-PCRs met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix op organismen aanwezig in klinische stalen en de bacteriële mixen.


Organisme


Bartonella

spp. SHV

Bartonella

quintana

Bartonella

henselae

Adenoviridae 41,95 - - -

A. vaginae - - - -

CMV - - - -

Enterovirus - - - -

EBV - - - -

G. vaginalis - - - -

H. influenzae - - - -

HHV-1 - - - -

HHV-2 - - - -

HHV-6 38,20 - 36,78 -

L. crispatus - - - -

L. iners - - - -

RSV - - - -

Rhinovirus - - - -

S. pneumoniae - - - -

Toxoplasma - - - -

VZV - - - -

Mix 1 42,67 29,38 - -

Mix 2 - 29,69 - -

Mix 3 - 29,19 - -

97

Tabel 42: Verder onderzoek voor de interferentiestudie op de bacteriële mixen, de bacteriële culturen apart en het Human

herpesvirus 6 (HHV-6).


Organisme


Bartonella

spp. SHV

Bartonella

quintana

Bartonella

henselae

Mix 1 - 29,03 - -

Mix 1 - 28,52 - -

Mix 1 - 28,98 - -

Mix 2 - 29,60 - -

Mix 2 - 29,43 - -

Mix 2 - 29,31 - -

Mix 3 - 28,44 - -

Mix 3 - 28,77 - -

Mix 3 - 29,14 - -

Acinetobacter - 28,93 - -

E. coli - 29,66 - -

E. faecalis - 29,20 - -

P. aeruginosa - 29,76 - -

S. agalactiae - 29,11 - -

S. aureus - 29,59 - -

S. dysgalactiae - 29,49 - -

Herpes-6 staal 1 - 29,35 - -

Herpes-6 staal 2 - 29,26 - -

Herpes-6 staal 3 - 29,17 - -

Herpes-6 staal 4 - 29,08 - -

HHV-6 - - 38,63 -

HHV-6 - - - -

HHV-6 - - - -

HHV-6 - - - -

HHV-6 - - - -

98

Bijlage X Tabel 43: Resultaten CT-waarden onderzoek van de meest voorkomende bewaarcondities van de staalflow binnen het

AZ Sint-Jan te Brugge.


Staal-

nummer


Bartonella

spp. SHV

Bartonella

quintana

Bartonella

henselae

1 26,95 28,39 - 28,77

2 27,34 28,78 - 28,92

3 27,47 28,86 - 29,11

4 29,74 29,70 - 31,35

5 27,45 28,48 - 29,30

6 26,89 28,32 - 28,74

7 27,35 28,82 - 28,98

8 27,31 28,84 - 29,06

9 27,36 29,18 - 28,85

10 27,29 28,65 - 29,09

99

Bijlage XI

Figuur 27: Resultaat deel van het piekenpatroon van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle na uitvoering

op het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar).

Kleurencode: blauw = cytosine; zwart = guanine; groen = adenine; roze = thymine.

100

Bijlage XII

Resultaat BLAST: Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle

Bartonella henselae strain Houston-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence

Sequence ID: NR_074335.1Length: 1492Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 55 to 719GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand Frame

1229 bits(665) 0.0() 665/665(100%) 0/665(0%) Plus/Plus

Features: Query 1 ACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTGGGA 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 55 ACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTGGGA 114

Query 61 ATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 115 ATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTA 174

Query 121 GGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 175 GGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA 234

Query 181 CGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 235 CGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT 294

Query 241 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAA 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 295 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAA 354

Query 301 CCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACC 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 355 CCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACC 414

Query 361 GGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 415 GGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGC 474

Query 421 GGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCATGTAGGCGG 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 475 GGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCATGTAGGCGG 534

Query 481 ATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 535 ATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGT 594

Query 541 ATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCGTAGATATT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 595 ATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCGTAGATATT 654

Query 601 CGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAA 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 655 CGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAA 714

Query 661 GCGTG 665

|||||

Sbjct 715 GCGTG 719

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTYH9B5B013

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTYH9B5B013&from=55&to=719

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTYH9B5B013&from=55&to=719

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#hsp444303912_1

101

Resultaat BLAST: Staal 1 - 2749731



Related Information




1310 bits(709) 0.0() 714/716(99%) 1/716(0%) Plus/Plus

Features:

Query 1 GGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAG 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 43 GGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAG 102

Query 61 TAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCG 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 103 TAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCG 162

Query 121 TATACGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAG 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 163 TATACGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAG 222

Query 181 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 223 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC 282

Query 241 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 283 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 342

Query 301 CAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 343 CAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAA 402

Query 361 AGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGT 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 403 AGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGT 462

Query 421 GCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGC 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 463 GCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGC 522

Query 481 GCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 523 GCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCT 582

Query 541 TTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 583 TTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAA 642

Query 601 TTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGC 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 643 TTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGC 702

Query 661 TGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGGAAGTCCACGCC 716

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||

Sbjct 703 TGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA-GTCCACGCC 757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTMBRA5A01R

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTMBRA5A01R&from=43&to=757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTMBRA5A01R&from=43&to=757


102




Related Information

Range 1: 107 to 757GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match



1194 bits(646) 0.0() 649/651(99%) 0/651(0%) Plus/Plus

Features: Query 1 GCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATA 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 107 GCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATA 166

Query 61 CGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATSGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG 120

||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 167 CGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG 226

Query 121 TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 227 TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA 286

Query 181 CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 287 CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT 346

Query 241 GGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 347 GGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT 406

Query 301 CTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 407 CTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCA 466

Query 361 GCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCAT 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 467 GCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCAT 526

Query 421 GTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 527 GTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGA 586

Query 481 TACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCG 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 587 TACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCG 646

Query 541 TAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAG 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 647 TAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAG 706

Query 601 GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGAAGTCCACGCC 651

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||

Sbjct 707 GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC 757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=HKF8XE9X014

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=HKF8XE9X014&from=107&to=757

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=HKF8XE9X014&from=107&to=757

103




Related Information




1205 bits(652) 0.0() 667/674(99%) 4/674(0%) Plus/Plus

Features:

Query 1 GGCAGGGYTTAAACACATGCAAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGT 60

|||| || || ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 43 GGCA-GGCTT-AACACATGC-AAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGT 99

Query 61 GAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 100 GAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATA 159

Query 121 CCGTATACGTCCTATTTGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAG 180

||||||||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 160 CCGTATACGTCCT-TAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAG 218

Query 181 CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGAT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 219 CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGAT 278

Query 241 CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 279 CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 338

Query 301 TGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 339 TGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT 398

Query 361 GTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACT 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 399 GTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACT 458

Query 421 TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 459 TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTA 518

Query 481 AAGCGCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 519 AAGCGCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACT 578

Query 541 GCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 579 GCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGT 638

Query 601 AAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTG 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 639 AAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTG 698

Query 661 ACGCTGAGGTGCGA 674

||||||||||||||

Sbjct 699 ACGCTGAGGTGCGA 712

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTXTGS98016

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTXTGS98016&from=43&to=712

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/444303912?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=DTXTGS98016&from=43&to=712


bartonella quintana

Documents