PRIMEIRA AULA PRTICA

FACULDADE INTEGRAL DIFERENCIAL

MANUAL DE AULAS PRTICAS

IMUNOLOGIA BSICA

IMUNOLOGIA BSICA1, 2 e 3 AULAS PRTICAS

PUNO VENOSA: - OBTENO DE SORO E PLASMA- OBSERVAO DE CLULAS DO SANGUE PERIFRICO

INTRODUO:O sangue, humor circulante no sistema cardiovascular, representa o mais importante lquido do organismo, do qual se derivam todos os demais. Duas partes o constituem: a slida e a liquida. A primeira formada pelos elementos figurados, leuccitos, plaquetas e eritrcitos e a segunda pelo plasma, que est limitado ao sistema vascular. A obteno do plasma se faz retirando o sangue com anticoagulante e separando-se os glbulos por centrifugao ou sedimentao. O plasma uma soluo aquosa contendo componentes de pequeno e grande peso molecular, que correspondem a 10% do seu volume. As protenas plasmticas correspondem a 7% cs sais inorgnicos a 0,9%, sendo o restante formado por compostos orgnicos diversos, tais como aminocidos, vitaminas, hormnios, lipoprotenas, etc. Entre as protenas plasmticas, podemos citar a albumina (4% aproximadamente), as alfa, beta e gamaglobulinas e o fibrinognio. A albumina, mais abundante, representa um papel fundamental na manuteno da presso osmtica do sangue, no grupo das globulinas esto os anticorpos (imunoglobulinas), sendo o fibrinognio necessrio para a formao da fibrina, componentes final da coagulao sangunea.Diversas substncias insolveis ou pouco solveis em gua, como os lipdios, podem ser transportadas pelo plasma devido ao fato de se cominarem com as albuminas, alfa e beta globulinas. O soro se obtm aps coagulao do sangue. O coagulo ao se retrair prende os glbulos em suas malhas de fibrina e pela retrao deixa sair um liquido: o soro.A composio do plasma e soro , pois diferente. Neste inexistem, ou existem em pequena quantidade, determinadas substancias que foram utilizadas para coagulao sangunea. Vrios fatores (13 ao todo) intervm no fenmeno da coagulao sangunea. Este fenmeno se daria segundo o mecanismo intrnseco e extrnseco. O primeiro formaria a tromboplastina chamada do sangue e o segundo, a tromboplastina do tecido. A tromboplastina (do sangue e dos tecidos), em presena do clcio e da protrombina, formaria a trombina que, com o fibrinognio formaria a fibrina.

O processo de coagulao do sangue pode ser retardado ou evitado mediante o emprego de anticoagulantes, que podem ser empregados in vitro. In vivo ou em ambas as situaes que atuam interferindo em algum ponto do processo de coagulao como por exemplo: os oxalatos que precipitam o on clcio ou a heparina que impede a ativao da protrombina. A colheita do sangue para exames hematolgicos, qumicos e para provas sorolgicas deve ser efetuado em jejum, pela manh. O sangue empregado nestas pesquisas, geralmente o sangue venoso.

PUNAO VENOSA

MATERIAL:- Garrote- Seringa de 10.0 ml (estril)- Agulhas de 25 x 8- Algodo hidrfilo- lcool- Tintura de iodo- Tubos de 16 x 160- Tubos de hemlise contendo anticoagulante- Laminas- Corante Wright

MTODO:- Fazer a antissepsia da dobra do cotovelo com tintura de iodo. Retirar o iodo com lcool e deixar secar.- Colocar o garrote em torno do brao, cerca de 5 cm acima da dobra do cotovelo;- Introduzir a agulha na veia mediana, baslica ou ceflica;- Atingida a veia aspirar 10.0 ml de sangue;- Retirar o garrote e, em seguida a agulha. Comprimir local puncionado com algodo embebido em lcool.- Colocar uma gota de sangue em uma lamina e fazer um estirao usando outra lamina.- Retirar a agulha da seringa e transferir 5 ml de sangue para o tubo contendo anticoagulante e 5 ml para o tubo sem anticoagulante.

OBTENO E COAGULAO DO PLASMA.

MATERIAL:- Tubo de hemlise anticoagulante e 5 ml de sangue - Centrfuga- Pipeta Pasteur- Tube de hemlise- Soluo de cloreto de clcio a 0,5%- Banho Maria a 37 C

MTODO:- Tomar o tubo de hemlise contendo 5 ml de sangue com anticoagulante e centrifugar a 2000 r.p.m. por 10 min. - Separar o sobrenadante por aspirao, usando pipeta Pasteus e colocar em outro tubo de hemlise. - Adicionar a este tubo 5 gotas de soluo de cloreto de clcio a 0,5% levar ao banho Maria a 37 C. Agitar e anotar o tempo gasto para ocorrer a coagulao.

OBTENO DO SORO

MATERIAL:- Tubo de 16 x 160 contendo sangue sem anticoagulante.- Centrfuga- Frasco tipo penicilina- Pipeta Pasteur- Tubo de hemlise

MTODO:- Deixar o tubo de 16 x 160 inclinado, temperatura ambiente por 2 horas; para coagulao.- Aps a retrao do coagulo (sinresse), usando pipeta Pasteur descolar o cogulo e transferir a para lquida para o tubo de hemlise.- Centrifugar a 2000 r.p.m. por 10 min. Separar o sobrenadante usando pipeta Pasteur e depositar em frasco tipo penicilina. Arrolhar, identificar e colocar na geladeira.

OBSERVAO DE CLULAS DO SANGUE PERIFRICO

INTRODUO:A parte slida do sangue formada pelos elementos figurados, que so os eritrcitos, plaquetas e leuccitos. Todos os elementos se originam em rgos que compem o sistema hematopoitico. Os eritrcitos ou hemcias dos mamferos so anucleadas, no homem, tem a forma de disco bicncavo. A principal funo dos mesmos o transporte de oxignio aos tecidos. A concentrao normal de eritrcitos no sangue de aproximadamente 4.5 a 5.5 milhes por mm3, na mulher e na homem respectivamente. Uma reduo no nmero de eritrcitos ou na quantidade de hemoglobina dos mesmos caracterizam as anemias.As plaquetas so corpsculos anucleados, com a forma de disco, cerca de 3 um de dimetro. Derivam-se de clulas gigantes da medula ssea, os megacariocitos. Existem apenas nos 300.000 / mm3 e tem vida mdia de nove dias.Nos esfregaos de sangue, as plaquetas, tendem a aparecer em grupos (aglutinao). Estes corpsculos desempenham um papel fundamental na hemostasia (coagulao do sangue).Constantemente os leuccitos deixam os capilares (diapedese), passando entre as clulas endoteliais e penetram no tecido conjuntivo, todavia quando os tecidos so invadidos por microrganismos, os leuccitos so atrados por quimiotaxia, isto , uma resposta migratria s substncias originadas dos tecidos, plasma sanguneo e dos microrganismos.O nmero de leuccitos por milmetro cbico de sangue no adulto normal de 5.000 a 10.000. Havendo uma variao qualitativa em funo da idade. A tabela abaixo mostra a percentagem e o tamanho dos diversos tipos de leuccitos no sangue do adulto. Chama-se leucocitose ao aumento, e leucopenia a diminuio do nmero de leuccitos no sangue.

Tamanho e nmero dos Leuccitos do Sangue Humano (Adulto)Tipo de leuccitoTamanho% do nmero total de leuccitos

Neutrfilo EosinfiloBasfiloLinfcitosMoncitos 12 a 15 um12 a 15 um12 a 15 um6 a 18 um12 a 20 um50 a 702 a 3Cerca de 0.520 a 303 a 10

Os neutrfilos, eosinfilos e basfilos so os leuccitos granulcitos. Os linfcitos e moncitos so agranulcitos.Os neutrfilos tem ncleos formados por dois a 5 lbulos, ligados entre si por finas pontes de cromatina. A clula muito jovem tem ncleo em bastonete.O citoplasma do neutrfilo bastante abundante e carregado de granulaes especficas e grnulos azurfilos.Os neutrfilos constituem a primeira linha de defesa celular contra microrganismos pois so fagcitos ativos contra bactrias e pequenas partculas por este motivo foram denominadas de micrfagos, por Metchinikoff.As partculas fagocitadas pelos neutrfilos so destrudas por enzimas existentes nos seus grnulos e tambm pela ao do perxido de hidrognio e nions superxido que so produzidos durante a fagocitose devido ao aumento brusco e acentuado no consumo de oxignio.Os neutrfilos aumentam em nmero no sangue perifrico nas infeces bacterianas agudas, principalmente por germes capsulados, quando houver destruio de tecidos (enfarte do miocrdio, etc), e em algumas perturbaes metablicas. Os eosinfilos constituem 2 4% do total de leuccitos. Seu ncleo em geral bilobulado. Caracterizam-se pela presena de granulaes ovides que se coram pela eosina (granulaes acidfilas), que so envolvidas por uma membrana.os grnulos so ricos em protenas e enzimas. Os grnulos especficos eosinfilos so lisossomas. Neles j foram demonstrados enzimas como: fosfatase cida, peroxidase, beta glicuronidase. O citoplasma do eosinfilo quase todo ocupado pelos grnulos especficos. O retculo endoplasmtico, as mitocndrias e o aparelho de Golgi so poucos desenvolvidos.Presume-se que as principais funes dos eosinfilos sejam: fagocitar e destruir determinados complexos antgeno anticorpo e limitar o processo inflamatrio. Os eosinfilos fagocitam bactrias mais lentamente que os neutrfilos e seu poder para destruir microrganismos pequeno.Observa-se eosinofilia em algumas parasitoses e nas doenas alrgicas. Estes granulcitos so atrados para as reas de inflamao graas a fatores quimiotticos produzidos pelos mastcitos e basfilos. Nestas reas os eosinfilos liberam aril sulfatase B e histaminase que destroem dois dos mediadores da alergia, a SRS A e histamina. Os basfilos tm um ncleo volumoso, retorcido e irregular. O citoplasma carregado de grnulos grandes que muitas vezes obscurecem parcialmente o ncleo. Constituem menos de 1% dos leuccitos do sangue. Seus grnulos so metacromticos e nas coloraes prprias para clulas sanguneas aparecem roxo. So ricos em 3RS (slow reating substance), histamina e heparina. A membrana plasmtica dos basfilos, como a dos mastcitos possui receptor para imunoglobulina E (IgE).Embora os basfilos tenham origem e morfologia diferentes dos mastcitos, eles liberam seus grnulos e substncias neles contidas atravs dos mesmos estmulos. Os linfcitos so clulas esfricas com dimetro entre 6 e 8 um (pequenos linfcitos), pequena percentagem deles podem atingir dimetros maiores.O ncleo esfrico e escuro. O citoplasma muito escasso, aparecendo nos esfregaos como um anel delgado em volta do ncleo corando-se em azul claro. s vezes o citoplasma no visvel. Pode conte grnulos azurfilos. So pobres em organelas, contendo moderada quantidade de ribossomos livres. Os linfcitos, embora tenham morfologia semelhante podem ser identificados como linfcitos T (timo) e B (bursa), com base em propriedades bioqumicas e receptores localizados em suas membranas. A principal funo dos linfcitos a imunocompetncia. Os linfcitos B quando entram em contato com antgenos, se dividem e se diferenciam em clulas plasmticas, (plasmcitos) que sintetizam anticorpos. Os linfcitos T so mais numerosos no sangue. So responsveis pela resposta imunitria de base celular. Os linfcitos T possuem receptores de membrana que os subdivide em populaes diferentes com T helper, T citotxico, T supressor.Alguns linfcitos, tanto T como B, aps entrarem em contato com o antgeno passam a constituir as clulas de memria imunolgica. Os moncitos tm o ncleo ovide, em forma de rim ou ferradura (mais comum), sendo geralmente excntrico. A cromatina aparece em arranjo mais frouxo e mais delicado que nos linfcitos. O citoplasma dos moncitos basfilo e contm grnulos azurfilos muito finos, conferindo-lhe uma colorao acinzentada. O estudo enzimtico destes grnulos mostra que eles so lisossomas. O R. E. pouco desenvolvido, os ribossomos esto presentes em quantidade mdia. H algumas mitocndrias e complexo de Golgi. O moncito faz parte do Sistema Fagocitrio Mononuclear do sistema histiocitrio. Originam-se na medula ssea, passam para o sangue onde permanece alguns dias, e atravessam a parede dos capilares e vnulas, e penetram no tecido conjuntivo e em alguns rgos, transformando-se em macrfagos, o que constitui uma fase mais avanada.

OBSERVAO DAS CLULAS SANGUINEAS A lmina feita na hora da colheita dever ser corada para que se possa diferencial os vrios tipos morfolgicos das clulas do sangue circulante (hemcias, leuccitos e plaquetas).Existem vrios tipos de corantes para colorao de clulas sanguneas, resultantes da fuso de diversas substancias usada por Erlich e Romanovshy.Os mais usados e difundidos so: Leichman, Wright e May Grunwald Giemsa.

COLORAO DE LMINA1. Colher o material e distender sobre lminas. Secar ao ar.2. Colocar a lamina na horizontal com os esfregaos voltados para a parte superior e sobre o mesmo colocar o corante Wright por 4 minutos.3. Colocar sobre o corante a mesma quantidade de gua destilada ou soluo tampo pH = 6.4.4. Homogenizar e deixar secar por 6 a 8 minutos.5. Lavar com gua corrente, limpar o verso da lamina e deixar secar temperatura ambiente.6. Levar ao microscpio e examinar na objetiva de imerso.

Aps esta aula voc dever saber:- Como se obtm um soro e um plasma e as principais diferenas bioqumicas entre os dois.- Mecanismos bsicos de ao dos anticoagulantes.- Caractersticas morfolgicas das clulas do sangue perifrico.

4 AULA PRTICAFRACIONAMENTO DE GLOBULINAS

Vrios so os mtodos utilizados para o isolamento de anticorpos das demais protenas sricas. Veremos aqui a precipitao fracionada com sais neutros (Salting Out). atravs desta tcnica obteremos duas fraes: as Euglobulinas e as Pseudoglobulinas, a primeira constituda predominantemente por IgG, e as pseudoglobulinas contm uma quantidade considervel de IgG e a maior parte de IgA e IgM. Em geral se considera que todas as globulinas do soro se precipitam com sulfato de sdio a 22% a 37 C, e que as albuminas permanecem na soluo. O quadro abaixo mostra as diferentes fraes do soro precipitadas pelos sais (sulfato de amnio e de sdio).

TABELA Fraes do soro precipitadas por sais.

PROTEINASPRECIPITADA POR

Solubilidade em H2O dest.Concen-trao normal aprox. g/100 cm3 de soro% de saturao c\(NH4)2SO4g de (NH4)2SO4 por 100 cm3 a 37 ? C% das protenas totais

EUGLOBULINAS-0,23313,53

PSEUDOGLO- BULINAS I+1,34017,517

PSEUDOGLO- BULINAS II+0,54612,57

ALBUMINA+5,250-69

De modo que, quando queremos separar a totalidade dos anticorpos de um soro, adicionamos volume igual a soluo saturada de sulfato de amnio, a fim de obter a totalidade gamaglobulinas e quase totalidade das betaglobulinas.

MATERIAL:- Tubo de ensaio (12 x 120)- Pipetas graduadas- Pipetas Pasteur- Soluo saturada de sulfato de amnio- Soro- Centrfuga

MTODO:1. A 2 ml de soro adicionar 1 ml de soluo saturada de sulfato de amnio. Centrifugar, separar o sobrenadante do precipitado (precipitou-se a frao euglobulina 0 33%).2. Ao sobrenadante, adicionar 1 ml de soluo saturada de sulfato de amnio. Centrifugar, separar o sobrenadante do precipitado (precipitou-se a frao pseudoglobulina 33 50%).

OBSERVAO:a) As albuminas precipitam entre 50 a 100% de saturao. b) As antitoxinas se concentram sobretudo na frao pseudoglobulinas.

5 AULA PRTICAREAO DE MICROFLOCULAO VDRL(Veneral Diseases Research Laboratory)

Sorodiagnstico da Sfilis. O sorodiagnstico da sfilis feito basicamente pela pesquisa de trs tipos de anticorpos:1. Reagina sifiltica ou anticorpo de Wasserman.2. Anticorpo especifico para o gnero Treponema.3. Anticorpo especfico para o Treponema pallidum.

A reagina sifiltica um anticorpo capaz de reagir com a cardiolipina que um difosfatidilglicerol extrado do corao bovino.A prova de V.D.R.L. uma prova de floculao feita utilizando como antgeno, a cardiolipina, adicionada de cristais de lecitina e colesterol (cuja funo aumentar a superfcie reagente).A reagina que surge durante a infeco pelo Treponema pallidum ou por outros treponemas ou varias outras condies transformando-o em flocos visveis.A prova de V.D.R.L. est rigidamente padronizada, no podendo ser introduzida nela nenhuma modificao.

MATERIAL:- Laminas escavadas (placas de Kline)- Pipetas de 1.0 , 5.0 e 0.5 ml- Frasco de 20 ml com rolha esmerilhada- Soro positivo para sfilis- Antgeno estoque e soluo tampo.

Preparo da suspenso do antgeno de uso:Pipetar 0.4 ml do tampo fornecido no fundo de um frasco de 20 ml com rolha esmerilhada, juntar 0.5 ml do antgeno estoque (com pipeta de 1.0 ml), diretamente sobre a salina tamponada, enquanto mantemos o frasco sob agitao ligeira, apenas por rotao em uma superfcie lisa. Juntar 4.1 ml de tampo com pipeta de 5,0 ml, rapidamente, tampar e agitar a mistura por inverso durante 30 segundos.

OBSERVAO: O antgeno deve ser escoado rapidamente gota a gota e os reagentes devem estar temperatura ambiente.

REAO: A reao pode ser qualitativa e quantitativa.

QUALITATIVA: Separando o soro do coagulo (sangue colhido com seringas estreis e seca em tubo estril sem anticoagulante). Antes da prova o soro dever ser inativado a 56 C durante 30 minutos em banho - Maria.A prova dever ser realizada com soro na temperatura entre 23 a 29 C.Pipetamos em uma escavao da placa 0,5 ml de soro, espalhando o mesmo por toda a escavao. Juntamos 1 gota da suspenso do antgeno (com agulha que libera 50 gotas por ml, aproximadamente 0,017 ml). Rodamos a lamina em agitador Kline, ou na mo, durante 4 minutos, e lemos em seguida no microscpio, aumento de 100 vezes. Os achados so os seguintes:- Grumos mdios e grandes: soro reagente (R) ou 3+ e 4+.- Grumos pequenos: soro fracamente reagente (F) ou 1+ e 2+.- Ausncia de grumos (microcristais de colesterol distribudos uniformemente) soro no reagente (N).

QUANTITATIVA:Fazemos a diluio do soro (1:2, 1:4, 1:8, etc... at 1:64) em volumes de 0.1 ml. Com soro diludo seguimos a mesma tcnica da reao qualitativa, pipetando do menos concentrado para o mais concentrado.O titulo ser dado maior diluio onde houver reao.

6 AULA PRTICAREAO DE HEMLISE DOSAGEM DE ANTIESTREPTOLISINA O

INTRODUO:A maioria dos estreptococos do grupo A produzem duas toxinas com poderes hemolticos: A Estreptolisina O e a Estreptolisina S. Somente a estreptolisina O estimula a produo de anticorpos especficos, a Antiestreptolisina O.Os pacientes que esto ou estiveram h pouco tempo com infeco por Streptococcus do grupos A, apresentam ttulos elevados destes anticorpos na circulao.

OBJETIVO:A prtica pretende demonstrar que o organismo em presena de um antgeno, (estreptolisina O), produzido pelos estreptococos patognicos, induzido a produzir certos tipos de imunoglobulinas (anticorpos), que reagem com o antgeno neutralizando a ao da toxina.Quando a estreptolisina O em sua forma reduzida, colocada em presena e hemcias ocorre hemlise. Se porm esta estreptolisina colocada antes em presena de soro de pacientes que contenha o anticorpo antiestreptolisina O, esta neutralizar a estreptolisina e se ento juntarmos hemcias, elas no sero lisadas. O ttulo de estreptolisina corresponde maior diluio que impede a hemlise das hemcias (Tcnica de Rantz Randal). Titulo medido em unidade Todd. MATERIAL:- Estreptolisina O (liofilizada)- Tampo ASL O- Hemcias de carneiro ou humanas lavadas 3 vezes com salina. Usa-se a suspenso a 5% em tampo ASL O.- Pipetas de 1 ml- Pipetas de 5 ml- Tubos de hemlise

OBSERVAO: O soro do paciente dever ser inativado a 56 C em banho Maria por 30 minutos, a fim de evitar a interferncia do complemento, tambm de ao hemoltica. Preparar 3 diluies do soro a ser testado (1/10, 1/100, 1/500).Diluio 1/10 : 0.5 ml de soro + 4.5 ml de tampo.Diluio 1/100 : 1 ml da diluio de 1/10 + 9.0 ml de tampo.Diluio 1/500 : 2 ml da diluio de 1/100 + 8.0 ml de tampo.

Proceder titulao segundo a smula a seguir:Diluio do soro1/101/1001/500Controles

Hem-cias 5%Estrep-tolisina O

N dos tubos12 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

ml do soro diludo

ml de tampo

ml de estrep-tolisina O0,2

0,8

0,51,0 0,8 0,6 0,4 0,3

- 0,2 0,4 0,6 0,7

0,5 0,5 0,5 0,5 0,51,0 0,8 0,6 04

- 0,2 0,4 0,6

0,5 0,5 0,5 0,5- -

1,5 1,0

- 0,5

INCUBAR EM BANHO MARIA POR 15 MIN

Suspenso de hemcias O0,50,5 0,5 0,5 0,5 0,50,5 0,5 0,5 0,50,5 0,5

INCUBAR EM BANHO MARIA POR 45 MIN

Unidades resultantes em cada tubo50100 125 166 250 333500 625 833 1250Controles

INTERPRETAO:Centrifugar os tubos a 1500 a 2000 rpm. A unidade do soro considerada a mais alta diluio que no apresenta nenhum grau de hemlise. considerado positivo um soro com mais de 250 unidades de anti-estreptolisina ou unidades Todd.

7 AULA PRTICAINDUO DO CHOQUE ANAFILTICO EM CAMUNDONGOS

INTRODUO:As reaes anafilticas so produzidas por substncias farmacologicamente ativas liberadas das clulas de tecidos tais como masteitos e basfilos, aps reao entre o antgeno e o anticorpo especifico, adsorvido membrana destas clulas.A histamina parece ser o mediador de maior importncia na anafilaxia, tanto no homem como em animais, pois a injeo desta substncia reproduz um quadro muito semelhante ao choque anafiltico.A degranulao dos mastcitos pode ser observada in vivo e in vitro. Em seces de tecidos que tenham sofrido reaes anafilticas.

OBJETIVO:- Reproduzir o choque anafiltico em camundongos, atravs de injeo de histamina.- Observar a degranulao de mastcitos no mesentrio destes animais.

MATERIAL E MTODO:Injetar histamina (5 mg / kg) no peritneo de camundongos. Observar o choque e aps a morte abrir o animal; retirar pequenas partes do mesentrio e distender em lminas. Secar a 37 C, corar com corante de Wright e levar ao microscpio a fim de observar a degranulao dos mastcitos. 8 AULA PRTICAREAO DE INIBIO DA AGLUTINAO PASSIVA(Diagnstico imunolgico da gravidez)

INTRODUO:Quando fazemos reagir um antgeno particulado com um anticorpo especfico, ocorre uma reao de aglutinao (aglutinao direta), porm se o antgeno for solvel, poder ser feita uma adsoro artificial deste antgeno a uma partcula, que passa por sua vez a aglutinar em presena do anticorpo especifico contra o antgeno adsorvido. As partculas usadas podero ser hemcias, ltex, bentonita, etc. Chamamos este tipo de reao, aglutinao indireta ou passiva. O diagnostico imunolgico da gravidez poder ser feito pela pesquisa de Gonadotrofina Corinica (GCH) na urina, atravs da inibio da aglutinao passiva.GCH uma glicoprotena hidrossolvel produzida por clulas da placenta e secretada na urina e no sangue.

OBJETIVO:A prtica pretende demonstrar que ao juntarmos urina de mulher grvida (contendo antgeno GCH), ao seu anticorpo especfico, haver uma neutralizao do anticorpo e se ento adicionarmos mistura uma gota de partculas de ltex revestida com GCH, no haver aglutinao pois o anticorpo est neutralizado. Obs: Pelo mtodo a taxa de GCH na urina suficiente para a neutralizar o anti-soro obtida por volta do 13 dia aps o atraso menstrual.

MATERIAL:- Anticorpo anti GCH - Partculas de ltex revestidas com GCH- Urina- Pipetas- Lminas

MTODO:Filtrar a urina e colocar uma gota sobre a lamina, urina adiciona-se 1 gota do anti-soro. Homogeneizar com palito e juntar mistura uma gota de ltex revestido com antgeno. Homogeneizar com movimento circular e ler o resultado aps 2 minutos.

9 AULA PRTICAREAO INTRADRMICA TARDIA(teste tuberculnico de Mantoux)

INTRODUO:Indivduos que estiveram ou esto em contato com Mycobacterium tuberculosis, desenvolvem uma reao intradrmica tardia ao entrarem em contato com um derivado protico deste bacilo, revelando deste modo um foco tuberculoso em evoluo, simplesmente latente ou mesmo extinto.O teste comumente utilizado o de Mantoux: 0.1 ml de uma diluio que contenha a dose indicada de PPD Rt 23 (derivado protico purificao). A dose geralmente usada em sade pblica de 2 U. I. (Unidade Internacional). Segundo o Dr. Hugo Pires do Instituto Vital Brasil, uma unidade tuberculnica a dose de tuberculina em mg do bacilo de Koch, capaz de induzir alergia no homem ou animal infectado com o mesmo.

MATERIAL:- Seringa tipo insulina ou tuberculina com agulha apropriada- Antgeno- Rgua graduada

TCNICA:Aps assepsia com gua e sabo, injetar 0.1 cm3 de tuberculina, via intradrmica na face anterior do antebrao.Fazer a leitura da reao ao fim de 48 72 horas, medindo em milmetros, com rgua transparente o dimetro transversal mximo da regio endurecida.

INTERPRETAO DOS RESULTADOS0 a 4 mm No reator4 a 9 mm Reator fracoAcima da 10 mm Reator forte.

10 AULA PRTICAREAO DE HEMAGLUTINAO

Determinao dos grupos sanguneos sistema ABO e Rh

INTRODUO:Os grupos sanguneos humanos mais freqentes foram descritos por Landsteiner. Antes de seus descobrimentos sabia-se que o soro de certos indivduos aglutinava as clulas sanguneas de outros.De acordo com a nomenclatura internacional, os eritrcitos possuem antgenos ou aglutinognios denominados A e B, ao passo que os anticorpos ou aglutininas so designadas de Anti A e Anti B. Conforme a presena ou ausncia de tais substncias nas hemcias e no plasma de determinado sangue, pode este ser classificado em quatro tipos ou grupos A, B, AB e O . A estrutura dos antgenos A e B agora bem conhecida. A especificidade antignica reside em pequenos polissacardeos que podem ser reunidos a uma longa cadeia peptdica ou a uma esfingomielina chamada ceramina. No grupo A o monossacardeo a N-acetilgalactosamina; no grupo B ele galactose. A conjuno de aucares cadeia lipopolissacardica realizada por enzimas transferases especficas.As transferases que ligam monossacardeos posio 3 da galactose so codificadas por genes allicos A e B. Um terceiro gene allico O no produz transferase que modifique a substncia do grupo sanguneo, e se ambos os genes A e B estiverem ausentes o oligossacardeo remanescente chamado de substncia H.

OS QUATRO GRUPOS SANGUNEOSGRUPOSAGLUTINOGENOS (ANTGE-NOS) NAS HEMCIASAGLUTININAS (ANTICOR-POS) NO SORO

A AAnti B

BBAnti A

ABA e BNem uma, nem outra

ONem um, nem outro (substncia H)Anti a e Anti B

MATERIAL:- Soro aglutinante anti A- Soro aglutinante anti B- Sangue a examinar- Tubos de hemlise- Lminas- Centrfuga- Salina- Seringas e agulhas- Lancetas

MTODO:Colher o sangue com anticoagulante, centrifugar e separar o plasma dos glbulos.Preparar uma suspenso de 3 a 5% dos glbulos, com salina a 0,85%.Tomar 2 (dois) tubos de hemlise colocar 2 (duas) gotas da suspenso em cada um. No tubo 1 (um) colocar 2 (duas) gotas de soro anti A e no tubo 2 (dois) 2 (duas) gotas do soro anti B.Misturar por agitao delicada e examinar a aglutinao.

OBSERVAO: Esta prova poder ser feita tambm em lmina, colhendo uma gota por picada digital, embora com menos segurana.

RESULTADO:Observe a aglutinao ou no em cada tubo e discuta o resultado.

DETERMINAO DO FATOR Rh

INTRODUO:Alm dos aglutinadores A e B, existe o sistema antignico denominado Fator Rh encontrado em cerca de 85% dos indivduos. A presena deste fator pesquisada mediante um soro padro anti Rh, tambm conhecido como soro anti D, que provoca aglutinao das hemcias Rh positivas.O sistema Rh constitudo por vrios antgenos, determinado por pares de genes intimamente ligados (Teoria de Fisher e Race). O sistema complexo pois j foram encontrados acima de 30 especificidades e a natureza qumica destes antgenos permanecem desconhecidas.

11 AULA PRTICAREAO DE PRECIPITAO PROTENA E REATIVA

INTRODUO:Antgenos solveis em presena de seus anticorpos correspondentes, formam um precipitado, desde que a concentrao dos reagentes de acordo com a lei da ao das massas, permita a formao de complexos em concentrao suficiente para atingir o ponto de precipitao ou insolubilizao. As reaes de precipitao podem ocorrer em meio liquido ou slido; neste ultimo, o antgeno e anticorpo so incorporados em coluna ou laminas com gar e se difundem em velocidade caracterstica para cada espcie molecular (coeficiente de difuso), mas, influenciada pela concentrao, ao se encontrarem na zona de equivalncia formaro um precipitado insolvel.

PESQUISA DA PROTENA C REATIVA EM TUBO CAPILAR

Pacientes com determinadas condies inflamatrias agudas e crnicas produzem uma protena em quantidade aumentada que denominada Protena C reativa por ser capaz de formar um precipitado ao entrar em contato com o polissacardeo C do S. Pneumonicae.

TCNICA:1. Mergulhar o tubo capilar (0,8 x 100 mm) no soro antiprotena C reativa (Difco, ou Schiefflin) e encher 1/3 do seu comprimento.2. Limpar a extremidade do tubo, mergulha-la no soro do paciente (no usar plasma) e aspirar, por capilaridade, volume igual de soro. Cuidar para que no fique bolha de ar entre os dois soros. Misturar, por inverso repetida do tubo.3. Implantar o tubo verticalmente em suporte de plasticina, ou cera de modelagem, deixando uma coluna de ar entre o fundo do tubo e a plasticina.4. Praticar teste idntico com soro positivo e com soro negativo. 5. Incubar a 37 C por 2 horas e deixar no refrigerador at o dia seguinte.6. Praticar a leitura das reaes: nos casos positivos forma-se um precipitado que poder ser expresso semiquantitativamente de 1+ a 4+, na dependncia da quantidade do precipitado.

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Manual de Aulas Prticas de Imunologia