DNA 限制性内切酶消化

实验原理•限制性内切酶：识别回文序列，产生

粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同 DNA 片段可连接起来形成重组 DNA 分子，故 DNA 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。

•影响酶活性的因素有很多，温度、 pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性

实验原理•每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、

中盐、高盐等）•单酶切反应•双酶切反应

酶反应体系：• 底物 DNA 限制性内切酶： 1-5U/μgDNA pH TRis-HCl 缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度 :37℃ 时间： 1-2h

实验步骤pBR322 2 μlPstⅠ 2 μlEcoRⅠ 2 μl10×Buffer 2 μlddH2O 12 μl

总体积 20 μl

封口膜封口 ,

瞬时离心

37℃ 水浴， 2h

65℃ 加热灭活终止反应

冰水浴

DNA 琼脂糖凝胶电泳•原理： 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛

效应分离不同分子量大小的 DNA ，相同分子量的 DNA 分子若构型不同电泳速度亦不同。

•琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏

•溴化乙锭为ＤＮＡ荧光染料，可插入DNA 双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线 254 ～ 365nm 照射下呈桔红色荧光。电泳时所需 DNA 样品量仅 0.5 ～ 1μg.

线性 DNA 片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系

琼脂糖凝胶的百分浓度 分离线性 DNA 片段分离的有效范围 (kb)

0.3 60 ～ 50.6 20 ～ 10.7 10 ～ 0.80.9 7 ～ 0.51.2 6 ～ 0.41.5 4 ～ 0.22.0 3 ～ 0.1

实验步骤

⒈ 琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度 0.5μg/mL⒉ 凝胶板的制备⒊上样⒋电泳 电压 10v/cm,溴酚蓝移出 2/3 的距离

时，取出凝胶紫外灯下观察结果

实验结果