GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

MONOGRAFIA

Presentado como requisito parcial Para optar el título de

ESPECIALISTA EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

DIRECTOR

Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc

CODIRECTOR

Dra. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

“Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas,

son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la “Pontificia

Universidad Javeriana”

(Artículo 9.18 del reglamento de trabajos de grado y

de investigación. Agosto de 1989)

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS

PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc DIRECTORA

DRA. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp CODIRECTORA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA

ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ

Dra. Diana Patiño C. M.Sc. COORDINADORA ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE

INMUNOLOGÍA CLÍNICA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005

A Dios que siempre esta a mi lado guiándome.

A mis padres al igual que a mis hermanos y a Sofí.

A Ricardo porque sin todo su amor y apoyo nunca lo hubiera

logrado..

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Diana Patiño por permitirme trabajar con ella y brindarme siempre su

apoyo y amistad incondicional y a la Doctora Maria Claudia Ortega por su gran

ayuda y paciencia durante el desarrollo de este trabajo. A todas las personas del

laboratorio de Inmunológia y Hematología de la facultad de ciencias por toda su

colaboración.

7

INDICE DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002. 8 Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X. 9 Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a

inmunodeficiencia combinada severa. 10 Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas

a inmunodeficiencia combinada severa. 11

Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las inmunodeficiencias primarias . 24

Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de hipersensibilidad retardada. 31

8

INDICE DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la LAGID 7 Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta

afectado en los pacientes con granulomatosis crónica 13

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia 22

Figura 4. Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia 25 Figura 5. Fundamento de la Citometría de Flujo 29 Figura 6. Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo 30 Figura 7. Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometría de Flujo. 32 Figura 8. Prueba de liberación de cromio 34 Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría

de Flujo. Figura 10. Quimiotaxis en filtro. 38

9

TABLA DE CONTENIDO Pág 1. Definición del problema 1 2. Justificación 3

3. Objetivos 4 3.1 Objetivo General 4 3.2 Objetivos específicos 4

4. Marco Teórico 5 4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias 5

4.1.1 Epidemiología 6

4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias 9

4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias 12

4.3.1 Ligadas a X 12

4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC) 12

4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton) 13

4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM 14

4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich 15

4.3.2 Autosomicas recesivas 16

4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa 16

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA) 17

4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP) 17

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2 18

4.3.2.5 Deficiencia de Zap70 18

4.3.2.6 Deficiencia de Jak3 19

4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria 19 4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi 20 4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune 20

10

4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia 21

4.4 Pruebas diagnosticas 22 4.4.1 Pruebas de primera etapa 23 4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa 26

4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 26

4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas 26

4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas 27 4.4.2.1.3 Isohemaglutininas 28 4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos 28 4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría 28 4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 30

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada 30

4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría 31

4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría 32

4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK 33

4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK 34

4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas 35

4.4.4.3.1 Reducción de NBT 36

4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno 36 4.2.2.3.4 Quimiotaxis 37 4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos 38 4.2.2.3.6 Adherencia 39 4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento 39 4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4 39 4.2.2.4.2 Complemento hemolítico 50 (CH50) 40

11

4.2.2.4.3 CD59 en eritrocitos 40 4.2.3 Pruebas de tercera etapa 41 4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 41 4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in Vitro 41 4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO 41 4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales (SSCP) 42 4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 42 4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos 42 4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In Vitro 43 4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1 43 4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas 44 4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa 44 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 45 6. BIBLIOGRAFIA 46

12

1. Definición del problema Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogéneo de desordenes

generalmente hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y

humoral (Linfocitos B) especifica o los mecanismos de defensa no específicos del

huésped (Células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre otros).

En la mayoría de los casos se manifiestan en el primer año de vida, no obstante,

pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos (Lim, 2004). Afectan

individuos de ambos sexos. Sin embargo, en los menores de cinco años se

presenta más en los varones con una relación 5:1 con respecto a las mujeres,

mientras que en los adultos la frecuencia es muy similar (Montoya, 2004).

La incidencia de las inmunodeficiencias primarias se ha incrementado de 10 casos

reportados en 1969 a 1 en 10.000 nacidos vivos (Lim, 2004) y varia dependiendo

del tipo especifico de inmunodeficiencia primaria y de otros factores como la etnia

y la endogamia (Montoya, 2004).

Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto

molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias

autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100

enfermedades por deficiencia inmunológica. Pero, esta cifra puede ser aún mayor,

si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre, entre

1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las

células del sistema inmune (Montoya, 2004).

Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy

variadas en función del defecto inmunológico, muchos niños inmunodeficientes

pueden desarrollar síntomas como erupciones y alteraciones en la pigmentación

13

de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema esquelético y del

corazón, entre otros. Los defectos que implican alguna alteración en la función de

la célula de B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes que a menudo y

según el compromiso de la respuesta humoral pueden terminar en septicemia

bacteriana. La carencia de la producción de anticuerpos puede también aumentar

la susceptibilidad a infecciones por enterovirus dando por resultado meningitis viral

crónica y giardiasis entre otras. Las células T son esenciales para el control de la

enfermedad viral y fúngica, no obstante, también proporcionan la función de

colaboración a las células B mediante la liberación de citocinas como activadoras

de la respuesta inmune de tipo humoral garantizando así, una respuesta

adecuada y efectiva. Enfermedades como la inmunodeficiencia combinada severa

(IDSC) de LT y LB da como resultado susceptibilidad aumentada a enfermedades

por patógenos virales, fúngicos y bacterianos. Los pacientes con desórdenes de

granulocitos son susceptibles a las enfermedades por Estaphylococcus y a

infecciones por microorganismos Gram negativos (Lim, 2004).

Como se puede observar los pacientes con algún tipo de inmunodeficiencia

primaria, en especial los niños, son un blanco fácil para el desarrollo de

infecciones recurrentes por diferentes tipos de patógenos (bacterias, virus, hongos

y parásitos). Dado que el tratamiento de elección para el control de infecciones

recurrentes es el uso de antibióticos se ha observado la generación de altas

resistencias a los mismos (Lim, 2004).

14

2. Justificación En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen pruebas

inmunológicas especificas para el diagnostico de pacientes con

inmunodeficiencias primarias. Razón por la cual los pacientes se ven sometidos a

estar por largos periodos en instituciones hospitalarias debido a las múltiples

infecciones que presentan y que ponen en riesgo su vida.

Esto se debe en gran parte a la poca información sobre la presentación clínica de

las inmunodeficiencias primarias, al limitado acceso a las pruebas diagnosticas y

a los pocos laboratorios especializados que existen actualmente en el país.

El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal medico

establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o por lo menos disminuir la

estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias, evitando así los altos

costos con relación a la demora en el diagnostico y manejo adecuado, tanto para

las entidades prestadoras de salud al igual que para el paciente y sus familiares

Las razones previamente expuestas nos llevan a revisar cuáles son las pruebas

de laboratorio que existen actualmente que puedan ser útiles para la confirmación

diagnostica temprana por parte del personal medico que acompaña a pacientes

con algún tipo de inmunodeficiencia primaria y de esta manera proporcionar una

herramienta de consulta para llevar a cabo un diagnostico mas certero.

15

3. Objetivos

3.1 Objetivo General: Realizar una revisión de la literatura científica lo más actualizada posible sobre las

pruebas del laboratorio de inmunología clínica útiles en el diagnostico de pacientes

con inmunodeficiencias primarias.

3.2 Objetivos específicos

1. Describir los aspectos clínicos más relevantes de las inmunodeficiencias

primarias.

2. Revisar y definir cuáles son las pruebas de primera etapa que debe solicitar

el medico para aproximarse al diagnostico cuando hay sospecha de

inmunodeficiencia primaria.

3. Definir cuales son las pruebas de segunda etapa útiles para llegar a un

probable diagnostico de acuerdo al componente inmunológico que se

presume se encuentra alterado.

4. Describir las pruebas de tercera etapa para llegar a un diagnostico

molecular confirmado de los pacientes con inmunodeficiencia primaria.

16

4. Marco Teórico 4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias

Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogéneo de desordenes

generalmente de origen hereditario que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T)

y humoral especifica (Linfocitos B) o los mecanismos de defensa no específicos

del huésped (células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre

otras). Estos desordenes en el sistema inmune causan una incrementada

susceptibilidad a las infecciones y posible desarrollo de enfermedades autoimunes

(Lim, 2004). En la mayoría de los casos se manifiestan en los cinco primeros años

de vida (90%), no obstante, pueden presentarse a cualquier edad incluyendo

adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los registros

demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001). Se estima que

1 de cada 10.000 niños nacidos vivos presentan a lo largo de su infancia algún

tipo de inmunodeficiencia primaria (Lim, 2004).

Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto

molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias

autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100

enfermedades por deficiencia inmunológica. Sin embargo, esta cifra puede ser aún

mayor, si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre,

entre 1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las

células del sistema inmune (Montoya, 2004).

Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy

variadas en función del defecto inmunológico, en algunos niños se presenta

desmedro en el crecimiento y en el desarrollo como consecuencia de las

17

infecciones que presentan a repetición. Otros síntomas que podrían estar

asociados a las inmunodeficiencias primarias son; erupciones y alteraciones en la

pigmentación de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema

esquelético y del corazón. Los defectos que implican alguna alteración en la

función de los linfocitos B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes, a

menudo relacionados con septicemia bacteriana. La carencia de la producción de

anticuerpos puede también aumentar la susceptibilidad a las infecciones por

enterovirus dando como resultado el desarrollo de meningitis viral crónica y

giardiasis gastrointestinal. Las células T son esenciales para el control de la

enfermedad viral y fúngica ya que colaboran con las células B mediante la

liberación de citocinas que promueven una respuesta inmune adecuada y efectiva.

Así, desórdenes como la inmunodeficiencia combinada severa de LT y LB da

como resultado una mayor susceptibilidad a los patógenos virales, fúngicos y

bacterianos (Lim, 2004).

4.1.1 Epidemiología: La prevalecía de pacientes con inmunodeficiencias primarias se ha incrementado

de un caso reportado en 1969 a 1 por cada 10.000 nacidos vivos, este incremento

se puede deber particularmente a que son enfermedades de las cuales se

sospecha más en la actualidad y al mejoramiento de las pruebas utilizadas en la

detección de anormalidades inmunológicas. Algunas de estas pruebas permiten la

identificación de algunas mutaciones en los genes responsables de estos

desordenes lo que permite detectar mas fácil y rápidamente a este tipo de

pacientes (Lim, 2003).

En la mayoría de los casos las inmunodeficiencias primarias se manifiestan en los

primeros cinco años de vida (90%), pero pueden presentarse a cualquier edad

incluyendo adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los

registros demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001).

18

19

En cuanto a la prevalencia de inmunodeficiencias primarias se encuentran

diferentes reportes como el publicado por la asociación latinoamericana de

inmunodeficiencias primarias LAGID en 1998 en el que se encontró que las

inmunodeficiencias primarias por defectos en los anticuerpos son las más

frecuentes (Zelazko, 1998).

Figura 1. Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la LAGID (Zelazko, 1998)

En Colombia actualmente los únicos datos de prevalencia de inmunodeficiencias

primarias, son los publicados por el Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la

Universidad de Antioquia, en este estudio se tomaron pacientes a los cuales se les

hizo seguimiento por varios años, obteniéndose que las deficiencias de

anticuerpos son las mas predominantes en nuestro país seguidas por las

Anormalidades asociadas a defectos en los granulocitos (8%)

Desordenes de fagocitos (9%)

Inmunodeficiencia combinada severa (5%) Deficiencias de

Complemento (2%)

Deficiencia de anticuerpos (58%)

Síndromes asociados con otras anormalidades (18%)

deficiencias combinadas, estos datos concuerdan con los encontrados

mundialmente en otros estudios como los de LAGID en 1998. (Tabla 1)

Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002 (Montoya, 2002)

Fenotipo Predominante Hombres Mujeres Total Deficiencias predominantes de anticuerpos Hipoagamaglobulinemia transitoria de la infancia 10 4 14 Inmunodeficiencia común variable 2 9 11 Agamaglobulinemia congénita 8 0 8 Déficit de IgA 2 1 3 Síndrome de hiper IgM 1 1 2 Deficiencia de anticuerpos con Ig normales 0 0 1 Inmunodeficiencia común variable con timoma 1 0 1 Subtotal (%) 40 (40.8) Deficiencias combinadas Inmunodeficiencia Combinada severa 5 8 13 Inmunodeficiencia combinada no severa 2 0 2 inmunodeficiencia celular con Igs normales 1 5 6 Subtotal (%) 21 (21.5) Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas con otros defectos mayores Candidiasis mucocutanea crónica 4 2 6 Síndrome de Wiskott Aldrich 4 0 4 Ataxia Telangiectasia 1 1 2 Anomalía de DiGeorge 0 2 2 Enanismo con extremidades cortas 1 0 1 Subtotal (%) 15 (15.3) Síndromes de inmunodeficiencia asociados con disfunción de los fagocitos Síndrome de hiper IgE con infecciones recurrentes 6 4 10 Síndrome de Chediak Higashi 2 3 5 Subtotal (%) 15 (15.3) Defectos Primarios de las células fagocíticas Enfermedad Granulomatosa Crónica 4 0 4 Neutropenia Congénita Severa 1 1 2 Subtotal (%) 6 (6.1) Deficiencias del complemento Edema angioneurotico hereditario 0 1 1 Subtotal (%) 1 (1.0) Total 55 43 98 100%

20

4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias El aumento reciente sobre el conocimiento de los defectos moleculares de muchas

de las inmunodeficiencias primarias ha llevado a grandes avances en el

diagnóstico y manejo de estas patologías permitiendo clasificarlas de acuerdo al

tipo de defecto genético que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X (Tabla

2) e inmunodeficiencias autosomicas recesivas que a su vez se subclasifican en

inmunodeficiencia combinada severa Tabla 3) y en no asociadas a

inmunodeficiencia combinada severa (Tabla 4)

Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X (Jones, 2000)

Desorden (año de definición del defecto

molecular)

Localización cromosomica Gen Defecto Prueba diagnostica

Enfermedad granulomatosa crónica ligada a X (1986) Xp21 gp91phox Componente de

fagocitosis NADPH

Nitro azul de tetrazolio (NBT), inmunoblot para gp91phox, análisis de mutaciones

Agamaglobulinemia ligada a X (1993) Xq22 Tirosin Kinasa

de Bruton

Vía de señalización intracelular esencial para la maduración de células pre-B

Inmunoblot para Btk o análisis por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Inmunodeficiencia combinada severa ligada a X (1993)

Xq13 Cadena común γ

Componentes de los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, desarrollo de células T y NK, función de células T y B

Expresión de CD154 sobre LT activados por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Síndrome de Hyper-IgM (deficiencia de CD40L) (1993)

Xq26 CD40L (CD154)

Cambio de Isotipo, función de LT

Expresión de CD145 sobre LT activados por citometría de flujo, análisis de mutaciones

Síndrome de Wistkott-Aldrich (1994) Xp11 WASP

Formación del citoesqueleto, movilidad y trafico de células inmunes

Expresión de WASP por inmunoblot, análisis de mutaciones

Síndrome linfoproliferativo ligado a X (Síndrome de Duncan) (1998)

Xq25 SAP Regulación de la respuesta de LT a EBV y otras infecciones virales

Análisis de mutaciones, Expresión de SAP

Deficiencia de properdina (1992) Xp21 Properdina Componente terminal del

complemento Niveles de Properdina

21

Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia combinada severa (Jones, 2000)

Desorden (año de definición del defecto molecular)

Localización cromosomica Gen Defecto Prueba diagnostica

Deficiencia de adenosin deaminasa (ADA) (1983) 20q12-13 Adenosin

deaminasa

Enzima en la vía de las purinas, acumulación de metabolitos tóxicos

Niveles de ADA y metabolitos en eritrocitos, análisis de mutaciones

Deficiencia de la fosforilasa de purina (PNP) (1987) 14q11 Fosforilasa

de purina

Enzima en la vía de las purinas, acumulación de metabolitos tóxicos

Niveles de PNP y metabolitos en eritrocitos, análisis de mutaciones

Deficiencia del gen de activación de la recombinasa (RAG 1 y 2) (1996) Síndrome de Omenn

11p13 RAG1 y RAG2

Defectos en la recombinación de DNA afectando inmunoglobulinas y el gen del receptor de de LT

Análisis de las mutaciones en RAG1 y RAG2

Deficiencia en el receptor de LT (1987) 11q23 CD3γ/CD3ε Función y señalización del

receptor de LT

Intensidad de fluorescencia de CD3, análisis de mutaciones

Deficiencia de Zap70 (1994) 2q12 Zap70 Función de LT, selección de LTCD8+ durante el desarrollo del timocito

Expresión y activación de Zap70, análisis de mutaciones

Deficiencia de JAK3 (T-B+NK-SCID) (1995) 19p13 JAK3

Receptor de señalización de Il-2, Il-4, IL-7, IL-9, IL-15, desarrollo de LT y NK, Función de LT y LB

Activación y expresión de JAK3, análisis de mutaciones

Deficiencia en el receptor de IL-7 (1998) 5p13 Receptor α

de IL-7 Rol esencial en desarrollo y función de LT

Expresión de IL-7α por citometría, análisis de mutaciones

22

Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia combinada severa (Jones, 2000)

Desorden (año de

definición del defecto molecular)

Localización cromosomica Gen Defecto Prueba diagnostica

Deficiencia de adhesión leucocitaria tipo I (1987) 21q22 CD11/CD18 Defectos en la adhesión y

migración de leucocitos

Análisis de la expresión de CD18/CD11 por citometría, análisis de mutaciones

Enfermedad granulomatosa crónica (1990) (1990) (1988)

7q11, 1q25, 16p24

p47phox, p67phox, p22phox

Defectos en la bolsa respiratoria y muerte intracelular de fagocitos

Expresión de p47phox, p67phox, p22phox por inmunoblot, análisis de mutaciones

Síndrome de Chediak Hisgashi (1996) 1q42 LYST

Anormalidades en los microtubulos mediado por las proteínas lisosomales circulantes

Inclusiones gigantes en los granulocitos, análisis de mutaciones

Deficiencia de MHC clase II (1993) (1998) (1995) (1997)

16p13, 19p12, 1q21, 13q13

CIITA (MHC2TA), RFXANK, RFX5, RFXAP

Defecto en la regulación transcripcional de la expresión de la moléculas de MHCII

Expresión de MHCII, análisis de mutaciones

Deficiencia de MHC clase I (1994) (1999)

6p21 6p21

TAP2 TAP1

Defecto en el ensamblaje del péptido y en la presentación de las moléculas de MHCI

Expresión de MHCI

Síndromes autoinmunes Linfoproliferativos (ALPS) (1995)

10q24 APT1 (Fas) Defectos en la apoptosis

de Linfocitos

expresión de Fas, ensayos de apoptosis, análisis de mutaciones

Ataxia telangiectasia (1995)

11q22 ATM Control del ciclo celular y respuesta de daño de DNA

Sensibilidad del DNA a la radiación, análisis de mutaciones

Susceptibilidad inherente a micobacterias (1996) (1998) (1998)

6q23 5q31 19p13

Receptor de Interferón γ, IL-12 p40, Receptor β1 de IL-12

Defecto en la producción de Interferón γ y en la función de señalización

Expresión del receptor de Interferón γ, expresión de IL-12, Expresión del receptor de IL-12, análisis de mutaciones

23

4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias 4.3.1 Ligadas a X

4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC)

La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) es la inmunodeficiencia primaria

por deficiencia de fagocitos más comúnmente diagnosticada, con una mayor

prevalencía en hombres que en mujeres (Cooper, 2003). La EGC es causada por

un defecto funcional en varios componentes de sistema NADPH oxidasa de los

fagocitos (Lim, 2004). Existen dos patrones de herencia: el primero ligado al sexo,

por mutación en el gen de la phox 91 (Xp21.1), representa la forma más frecuente

(65%), de comienzo más temprano y curso más severo y el segundo; autosómico

recesivo por mutaciones en los genes de la phox 22 (16q24), phox 47 (7q11.23) y

phox 67 (1q25) (Lim, 2004).

Las manifestaciones clínicas comprenden infecciones recurrentes severas y

supurativas; abscesos del tejido subcutáneo, el hígado y los pulmones,

gingivoestomatitis, periodontitis, adenitis piógena supurativa, osteomielitis

multifocal y enfermedad diarreica recurrente. La mala regulación en la respuesta

inflamatoria lleva a la formación de granulomas en muchos órganos que pueden

producir obstrucción de los aparatos digestivo y genitourinario (Rugeles, 2004).

El defecto molecular de la EGC es una deficiencia en la bolsa respiratoria. Los

componentes estructurales de sistema oxidativo NADPH se requieren para la

generación de superoxido y otras especies reactivas importantes en la fagocitosis

de microorganismos. El sistema NADPH se compone de cuatro componentes, 2

de ellos (phox 91 y phox 22) ubicados en la membrana plasmática del fagocito

formando el citocromo b558 y otros dos (phox 47 y phox 67) ubicados en el

citoplasma. La activación del sistema requiere la movilización de los componentes

24

citoplasmáticos hacia la membrana y su acople al citocromo. La ausencia o

disfunción de alguno de estos componentes imposibilita el correcto funcionamiento

enzimático

Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con granulomatosis crónica (Mackay, 2000).

4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)

La Agamaglobulinemia ligada a X fue la primera inmunodeficiencia primaria

identificada en 1952 por Bruton, por lo que también es llamada

agammaglobulinemia de Bruton, en esta enfermedad hay ausencia de células B

en sangre periférica y órganos linfoides debido a un defecto molecular que

imposibilita la supervivencia de la célula B (Rugeles, 2004). Esta enfermedad

afecta exclusivamente a varones, inicia sus manifestaciones clínicas más

tempranamente que otras formas de deficiencias de anticuerpos. Las principales

25

manifestaciones clínicas son las infecciones recurrentes, pero además de ellas los

pacientes pueden presentar cuadros de artritis crónica o cuadros semejantes a

dermatomiocitis. Las infecciones virales son controladas normalmente en su

mayoría con excepción de infecciones por enterovirus del sistema nervioso central

(meningoencefalitis crónica). El examen físico muestra la ausencia de ganglios

linfáticos superficiales y amígdalas. Las inmunoglobulinas séricas son

indetectables o están francamente disminuidas (por lo general la IgG es menor de

200 mg/dl) y los linfocitos B en sangre periférica están ausentes o muy

disminuidos (menor al 2 %). La inmunidad celular no está afectada (Oleastro,

2001).

Esta deficiencia está determinada por una alteración en la proteína kinasa Btk

(Bruton tirosin kinasa), proteína relacionada con la maduración y proliferación del

linfocito B. La falta de actividad de esta proteína como consecuencia de

mutaciones en el gen que la codifica genera un bloqueo en la maduración a nivel

del estadio de células pre-B (Jones, 2000).

4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM

Se caracteriza por presentar tanto niveles normales como muy elevados de IgM

con marcada hipogammaglobulinemia IgG e IgA. Además de las infecciones

recurrentes por gérmenes extracelulares encapsulados, los pacientes suelen

presentar infecciones por Pneumocystis carinii, episodios de neutropenia,

manifestaciones de autoinmunidad (citopenias hemáticas, artritis) y mayor

predisposición a las neoplasias de estirpe linfoide (linfomas y leucemias). Estos

pacientes comúnmente presentan adenomegalias, hipertrofia amigdalina y

hepatoesplenomegalia. El recuento de linfocitos B circulantes es normal y la

inmunidad celular generalmente está conservada (Oleastro, 2001).

26

La falla molecular responsable se ubica en el ligando de CD40, molécula

normalmente expresada en linfocitos T activados, imprescindible para el cambio

de isotipo de IgM a IgG e IgA. Mutaciones en el gen de esta molécula condicionan

la falta de síntesis o la síntesis de una molécula no funcional (Jones, 2004).

4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich

El síndrome de Wiskott Aldrich (WAS) es una enfermedad recesiva ligada al sexo

con una incidencia mundial de 4 enfermos por cada millón de niños varones

nacidos vivos (Chien, 2004). Se manifiesta por eczema, infecciones recurrentes y

trombocitopenia (Lim, 2004). Las manifestaciones suelen aparecer durante el

primer año de vida. El eczema adquiere las características de una dermatitis

atópica con gran tendencia hemorrágica. Las infecciones se localizan

principalmente en el tracto respiratorio tanto superior (conjuntivitis, sinusitis, otitis

media) como inferior (bronquitis, neumonías). Los gérmenes responsables son

especialmente microorganismos piógenos (Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae). Las infecciones virales por herpes simple o por varicela

zoster suelen ser severas y condicionar una alta morbimortalidad. El cuadro clínico

puede completarse con manifestaciones de autoinmunidad como vasculitis,

glomerulonefritis o anemias (Lim, 2004).

Las concentraciones de IgM en suero son reducidas, mientras que las

concentraciones de IgA e IgE son elevadas y la IgG se encuentra normal (Lim,

2004). En algunos casos se puede encontrar un déficit de las subclases de IgG2 e

IgG4. La formación de anticuerpos, especialmente a polisacáridos capsulares

bacterianos se encuentra defectuosa, además los pacientes presentan una pobre

respuesta a antígenos de tipo proteico (Lim, 2004) como isohemaglutininas y

anticuerpos anti-neumococo (Oleastro, 2001).

27

El gen responsable del síndrome del Wiskott Aldrich codifica para la proteína

WASP localizada en el cromosoma Xp11.22-p11.23, se han identificado diferentes

mutaciones localizadas a través del gen, pero la más común envuelve la

sustitución de nucleótidos. La interacción entre la proteína WASP el Cdc42 de la

familia GTPasa Rho y el complejo organizador del citoesqueleto Arp2/3 es muy

importante en la transducción de señales que cuando presentan algún tipo de

alteración se refleja en problemas a nivel de señalización, polarización, movilidad y

fagocitosis de las células (Chien, 2004).

4.3.2 Autosomicas recesivas

4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa

Esta forma se presenta solamente en varones y se debe a la falta total de

diferenciación de precursores linfoides pretímicos. Como consecuencia de ello se

observa una marcada linfopenia con ausencia de linfocitos T maduros. Los

linfocitos B, que se encuentran presentes en número normal o incluso aumentado;

son funcionalmente deficientes (agammaglobulinemia). Las células NK están

ausentes o francamente disminuidas con pobre actividad citotóxica (Bonilla,

2003).

El defecto molecular responsable se encuentra en la cadena gamma común,

cadena que comparten los receptores para varias citocinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e

IL-15). Esta cadena se encuentra asociada a la tirosina kinasa JAK3, unión

necesaria para transmitir la señal de activación celular hacia el interior de la célula.

Mientras que la disfunción de los receptores para IL-2 e IL-7 genera el bloqueo en

el desarrollo de LT, la alteración del receptor para la IL-15 sería la responsable de

la deficiencia de células NK. Diferentes tipos de mutaciones en el gen que codifica

para la cadena gamma del receptor de IL-2 generan alteraciones en la

transcripción necesaria para una síntesis proteica normal (Lim, 2004).

28

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)

La deficiencia de adenosina deaminasa (ADA), representa aproximadamente el 20

% de todos los casos de Inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) y el 40 % de

los de transmisión autosómica recesiva. ADA, es una enzima que interviene en el

metabolismo de las purinas, transforma reversiblemente la adenosina en inosina y

2' - deoxiadenosina (dAdo) en 2' deoxiinosina. La acumulación de adenina y dAdo

tiene efectos tóxicos sobre los linfocitos, especialmente en estadíos inmaduros

(timocitos). Además, Ado es fosforilado en dATP, el cual ejerce un efecto

inhibitorio sobre la ribonucleótido reductasa, enzima requerida para la síntesis del

ADN. La enzima S-adenosil – homocisteína hidrolasa (SAH hidrolasa), enzima

necesaria para la normal metilación del ADN, también se ve inactivada por la

acumulación de estos sustratos.

En el 85 % de los casos de deficiencia de ADA las manifestaciones clínico-

inmunológicas corresponden a una IDCS. Se observa una alta incidencia de

alteraciones neurológicas y, en el 50 % de los casos, una displasia osteocondral

visible radiológicamente. Estos individuos presentan una marcada linfopenia con

compromiso variable de las células NK. El diagnóstico se establece documentando

una actividad enzimática deficiente en eritrocitos y linfocitos y/o midiendo las altas

concentraciones de dATP (Jones, 2004).

4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)

La fosforilasa de purina (PNP) juega un papel importante en la vía salvaje de

purina, la deficiencia de PNP es una enfermedad autosomica recesiva que causa

una deficiencia severa de LT con deficiencias variables en la inmunidad humoral,

los pacientes con deficiencia de PNP presentan infecciones bacterianas, virales y

fúngicas recurrentes usualmente en los primeros años de vida

29

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2

Se hereda en forma autosómica recesiva y resulta de un defecto en el proceso de

recombinación de los fragmentos VDJ en la recombinación genética de las

inmunoglobulinas, a consecuencia de esto se interrumpe totalmente la

diferenciación de linfocitos T y B. La diferenciación de células NK no se ve

afectada por lo cual el número y la funcionalidad de estas células se encuentra

conservado (Jones, 2004).

Rag1 y Rag2 (recombinase-activating gene 1 ó 2) forman un complejo con

actividad endonucleasa requerido para iniciar el proceso de recombinación de los

genes VDJ durante la formación de los receptores para antígenos tanto de los

linfocitos T (TCR) como de los B (BCR). Estos receptores son necesarios para

transmitir señales de sobrevida en precursores linfoides durante el desarrollo de

las células T y B. Distintas mutaciones en los genes Rag1 o Rag2 son

responsables del desarrollo de la enfermedad (Jones, 2004).

4.3.2.5 Deficiencia de Zap70

Esta deficiencia se transmite en forma autonómica recesiva. La proteína ZAP 70

(zeta associated protein 70), proteína kinasa expresada exclusivamente en

linfocitos T y células NK, juega un papel esencial en el proceso de selección

positiva y negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T, principalmente

para los linfocitos que expresan el marcador CD8. Se encuentra unida a la cadena

ζ del complejo CD3 interviniendo en la señalización de estas células.

Mutaciones en el gen ZAP 70 (o SRK) generan un cuadro de inmunodeficiencia

celular variable en cuanto a su severidad. Es Característico encontrar en los niños

valores normales de linfocitos T CD3+ con predominio de CD4+ y ausencia o

30

disminución marcada de los CD8+. A pesar de encontrarse en número total normal

o incluso elevado, estos linfocitos CD4+ son incapaces de responder a la

estimulación in vitro frente a mitógenos específicos o células alogénicas. Los

linfocitos B y las células NK son normales tanto en número como en función (Lim,

2001).

4.3.2.6 Deficiencia de Jak3

Esta enfermedad se transmite con un patrón de herencia autosómico recesivo. El

defecto molecular se encuentra en la proteína kinasa JAK 3 (Janus associated

kinase 3), proteína asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común

que interviene en la transducción de la señal generada tras la unión de las

citocinas a sus respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el

desarrollo de linfocitos.

4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria Esta enfermedad de se debe a la falta de expresión de un grupo de proteínas

expresadas en la superficie celular denominadas moléculas de adhesión (LAD-1 y

LAD-2). LAD-1, de herencia autosómica recesiva, comprende defectos en las

cadenas β (CD18) de las moléculas LFA1 (CD11a-CD18), CR3 (CD11b-CD18) y

glucoproteína 150-95 (CR4 o CD11c-CD18). La edad de comienzo de las

manifestaciones clínicas y su gravedad dependen del grado de expresión de las

moléculas. Las formas severas (menos del 1% de expresión) presentan sus

primeras manifestaciones en el período neonatal con retardo en la caída del

cordón umbilical y posterior onfalitis, piodermitis necrotizantes, neumonía o sepsis

por S. aureus, Pseudomonas aeruginosa o Escherichia coli. Las formas

moderadas (expresión entre 10-20%) se presentan en edades más avanzadas con

otitis media aguda, fístulas de tejido celular subcutáneo (especialmente

perianales) y periodontitis. Es típico encontrar lesiones carentes de pus y a nivel

hematológico se encuentra una marcada neutrofilia.

31

El diagnóstico se confirma demostrando por citometría de flujo la ausencia o

disminución de la expresión de la molécula CD18 en la superficie celular. Las

formas severas tienen un curso fatal en los primeros años de vida por lo cual

deben ser sometidas a un transplante de medula ósea alogénico. Para LAD-2 se

ha visto un número reducido de pacientes con manifestaciones similares a LAD 1,

acompañadas de talla baja y retardo mental, en los que se ha encontrado

deficiencia de otra molécula denominada Sialil-Lewis X (CD15s) (Oleastro, 2001).

4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi Es un desorden autosomico recesivo de todos los gránulos lisosomales contenidos

en las células con características clínicas que envuelven los sistemas

hematopoyeticos y neurológicos (Mackay, 2000). Esta enfermedad es transmitida

como un rasgo autosomico recesivo que se origina por mutaciones del gen chs1

que codifica para la proteína LYST, esta proteína es muy importante para la

regulación del transporte lisosomal y la función del citoesqueleto. Este defecto

impide la formación normal de los fagolisosomas y de los melanosomas, vesículas

importantes en el proceso de fagocitosis (Rugeles, 2004).

Las características clínicas de este síndrome son infecciones bacterianas

recurrentes especialmente por S. aureus y estreptococos β-Hemolíticos, defectos

en los nervios periféricos, retardo mental, albinismo ocular y cutáneo parcial,

disfunción plaquetaria y enfermedad periodontal severa (Mackay, 2000).

4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune Se origina por mutaciones en el gen que codifica para la proteína adaptadora

SH2D1A que acopla moléculas que se encuentran en la superficie de los

leucocitos e interviene en las vías de señalización intracelular. La función principal

de esta molécula parece ser la regulación negativa de las señales de activación de

los linfocitos T, por lo tanto en estos pacientes se describe una proliferación

linfocitaria descontrolada.

32

La enfermedad se manifiesta generalmente antes de los 5 años, los niños

afectados no presentan sintomatología hasta que desarrollan alguna infección por

microorganismos intracelulares como el virus de Epstein Barr el desencadenante

mas común de la sintomatología (Rugeles, 2004).

4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia

La ataxia telangiectasia es una enfermedad de transmisión autosómica recesiva

caracterizada por presentar ataxia cerebelosa, telangiectasias oculo- cutáneas e

infecciones recurrentes. Estas últimas se presentan por lo general en forma de

otitis, bronquitis purulentas o neumonías. La ataxia que suele hacerse evidente

cuando el niño empieza a caminar, tiene curso progresivo llevando a una gran

incapacidad. Las telangiectasias aparecen a edades variables, por lo general

antes de los 5 años de edad en conjuntiva bulbar y/o pabellones auriculares

(Oleastro, 2001).

Es característico encontrar la α-feto proteína elevada en un 95 % de los casos. La

IgG puede encontrarse dentro de los valores normales o incluso estar disminuida,

y puede estar asociada o no a deficiencias de IgG2 o IgG4. En la gran mayoría de

los casos la IgA esta ausente al igual que la IgE. La IgM puede estar normal o

elevada. La inmunidad celular, inicialmente poco afectada, va mostrando con el

tiempo una franca linfopenia (Oleastro, 2001).

Una característica muy particular de este cuadro es la hipersensibilidad a las

radiaciones ionizantes y la falla en los mecanismos normales de reparación del

ADN responsables de rupturas cromosómicas que involucran particularmente a los

genes que codifican para los receptores para el antígeno en el linfocito T y para

las inmunoglobulinas de superficie en los linfocitos B. El pronóstico es

desfavorable y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado. Los

33

pacientes suelen fallecer en la segunda década de sus vidas por secuelas

pulmonares o enfermedad linfoproliferativa (Lim, 2001).

4.4 Pruebas diagnosticas La valoración de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de

inmunodeficiencia primaria requiere de un análisis cuantitativo, cualitativo o

estructural y de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus

mecanismos de defensa. De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere

evaluar existen diferentes estudios que se pueden organizar por niveles de

complejidad (Figura 3) (Rugeles, 2004)

Paciente con sospecha

De padecer Inmunodeficiencia

Evaluación clínica + Pruebas de primera etapa

Estudios de segunda etapa

Deficiencias en la producción de anticuerpos

Deficiencias en la Inmunidad mediada

por LT

Deficiencias en las células Fagocíticas

Deficiencias del complemento

•Dosificación de Igs•Determinación de LB y LT CD19•Isohemaglutininas•Subclases IgG•Producción de Antcs Específicos

•Descartar Infección por VIH•Hipersensibilidad retardada cutánea•Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25•Dosificación de Inmunoglobulinas

•Reducción NBT en placa•Explosión respiratoria por citometría•Beta 2 integrinas en granulocitos•Quimiotaxis en agarosa

•C3 y C4 Séricos•CH50•Inhibidor de C1 estereasa•CD59 en eritrocitos

Estudios de tercera etapaEstudios de tercera etapa Estudios de tercera etapa

• Producción anticuerpos in Vitro• Westren blot: Btk, etc•SSCP y Secuenciamiento

• Proliferación y citocinas In Vitro•Determinar enzimas: ADA, PNP•Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc•SSCP y Secuenciamiento

• Westren blot: Proteínas NADPH oxidasa•SSCP y Secuenciamiento

Paciente con sospechaDe padecer Inmunodeficiencia

Evaluación clínica + Pruebas de primera etapaEvaluación clínica + Pruebas de primera etapa

Estudios de segunda etapaEstudios de segunda etapa

Deficiencias en la producción de anticuerpos

Deficiencias en la Inmunidad mediada

por LT

Deficiencias en las células Fagocíticas

Deficiencias del complemento

•Dosificación de Igs•Determinación de LB y LT CD19•Isohemaglutininas•Subclases IgG•Producción de Antcs Específicos

•Descartar Infección por VIH•Hipersensibilidad retardada cutánea•Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25•Dosificación de Inmunoglobulinas

•Reducción NBT en placa•Explosión respiratoria por citometría•Beta 2 integrinas en granulocitos•Quimiotaxis en agarosa

•C3 y C4 Séricos•CH50•Inhibidor de C1 estereasa•CD59 en eritrocitos

Estudios de tercera etapaEstudios de tercera etapaEstudios de tercera etapaEstudios de tercera etapa Estudios de tercera etapaEstudios de tercera etapa

• Producción anticuerpos in Vitro• Westren blot: Btk, etc•SSCP y Secuenciamiento

• Proliferación y citocinas In Vitro•Determinar enzimas: ADA, PNP•Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc•SSCP y Secuenciamiento

• Westren blot: Proteínas NADPH oxidasa•SSCP y Secuenciamiento

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia (Rugeles, 2004)

34

4.4.1 Pruebas de primera etapa Adicional a los datos de la historia clínica y el examen físico, los análisis

paraclínicos básicos aportan información valiosa para orientar los estudios

posteriores. Los estudios de primera etapa para estudiar inmunocompetencia son:

Cuadro hematico con velocidad de sedimentación globular, frotis de sangre

periférica (FSP) con recuento plaquetario, electroforesis de proteínas sericas y

estudios imagenológicos (Rugeles, 2004).

El FSP es el estudio de las células sanguíneas por medio de la observación en un

microscopio de preparaciones coloreadas, ha sido uno de los exámenes más

antiguos e importantes en el laboratorio clínico y su práctica es de gran utilidad en

hematología ya que permite visualizar la morfología celular, estimar el número de

células en sangre periférica y determinar la eventual presencia de elementos

atípicos. Los resultados obtenidos con este estudio son un reflejo del

funcionamiento de la médula ósea y de los factores que influyen en las diferentes

poblaciones celulares. Este método permite la evaluación del estado de

maduración, las características tintoriales, el contenido de los gránulos, las

inclusiones y formas celulares, todo lo cual se correlaciona con la fisiopatología de

ciertas enfermedades, y puede proporcionar una adecuada orientación en la

evaluación de la respuesta inmune y un manejo inicial simplificado de los

pacientes.

El FSP es una herramienta de gran valor en la evaluación del paciente con

infección recurrente, sus hallazgos cualitativos y cuantitativos son claves para la

orientación diagnóstica inicial de una IDP (Tabla 5) (Castaño, 2003)

35

Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las inmunodeficiencias primarias (Castaño, 2003)

Neutropenia

* Enfermedad de Kostman * Síndrome de Schwachman * Neutropenia cíclica * Neutropenia familiar benigna * Mielokatexis * Síndrome Chediak-Higashi * Hipoplasia cartílago-pelo * Agamaglobulinemia ligada al X * ID común variable * Síndrome Hiper-IgM * Deficiencia de adhesión leucocitaria * Tipo III

Linfopenia

* ID combinada severa * Síndrome de DiGeorge completo * Hipoplasia cartílago-pelo * ID común variable * Ataxia telangiectasia * Agamaglobulinemia ligada al X

DISMINUCIÓN

Trombicitopenia

* Síndrome Wiskott-Aldrich * ID común variable * Síndrome de Schwachman * Síndrome Hiper-IgM ligado al X * Agamaglobulinemia ligada al X * Síndrome Chediak-Higashi

Neutrofilia * Deficiencias de adhesión leucocitaria tipos 1,2,4 * Infecciones bacterianas recurrentes asociadas a las ID con producción normal de fagocitos

Linfocitosis * Enfermedad proliferativa ligada al X * Síndrome de Omenn

Monocitosis * Neutropenia familiar benigna * Enfermedad de Kostmann

Eosinofilia

* Síndrome de Omenn * Síndrome de Job * Síndrome Wiskott-Aldrich * Síndrome Nezelof * ID combinada severa

AUMENTO

Trombocitosis * Infecciones recurrentes asociadas a las diferentes inmunodeficiencias

Aumento * Anemia megaloblástica y células blásticas asociadas a defectos en la maduración o carencia de cofactores enzimáticos (vitaminas del complejo B)

Disminución * Anemia microcíticas por infecciones crónicas y recurrentes o pérdidas sanguíneas crónicas (Wiskott-Aldrich) Microtrombocitos: Wiskott-Aldrich

ALTERACIONES EN EL NÚMERO DE CÉLULAS

TAMAÑO

Inclusiones citoplasmáticas

* Granulaciones tóxicas asociadas a infecciones * Síndrome de Chediak-Higashi

36

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y

carga eléctrica, a través de una matriz gelatinosa

(www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electrof

oresis.html). Es muy útil en el diagnóstico de trastornos humanos paraproteínicos

como mieloma múltiple y algunas inmunodeficiencias primarias.

En algunas ocasiones se puede detectar con esta técnica una notable disminución

en las concentraciones de gamma globulinas sericas como en el caso de la

hipogammaglobulinemia (Figura 4). Por este método no se puede detectar la

reducción de IgA o IgM a valores muy bajos, ya que representan una fracción

relativamente pequeña del total de inmunoglobulinas sericas (Stites, 1999). .

Albúmina α1 α2 β γAlbúmina α1 α2 β γAlbúmina α1 α2 β γ

Alb α1 α2 β γAlb α1 α2 β γ

Figura 4. Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia (Stites, 1999)

37

4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa

4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos

Existe un número de defectos bien definidos en las células que participan en la

respuesta inmune humoral, ciertas características como son el desarrollo de

infecciones en las primeras etapas de la vida y fallas en la respuesta adecuada a

estas, aún después de un tratamiento farmacológico, hacen pensar en algún tipo

de deficiencia de linfocitos B. La deficiencia de linfocitos B puede ser relativamente

moderada y no presentar síntomas mayores o puede llevar a una deficiencia

severa con una completa pérdida en la síntesis y secreción de anticuerpos (Folds,

2003).

La evaluación en la producción de anticuerpos incluye varias pruebas de

laboratorio, como: cuantificación de los niveles sericos de inmunoglobulinas,

medición de subclases en los isotipos que las presentan, producción de

anticuerpos específicos y cuantificación de linfocitos B entre otras.

4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas El estudio de las principales clases de inmunoglobulinas A, G y M, es de especial

interés en el laboratorio de inmunología. La determinación de estas

inmunoglobulinas contribuye significativamente al diagnóstico de diversas

enfermedades como inmunodeficiencias, gammapatías monoclonales,

enfermedades infecciosas crónicas y agudas entre otras. Sus cifras séricas

dependen de diversos factores del desarrollo, genéticos y ambientales. Éstos

incluyen: características étnicas, edad, sexo, antecedentes de alergia, o

infecciones recidivantes y factores geográficos (Ramos, 2004). Habitualmente en

el laboratorio se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA, los niveles de IgD e IgE

no se realizan de rutina.

38

Se han estandarizado varios métodos para la cuantificación serica de las

inmunoglobulinas. El clásico es la inmunodifusión radial que fue utilizada en por

varios años. Actualmente el método más usado para la cuantificación de

inmunoglobulinas es la turbidimetria, esta técnica es la medida de la turbidez de

una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica

con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con

soluciones de turbidez conocida (www.iqb.es/diccio/t/tu.htm).

4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas se han agrupado en diferentes subclases de acuerdo a

diferencias que se encuentran en las cadenas pesadas. La IgG se subdivide en

IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (Roit, 2000).

Una deficiencia en las subclases de IgG puede resultar en la producción alterada

de ciertos tipos de anticuerpos. La deficiencia selectiva de anticuerpos más

frecuentemente identificada, es una respuesta defectuosa a antígenos de

polisacáridos, como los presentes en la cápsula de neumococo, meningococo y

Hemophilus influenzae tipo B. Dado que la IgG2 es el isotipo de anticuerpo

predominante en respuesta a determinados polisacáridos, niveles disminuidos de

esta subclase de IgG es la razón de una pobre respuesta a infecciones por

bacterias encapsuladas. Su cuantificación en el laboratorio se hace principalmente

por la técnica de nefelometría (Hernandez, 2004).

La nefelometría se utiliza principalmente para medir las reacciones antígeno-

anticuerpo, la determinación nefelométrica de los antígenos se lleva a cabo por la

adición de cantidades constantes de antisuero específico a diversas cantidades de

antígeno. Los reactantes resultantes de antígeno y anticuerpo se colocan en un

recipiente bajo un rayo de luz y el grado de dispersión de la luz se mide en una

celda fotoeléctrica como densidad óptica (Stites, 1999).

39

4.4.2.1.3 Isohemaglutininas

Dependiendo de la edad del paciente y su grupo sanguíneo es posible medir la

presencia de anticuerpos naturales o isohemaglutininas anti-A y anti-B, estos

anticuerpos son predominantemente de clase IgM dirigidos contra antígenos del

grupo sanguíneo. Es una prueba útil en casos de inmunodeficiencias con falla

selectiva para la formación de IgM por ejemplo el síndrome de Wiskott Aldrich.

4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos Otra prueba funcional es la medición de anticuerpos post-vacúnales, con vacunas

de bacterias encapsuladas como Haemophilus influenzae y Neumococo. La

presencia de anticuerpos producidos en respuesta a estas vacunas son indicativos

de una buena respuesta inmune de tipo humoral; sin embargo, cuando existe

fallas a este nivel no se encuentran anticuerpos, especialmente de tipo IgG, contra

estos microorganismos y se asocia a una inmunodeficiencia primaria por

deficiencia de anticuerpos específicos (Folds, 2003).

Los métodos de cuantificación de anticuerpos específicos circulantes se realizan

en su mayoría utilizando análisis inmunoenzimaticos (ELISA) (Zielen, 2000;

Neldya, 1998; Wernette, 2003; Kolibab, 2005). En esta técnica el componente de

fase sólida es un antígeno, el anticuerpo por detectarse se une al antígeno y luego

se agrega un anti-anticuerpo unido a una enzima, posteriormente se agrega el

sustrato de la enzima y al reaccionar se forma un producto colorido que se mide

espectofotométricamente (Stites, 1999). La técnica de ELISA es una prueba

altamente sensible y especifica (Folds, 2003).

4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría Los LB expresan diversas moléculas de superficie que se pueden detectar por

medio de anticuerpos monoclonales. Las células B maduras expresan CD19,

CD20 y HLA-DR. Las células B inmaduras pueden expresar moléculas adicionales

40

como CD10. Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos se utilizan

para detectar células que tienen los marcadores de LB (Stites, 1999).

La cuantificación de los LB se realiza mediante citometría de flujo. La Citometría

de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo

fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente

células) alineadas por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada

célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes

parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos

convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán

digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una

misma célula. Estos parámetros son:

- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su

tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.

- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula

(inmunofenotipo).

Por lo tanto, la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus

características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y

complejidad (Figura 5) (www.citometriadeflujo.com).

Figura 5. Fundamento de la Citometría de Flujo (www.citometriadeflujo.com)

41

La representación grafica de las poblaciones celulares usualmente se realizan

utilizando diagramas de puntos. Estos diagramas son usados habitualmente tanto

en la adquisición celular como en su análisis y se presentan sobre un eje de

coordenadas X/Y. Las poblaciones celulares, representadas por agrupaciones

homogéneas de puntos, se situarán dependiendo de sus características físicas de

dispersión (SSC/FSC) y antigénicas (Figura 6) (www.citometriadeflujo.com).

Figura 6. Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo. Cortesía de Angela Fonseca, Universidad Javeriana

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada

La prueba de hipersensibilidad cutánea retardada es considerada como una

correlación In Vivo de la inmunidad mediada por células, puede ser usada como

método de monitoreo para defectos en la inmunidad mediada por células. El

procedimiento de esta prueba consiste en la inoculación intracutanea de una

cantidad definida de un antígeno conocido como PPD (derivado proteico

purificado) o Candida Albicans. El sitio de la inyección se observa por

42

aproximadamente 48-72 horas, observando la aparición de una pápula, si esta

pápula tiene un diámetro mayor de 2 mm se considera positiva (Folds, 2003).

La mayoría de individuos inmunocompetentes presentan una prueba positiva a por

lo menos uno de los dos antígenos, mientras que los individuos con algún tipo de

inmunodeficiencia presentan resultados negativos (Tabla 6) (Stites, 1999).

Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de

hipersensibilidad retardada (Stites, 1999)

Deficiencias inmunitarias Congénitas Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral

Ataxia-telangiectasia Síndrome de Nezelof

Inmunodeficiencia combinada severa Síndrome de Wiskott-Aldrich

Celulares Síndrome de DiGeorge Candidiasis monocutanea

Adquirida Síndrome de inmunodeficiencia adquirida

Sarcoidoisis Leucemia linfocitica crónica

Carcinoma

4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría

Los linfocitos T, poseen dos subgrupos que pueden distinguirse por dos proteínas

de superficie especificas para cada uno; los linfocitos T ayudadores expresan en

su superficie la molécula CD4 y los linfocitos T citotóxicos expresan CD8. La

mayor parte de los LT CD8+ tienen actividad citotóxica es decir, tienen la

propiedad de destruir células que expresen moléculas extrañas en su superficie,

43

estos linfocitos son muy importantes en la defensa contra infecciones virales. Los

linfocitos CD4+ funcionan como células cooperadoras promotoras de la

proliferación, maduración y función inmunitaria de otros tipos celulares mediante la

secreción de citocinas (Stites, 1999).

Aproximadamente el 70% de los linfocitos T de sangre periférica son CD4+ o

CD8+ (Stites, 1999) y su cuantificación se realiza principalmente por la técnica de

citometría de flujo (Figura 7).

R1R1R1

Figura 7. Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra. Adriana Cuellar. M.Sc, Universidad Javeriana

4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría

Los LT expresan en su superficie diversas moléculas como moléculas de adhesión

entre las que se encuentran las Caherinas, la súper familia de las

inmunoglobulinas, las Integrinas, Selectinas y el Proteoglicano. También se

encuentran receptores como el TCR y los receptores tipo Toll al igual que

44

moléculas coestimuladoras como el CD28. Todas estas moléculas pueden ser

identificadas mediante citometría de flujo, siempre que exista el anticuerpo

monoclonal específico para cada una.

4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK

La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de algunas

poblaciones celulares especializadas del sistema inmune. Consiste en la

capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas. Este mecanismo de

respuesta interviene en la defensa frente a infecciones víricas y células

neoplásicas, así como en la destrucción de células alogénicas en transplante de

órganos. Se consideran como prototipos de las células especializadas en dicha

función a los linfocitos T CD8+ y a las células natural killer (Lozano,

http://www.uco.es/grupos/inmunologiamolecula).

La prueba de citotoxicidad por liberación de cromio se describió hace más de dos

décadas y ha sido la técnica de mayor uso para la determinación de LT CD8+

específicos de antígeno. Sin embargo, presenta una limitada sensibilidad y el uso

de un isótopo radiactivo (51 Cr) puede ser complicado. El principio básico de la

prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los LT CD8+ de lisar la célula

blanco mediante la liberación de perforina. La célula blanco que a su vez presenta

el antígeno esta marcada con cromio. Una vez el complejo peptido/CMH es

reconocido por la célula efectora en este caso el linfocito T CD8+ se induce la lísis

mediada por perforina con la liberación del 51Cr al medio. El sobrenadante es

recuperado y leído en un contador gama, el resultado se obtiene en cuentas por

minuto (Figura 8) (Herrera, 1999).

45

Figura 8. Prueba de liberación de cromio (Herrera, 1999).

4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK

Las células NK son un componente importante del sistema inmune innato, son

capaces de lisar las células infectadas por virus o células tumorales y son la fuente

de una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de

células se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a

infecciones virales.

La cuantificación de las células NK se realiza por citometría de flujo, estas células

coexpresan en su superficie las moléculas CD16/CD56 por lo que es bastante

sencilla su cuantificación en sangre periférica (Figura 9) (Folds, 2003).

46

Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra. Adriana Cuellar.M.Sc, Universidad Javeriana.

4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas

Los neutrófilos son leucocitos derivados de la medula ósea con una vida media

finita, que tienen una función principal en la defensa contra infecciones

ocasionadas por diferentes microorganismos. El neutrófilo desempeña una función

principal como célula efectora o asesina. Sin embargo, en el flujo sanguíneo y en

los espacios extravasculares, los neutrófilos ejercen efectos antimicrobianos a

través de interacciones con anticuerpos, complemento y factores quimiotacticos

(Stites, 1999).

Los defectos en la función de los neutrófilos se pueden clasificar como

cuantitativos o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el número total de

neutrófilos de función normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos

cualitativos el numero total de neutrófilos se encuentra normal pero no pueden

ejercer sus funciones microbicidas normales (Stites, 1999).

47

Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas células existen varias

clases de pruebas de laboratorio como la reducción de NBT, la medición de

radicales libre de oxigeno y la expresión de beta-2 integrinas, entre otras.

4.4.4.3.1 Reducción de NBT

La muerte de un microorganismo después de su fagocitosis se debe a la

producción de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En

algunas enfermedades la fagocitosis no tiene ningún problema pero la producción

de sustancias toxicas para el microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que

la destrucción no se lleva a cabo correctamente.

El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en

agua que al reducirse forma el formazan, tinción de color azul oscuro. Los

neutrófilos pueden reducir el colorante después de la ingestión de látex u otras

partículas, subsecuente a la descarga metabólica abrupta generada por la vía

derivada del monofosfato de hexosa. (Stites, 199).

La reducción del NBT es una prueba útil para analizar la integridad metabólica de

los neutrófilos ya que la falla en la reducción del colorante se asocia con

enfermedad granulomatosa crónica por lo tanto los neutrófilos de estos pacientes

no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar

radicales superoxido (Stites, 1999).

4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno El desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno y la defensa

antioxidante provoca un daño oxidativo conocido como estrés oxidativo, que lleva

a una gran cantidad de cambios fisiológicos y bioquímicos, los cuales provocan el

deterioro y muerte celular. Se puede medir este tipo de daño mediante métodos

directos e indirectos.

48

Entre los métodos directos está la medición de la concentración de agentes

oxidantes, que es muy difícil debido a su corta vida media. El uso de la

espectrometría de la resonancia de rotación (espín) de electrones, es la única

técnica analítica que mide directamente las especies oxígeno reactivas, pero

debido a su costo y complejidad su aplicación en el ser humano es difícil. Los

métodos indirectos se realizan mediante la determinación de los productos finales

de la acción oxidante sobre algunas moléculas biológicas tales como los lípidos,

ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos para medir peróxidos lipídicos son el

patrón de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algún tipo de

daño celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del ácido

araquidónico mediante espectrofotometría UV, los hidroperóxidos lipídicos

mediante cromatografía líquida de alta presión (Gastell)

4.2.2.3.4 Quimiotaxis La locomoción direccional de los neutrófilos hacia diversos estímulos

quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cámara de boyden. Las células

por analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cámara inferior que

contiene la sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro

pequeño. Los neutrófilos pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el tránsito

hacia la membrana y luego de un periodo de incubación, el filtro se tiñe y se

observa al microscopio (Figura 10) (Stites, 1999).

49

Cámara inferior con agente quimiotáctico

Filtro

Cámara superior con células fagocíticas

Figura 10. Quimiotaxis en filtro. Cortesía Dra. Diana Patiño C. M.Sc. Pontificia Universidad Javeriana. 4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos La ingestión de microorganismos por neutrófilos es un proceso que requiere la

producción de energía por parte de la célula fagocítica. La internación de

microorganismos recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy

rápido después del contacto con neutrófilos ya que los procesos intracelulares

subsecuentes dependen del éxito de la fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis

proporcionan un método rápido y relativamente simple para evaluar el proceso

fagocítico en general (Stites, 1999).

50

4.2.2.3.6 Adherencia En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesión de las

células fagocíticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrófilo se

encuentra en un estado de “patrullaje” permanente y que el mecanismo de

adherencia esta mediado por una serie de citocinas y factores químicos que lo

inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis.

4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento El sistema del complemento trabaja en asocio con otros componentes del sistema

inmune innato y adaptativo, proporcionando vías y mecanismos para la

destrucción de microorganismos o células dañadas. Esta conformado por más de

40 glicoproteinas que trabajan en cascada y existen en el plasma en forma de

precursores.

La mayoría de las proteínas del complemento son codificadas por genes

autosomicos. Sin embargo, individuos con defectos heterocigóticos usualmente

son asintomáticos, en contraste los pacientes que presentan condición homocigota

son sintomáticos y pueden ser detectados mediante la realización de pruebas

funcionales. Las pruebas de laboratorio especificas para los componentes del

complemento incluyen: CH50, cuantificación de C3 y C4 e inhibidor de C1

estereasa entre otros (Folds, 2003).

4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4 Muchas de las proteínas del complemento pueden ser cuantificadas por métodos

inmunoquimicos como nefelometría, inmunoprecipitación, turbidimetria, RIA y

ELISA (Wen, 2004). Actualmente la técnica más utilizada es la turbidimetria.

51

4.2.2.4.3 Complemento hemolítico 50 (CH50) La prueba de CH50 esta basada en un ensayo hemolítico, en el que un complejo

inmune es formado por la adición de anticuerpos que interactúan con antígenos de

la superficie de los glóbulos rojos de carnero.

Cuando el complemento es activado por los anticuerpos que se encuentran fijados

sobre la superficie de los glóbulos rojos, estos son lisados y la hemoglobina es

liberada. Los resultados son expresados en base a la última dilución del suero que

causa lisis del 50% de las células.

4.2.2.4.4 CD59 en eritrocitos El antígeno CD59 es un regulador fisiológico de la activación del complemento, se

encuentra disminuido o ausente en ciertas poblaciones de las células sanguíneas,

condicionando una mayor susceptibilidad a hemólisis intravascular, mediada por

complemento.

La técnica de citometría de flujo es la más utilizada para El empleo de anticuerpos

monoclonales fluorescentes específicos y su detección por citometría de flujo

permite la demostración de deficiencias, aún cuando las poblaciones celulares

afectadas sean escasas. Por ello, es común que en pacientes con esta

enfermedad, la citometría de flujo sea diagnóstica, aun cuando las pruebas

tradicionales de hemólisis en medio ácido o en presencia de inulina, que requieren

de abundancia de células deficientes, arrojen resultados negativos (Argüelles,

2002)

52

4.2.3 Pruebas de tercera etapa

4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in vitro

La activación de los LB por antígenos o mitógenos genera cantidades pequeñas,

pero detectables de inmunoglobulinas policlonales. Después de 7-10 días de

cultivo, estos productos se miden mediante RIA o ELISA (Stites, 1999). El RIA es

una técnica de análisis en el que una pequeña cantidad de sustancia marcada

radiactivamente, es desplazada de su unión específica por otra similar no marcada

que va a competir con la sustancia marcada radiactivamente. Al sistema de

fijación elegido se le agrega una cantidad indeterminada de antígeno marcado,

posteriormente se le agrega una cantidad de antígeno sin marcar o sea el suero

problema, así se establece la competencia por los sitios de unión del anticuerpo,

sigue la incubación a 37 grados Celsius, procediendo a los lavados mediante los

cuales se realiza la separación del antígeno unido y del libre, de la cantidad de

antígeno marcado fijado a diferentes concentraciones se hace una curva que

permite encontrar cualquier concentración de antígeno no marcado que sea

desconocido (Arano, 2002). Sin embargo, esta prueba ya no se realiza de rutina

en el laboratorio.

4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO

Las Btk, BLNK y NEMO, están relacionadas con la maduración y proliferación del

linfocito B, y se pueden determinar por Western Blot.

En la prueba de Western blot primero se debe hacer una electroforesis en gel de

duodecil sulfato sodico poliacrilamida (SDS-PAGE), luego las proteinas obtenidas

se transfieren a una matriz de soporte por ejemplo nitrocelulosa donde se emplea

un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés en este caso Btk, BLNK

o NEMO, un segundo anticuerpo marcado con una enzima y contra la especie en

53

la que se produjo el anticuerpo monoclonal que usualmente es ratón. El anticuerpo

secundario se puede marcar de diversas formas con el fin de producir una señal

detectable, que va a ser observada como bandas en el papel de nitrocelulosa

(Stites, 1999) 4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP)

SSCP es el método más simple y más usado para la detección de mutaciones. El

PCR se utiliza para amplificar la región del interés y el DNA resultante es separado

como una molécula de cadena sencilla por electroforesis en un gel de

poliacrilamida no denaturante. Cada uno de los filamentos de DNA migrara de

manera diferencial de los otros si presenta alguna mutación así sea de una sola

base, se cree que estos diferentes patrones de migración se deben a cambios en

la estructura terciaria del DNA. Estas mutaciones son detectadas como bandas

nuevas en los “autoradiogramas” (detección radiactiva) ya sea por tinción de plata

o por el uso de primers fluorescentes que posteriormente se analizaran en un

secuenciador automatizado (Youil, 1996) 4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos En esta prueba se busca medir la habilidad de los linfocitos para proliferar en

respuesta a una variedad de estímulos como son los mitógenos. Se han empleado

diversas lectinas de plantas y otras sustancias como la fitohemaglutinina y la

concavalina A para evaluar la función de linfocitos humanos. En esta técnica se

obtienen linfocitos mediante gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se establecen

cultivos por triplicado en microplacas a una concentración de 1x 106 linfocitos por

mililitro, se añaden los mitógenos a diversas concentraciones, los cultivos se

incuban a 37°C al 5% de CO2 durante 72 horas. En este tiempo los mitógenos han

54

producido su efecto máximo sobre la síntesis de DNA. La síntesis de DNA se mide

mediante el marcaje de los cultivos con intermitencias de timidina tritiada (3H-Tdr),

este es un precursor de nucleósido que se incorpora en el DNA que se acaba de

sintetizar. La cantidad de 3H-Tdr incorporada es relativa a la velocidad de síntesis

del DNA y se determina por la cuenta de centelleos en un espectrofotómetro de

líquido de centelleo (Stites, 1999).

4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In vitro Esta técnica consiste en el cultivo de células mononucleares de sangre periférica

con un antígeno especifico y anticuerpos coestimuladores, luego de

aproximadamente 6-8 horas se pueden medir las citoquinas en el sobrenadante

del cultivo. La proporción de citoquinas secretadas por las células en el cultivo se

puede determinar por ELISA, ELISPOT y mas recientemente por citometría de

flujo (Folds, 2003).

El ELISPOT o ensayo de inmunospot conjugado a actividad enzimática, esta

diseñado para cuantificar células individuales que están secretando una proteína

concreta in vitro. Está basado en el protocolo básico de ELISA, originalmente

diseñado para el análisis de células secretoras de anticuerpos determinados, se

ha adaptado para poder medir frecuencia de células produciendo y secretando

moléculas efectoras (citocinas), en estado de reposo, tras estimulación o en

estados patológicos.

4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1 La proteína ZAP-70 se encuentra expresada exclusivamente en linfocitos T y

células NK y juega un papel esencial en el proceso de selección positiva y

negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T. la proteína kinasa JAK3

esta asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común que interviene

en la transducción de la señal generada tras la unión de las citocinas a sus

respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el desarrollo de

55

linfocitos, estas proteínas se encuentran alteradas principalmente en la

inmunodeficiencia combinada severa, por lo que su analisis se hace muy

importante en el diagnostico de esta patología. Su cuantificación se puede realizar

mediante la prueba de western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti- ZAP-

70, JAK3 y STAT-1.

4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas 4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa Para realizar la prueba de Western Blot para evaluar el sistema NADPH oxidasa

se realiza primero una electroforesis en gel de poliacriamida (SDS-PAGE) de la

membrana del neutrófilo y sus fracciones citosolicas. A las bandas obtenidas de

esta electroforesis se le agregan anticuerpos monoclonales del ratón contra

gp91phox, gp22phox, p47phox o p67phox y se detectan con un anticuerpo anti

IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Boer,1998).

56

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

• En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen

pruebas inmunológicas especificas para el diagnostico de pacientes con

inmunodeficiencias primarias.

• Se halla poca información sobre las pruebas clínicas de laboratorio que

existen para un adecuado manejo de pacientes con inmunodeficiencias

primarias.

• El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal

medico establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o disminuir

la estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias llevando a que

estos presenten una mejor calidad de vida.

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