PAGE 分离 LDH 同工酶2006 级七年制临床

姚沅清2008 年 7 月 10 日

一：试验目的 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳（ polyarcylamide

gel electrophoresis, PAGE ）的基本原理。 学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离乳酸脱

氢酶同工酶及其酶活性染色法。

二：实验原理 单体丙烯酰胺和交联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺在引发剂和

催化剂的作用下，聚合交联成三维网状结构的凝胶支持物，起到一个分子筛的作用。

蛋白质为两性物质，在不同的 pH 下代不等的电荷，在电场力作用下而运动；其运动的速度与电荷，粒子的大小，凝胶孔胶有关，从而达到分离作用。

三：仪器及试剂 仪器： 电泳仪、垂直板电泳槽、电泳玻璃板、脱色摇床、 20μl 取样器、 1ml 取

样器、磁力搅拌器、烧杯、台式高速离心机、白瓷盘、电炉、铝锅等。 试剂 ： 分离胶缓冲贮备液（ A 液）： pH8.9 Tris~HCl 缓冲液 浓缩胶缓冲贮备液（ B 液） ： pH6.7 Tris~HCl 缓冲液 30 ％分离胶贮备液， 30 ％浓缩胶贮备液； 100g/L AP ， 2× 样品缓冲液， 10× 电极缓冲液 ， 1.5% 琼脂糖 ， 0.5

mol/L pH7.5 生理缓冲液盐 （ PBS ） ， 1mol/L NaOH 溶液， 1 mol/L 乳酸溶液 ， 1g/L 溴酚蓝溶液，乳酸脱氢酶染色液 5% （ v/v ），乙酸溶液 0.01 mol/L ， pH6.5 的 PBS （组织匀浆用）

四：实验步骤（ 1 ）样品制备： 样品为组织匀浆上清液。取小白

鼠肝、脑、心、肾、肌等组织，进行处理后，取上清备用。

（ 2 ）夹心式垂直电泳槽的安装：

如图进行安装

背板

压条 固定架

橡胶垫

底座

凸轮

背板

压条 固定架

橡胶垫

底座

凸轮

（ 3 ）灌注分离胶

按 7 ％凝胶配方，用 50ml 的烧杯称甘油，加入分离胶缓冲液、 30 ％分离胶贮备液，蒸馏水，用磁力搅拌器混匀，在加入 AP 和 TEMED ，混匀、停止搅拌。加入组装好的电泳槽。

图 2 ：灌胶示意图

加蒸馏水或覆盖液于分离胶上，防止表面张力引起的边缘效应导致凝胶上面成弧形。同时在凝胶胶联时要控制 pH和温度！

四：实验步骤

注意

（ 4 ） 配制、灌注浓缩胶 将梳子放在分离胶上，两块玻璃之间，将

配好 5 ％的浓缩胶应用液加入电泳槽，直至与玻璃板上沿平；聚合完成且彻底老化后轻轻拔出梳子。然后立即向样品池加入蒸馏水，随后吸出，再加入蒸馏水再吸

出。同时用 6 号注射针整理样品池。

梳子齿下缘不可有气泡，如有气泡，应想法排除。此后，如 胶面下降，随时补充，保持胶面与玻璃板上沿平。

四：实验步骤

注意

四：实验步骤（ 5 ）加样： 用上样枪头将处理后的组织上

清液及电极缓冲液加入样品槽中。

加样品及电极缓冲应缓慢加入，避免样品及电极缓冲液混合造成污染和不好的电泳结果。

注意

四：实验步骤（ 5 ）电泳 将电泳槽和电泳仪相连，上电极接负极，下

电机接正极；在上电极缓冲液池中加滴加 2滴溴酚蓝示踪，开始电泳。

四：实验步骤 示踪染料线电泳到离电泳槽端 0.5cm~1.0cm

时，即可停止电泳，将凝胶慢慢的滑入到固定液内。

胶板用蒸馏水洗净后染色（ 37℃温度下，保温 30min ）。

染色完毕的胶板放入 2% HAC 中固定保存。

LDH4

LDH3

LDH5

LDH1

LDH2

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电泳结果实例

其它注意事项 丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺均有毒，操作时

应戴手套和口罩。硅胶凹槽条、样品槽梳子及玻璃板应仔细清洗，然后阴干 。

固定电泳槽的螺、要平均用力、以免用力不均，玻璃板破裂。

用琼脂糖封底，应封好、以免凝胶漏出。

方法评价优点： 灵敏度高，重复性好；观察、记录和保存电泳分离的结果十分方便。

可多样品测定。缺点： 操作复杂。 实验结果受实验人员经验影响较大。 不能实现自动化操作。

影响聚丙烯酰胺凝聚的因素 聚丙烯酰胺的特性如机械特性，弹性，透明

度，粘着度及孔径大小，取决于两个重要参数：两单体总百分浓度 T ，胶联百分浓度 C 。

其中 a: 丙烯酰胺质量 (g),b: 甲叉双丙烯酰胺的质量（ g ） ,m: 水或缓冲溶液的终体积（ ml ）

T=(a+b) ／ m×100% C=b /(a+b)×100%