实验二 质粒 DNA 的酶切鉴定【目的要求】1 ．了解一般限制性内切酶的特性；2 ．学习设计酶切方案的一般规律 , 载体与供体进行酶切 ；3 ．掌握酶的保存与使用方法；

【实验原理】 限制性内切酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的特定的

核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶，共有 I 型、、 II 型、 III 型三类， II 型限制性内切酶识别含 4 － 8 个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开 DNA 双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的 DNA 片断，常用于基因克隆的载体切割、外源 DNA 的制备。在分子克隆中 I 、III 类型限制性内切酶都不常用。

【实验器材】台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（ 20uL, 200 uL 1000u

L ） ,1.5mL Enpendorf 管 【实验材料】限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水， 【实验内容】1 ．酶切有关基础知识介绍：2 ．小量酶切，电泳鉴定3. 酶切体系的建立： 表 3. . 质粒酶切反应体系的建立

组成成分 单酶切 双酶切

质粒 6~8 6~8

酶 1 0.5 0.5

酶 2 --- 0.5

10X 缓冲液 2 2

去离子水 11.5 12

总体积 20 20

影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、 DNA 的纯度和浓度等。

酶切反应体系的组成： DNA 量→酶量（最多占总体积的 1/10 ）→总体积，即根据所用 DNA 的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中 DNA 用量不高于 1.5ug/50uL 。酶切时加样顺序一般应为：水 + 缓冲液 +DNA+ 酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，5’ 离心后保温酶切。

I 型限制性内切核酸酶有其特定的 DNA 识别序列，但酶在DNA 上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距 1 000 bp 的位置上随机切割。 l 型限制酶对体外重组 DNA 实验没有多少用处。

III 型限制性内切核酸酶在 DNA 上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列 3‘ 端之外相距约 20 个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。

II 限制性内切核酸酶在 DNA 上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为 4-8bp ，在特定识别位点处切割 DNA 。是基因工程中主要使用的酶类。

限制性内切酶分类

限制酶特点：1. 识别４ -8 个相连的核苷酸，以 6 个多见；

限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列

BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’

Not I 5’-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCG-5’

2. 呈回文结构 (palindrome) ；

3. 旋转对称性；EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’

4. 切点大多数在识别顺序之内，也有例外。

Fok I 5’-GGATGNN -3’ 3’-CCTAC NN-5’ 外侧，产生 3’- 端突起

5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。

限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端

a) 5’ 突出的粘性末端 如 , EcoR I 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’

b) 3’ 突出的粘性末端 如 , Pst I 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’

c) 平末端 如 , Sma I 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’

同裂酶 : 能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。

（ 1 ）同裂酶（ Isoschizomers)

① 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如 Hind Ⅲ 和 Hsu I 。

Hind 5’-AⅢHind 5’-AⅢ AGCTT-3’ AGCTT-3’ 3’-TTCGA3’-TTCGAA-5’A-5’

Hsu I 5’-AHsu I 5’-AAGCTT-3’ AGCTT-3’ 3’-TTCGA3’-TTCGAA-5’A-5’

同列裂酶和同尾酶同列裂酶和同尾酶

XmaXma I 5’-C I 5’-CCCGGG CCGGG -3’ -3’ 3’-GGGCC3’-GGGCCCC-5’-5’

SmaSma I 5’-CCC I 5’-CCCGGGGGG-3’ -3’ 3’-GGG3’-GGGCCCCCC-5’-5’

识别位点相同，但切点不同。如 Xma I 和 Sma I 。

② ② 不完全同裂酶：不完全同裂酶：

AspAsp718I 5’-G 718I 5’-G GTACCGTACC-3’-3’ 3’-CCATG 3’-CCATG GG-5’-5’

KpnKpn I 5’-GGTAC I 5’-GGTAC CC-3’-3’ 3’-C 3’-C CATGGCATGG-5’-5’

同尾酶 ( Isocaudamers ) : 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamHI 、 BglⅡ、 BclI 、 XhoⅡ等

（ 2 ）同尾酶 (Isocaudamers ）

5’-G5’-GGATCCGATCC-3’ -3’ 3’-CCTAG3’-CCTAGGG-5’-5’

BamH IBamH I

Bcl IBcl I 5’-5’-TTGATCAGATCA-3’ -3’ 3’-3’-ACTAGACTAGTT-5’-5’

5’-5’-AAGATCTGATCT-3’ -3’ 3’-3’-TCTAGTCTAGAA-5’-5’

Bgl ⅡBgl Ⅱ

5’-5’-UUGATCYGATCY-3’ -3’ 3’-3’-YCTAGYCTAGUU-5’ -5’ Xho ⅡXho Ⅱ

UU 代表嘌呤；代表嘌呤； YY 代表嘧啶。代表嘧啶。

5’-5’-GATCGATC----3’ ----3’ 3’----3’----CTAGCTAG-5’-5’

Sau3A

同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 ？

5’-5’-GG3’-3’-CCTAGCCTAG

GATCTGATCT-3’ -3’ AA-5’-5’BamBamHIHI BglBglⅡⅡ

5’-5’-GGGATCTGATCT-3’ -3’ 3’-3’-CCTAGCCTAGAA-5’-5’BamBamHIHI BglBglⅡⅡ

Sau3A

部分同裂酶的切割位点部分同裂酶的切割位点

EnzymeEnzyme SequenceSequence IsoschizomersIsoschizomers

AccAcc65I65I GGTACC GGTACC CCATGGCCATGG

AspAsp718 I, 718 I, KpnKpn I I

AhaAhaIIIIII T T TAAAT T TAAA AAATTTAAATTT

DraDra I I

BstBstMA IMA I CTGCAGCTGCAGGACGTCGACGTC

PstPst I I

EcoEcoRIRI GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAG

Fun Fun IIII

NdeNdeII CATATGCATATGGTATACGTATAC

FauFauND IND I

NheNheII GCTAGCGCTAGCCGATCGCGATCG

AsuAsuNH I, NH I, BmtBmt I I

NotNotII GCGGCCGCGCGGCCGCCGCCGGCGCGCCGGCG

CciCciN IN I

SmaSmaII CCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCC

CfrCfr9 I, 9 I, PspPspA I, A I, XmaXma I, I, XmaXmaC I C I

部分同尾酶切割位点部分同尾酶切割位点

EnzymeEnzyme SequenceSequence IsoschizomersIsoschizomers

BamBamHIHI 5’-G5’-GGATCCGATCC-3’ -3’ 3’-CCTAG3’-CCTAGGG-5’-5’

BclBcl I, I, BglBgl II 5’-A II 5’-AGATCTGATCT-3’ -3’ 3’-TCTAG3’-TCTAGAA-5’-5’

BclBcl I I 5’-T5’-TGATCAGATCA-3’ -3’ 3’-ACTAG3’-ACTAGTT-5’-5’

BamBamH I, H I, BglBgl II II

BglBgl II II 5’-A5’-AGATCTGATCT--3’ 3’ 3’-TCTAG3’-TCTAGAA-5’-5’

BclBcl I, I, BamBamH IH I

Pst Pst II 5’-5’-CTGCACTGCAG-3’ G-3’ 3’-3’-GGACGTC-3’ACGTC-3’

Nsi Nsi I, 5’-I, 5’-ATGCAATGCAT-3’ T-3’ 3’-3’-TTACGTA-3’ ACGTA-3’

NsiNsi I I 5’-5’-ATGCAATGCAT-3’ T-3’ 3’-3’-TTACGTA-5’ACGTA-5’

Pst Pst II

DNA 中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS 、 EDTA 等都会影响酶的活性。

1. DNA 的纯度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素

① 纯化 DNA② 加大酶的用量③ 延长保温时间④ 扩大反应体积（ >20l ）

一般采取

大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：

2. DNA2. DNA 的甲基化程度 的甲基化程度

dam 甲基化酶（修饰 GATC 中的 A ）；dcm 甲基化酶（修饰 CCA/TGG 的 C ）。

基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

对不完全消化具有一定的影响

3. DNA3. DNA 的分子结构 的分子结构 DNA 的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构

是影响限制酶活性的重要因素。

4. 4. 缓冲液缓冲液 (Buffer) (Buffer)

缓冲液的化学组成MgCl2 、 NaCl/KCl ： 提供 Mg2+ 和离子强度；Tris-HCl ： 维持 pH ；二硫苏糖醇（ DTT ）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白 BSA 等：有助于酶的稳定；

商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 oC ，少数要求 40-65 oC 。

酶酶 最适温最适温度度 ooCC

酶酶 最适温最适温度度 ooCC

酶酶 最适温最适温度度 ooCC

Apa IApa I

Bcl IBcl I

Mae IIMae II

Taq ITaq I

3030

5050

5050

6565

Apy IApy I

BstE IIBstE II

Mae IIIMae III

3030

6060

5555

Ban IBan I

Mae IMae I

Sma ISma I

5050

4545

2525

5. 5. 酶切消化反应的时间和温度酶切消化反应的时间和温度

限制性内切酶储存在含 50% 的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过 1/10 体积。否则对酶活性有抑制作用。

6. 6. 反应体积和甘油浓度反应体积和甘油浓度

质粒酶切鉴定通常设定反应体积为 10-20μl,

质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为 80-100μl 。

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、 pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

7.7. 星号（星号（ ** ）活性）活性

如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（ * ）活性。

所以一般使用专一的反应缓冲液。

星号（ * ）活性

EcoR I 和 BamH I 等都有 * 活性。

在低盐、高 pH （ >8 ）时可识别和切割

GAATTA 、 AAATTC 、 GAGTTC 等

GAATTCEcoR I ：

使用的时候要特别注意！

大多数酶可用 65 oC 温育 5 分钟失活。或用乙醇沉淀 DNA 。

限制酶酶切反应的终止 限制酶酶切反应的终止