第 10 章 酶动力学
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第 10 章 酶动力学. Michaelis 与 Menten 發展出酶动力学. Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258. Michaelis. Menten. 转化 酶 Invertase (IT). HOCH 2. HOCH 2. HOCH 2. HOCH 2. 6. 1. HOCH 2. HOCH 2. 6. 5. 2. 5. 1. 2. 3. 4. 1. OH. 4. OH. OH. 2. O. O. HO. 3. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
第 10 章 酶动力学
Michaelis 与 Menten 發展出酶动力学
Michaelis Menten
Ne
lso
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Co
x (2
00
0)
Le
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ing
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Prin
cip
les
of
Bio
che
mis
try
(3e
) p
.25
8
转化酶 Invertase (IT)
ITSucrose
非还原糖 还原糖
Glucose Fructose
Reducing Power
+HOCH2
O
OH
1
23
4
5
66
54
32
1
1
2
3
4
5
6
HOCH2
O
OH
OHOCH2 HOCH2
OH
H2O
O
HOCH2HOCH2
HO
O
HOCH2
OHOCH2HOCH2
O
CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
H2C-OH
C=O HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
1 2
提高基质浓度增強酶活性表現
21 3 4 5 6 7 80
0 2 4 6 8
基质浓度 mole
生成物浓度
80
60
40
20
0
S+E
↓
P
(
在固定時間內反
应)
Juang RH (2004) BCbasics
酶动力学的基本出發點
E S+ P+
Steady State TheorySteady State Theory
ES 的生成量与消失量相等,故平衡時 [ES] 浓度成一穩定狀態。
SE E
Juang RH (2004) BCbasics
酶动力学大綱 – 緣起
E + S ES E + P(vo)k2
k1 k3
k1[E][S] = k2 [ES] + k3 [ES]
vo=Vmax [S]Km + [S]
[Et] = [Ef] + [ES]vo = k3 [ES]Vmax = k3 [Et]
3.1
3.2 酶必須先与基质結合
ES 的生成量 等于其消失量[ES] 浓度恆定 3.2.1Steady State
由上式出發可推得Michaelis-Menten 公式 3.2.2
Juang RH (2004) BCbasics
(vo)
酶动力学基本观察
k1 [E][S] = k2 [ES] + k3 [ES]
[Et] = [Ef] + [ES]
vo = k3 [ES]
Vmax = k3 [Et]
(I)
(II)
(III)
(IV)
E + S ES E + Pk2
k1 k3
Juang RH (2004) BCbasics
(1) 整理 (I) 可得: (k2 + k3) [ES] = k1 [E][S]
k1 k2 + k3 [E][S] 故 [ES] = ─── [E][S] ;另設 ─── = Km 則 [ES] = ─── k2 + k3 k1 Km
vo vo [E][S] k3 [E][S](2) 由 (III) 得 [ES] = ─ ,故 ─ = ─── 即 vo ──── = (V) k3 k3 Km Km
(3) 由 (II) 得 [Ef] = [Et] - [ES] , 而 [Ef] 可視為 [E] ,故: [E] = [Et] - [ES] 代入 (V) 得︰
k3 ([Et]-[ES])[S] k3 [Et][S] - k3 [ES][S] vo ─────── ─────────= = Km Km
(4) 把 (III) vo = k3 [ES] 及 (IV) Vmax = k3 [Et] 代入得︰ Vmax [S] - vo [S]vo ─────── → = vo Km = Vmax [S] - vo [S] 移項 Km → vo Km + vo [S] = Vmax [S] (VI)
Vmax [S] (5) 整理 (VI) 集中 vo 即得 M-M 公式: vo ────= Km + [S]
移出 [ES]
定義 Km
由 [ES]
導入 vo
分解 [E]
转换得Vmax 及 vo
提出 vo
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ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
动力学实验操作 (invertase)
Vmax
Km S
vo
1/S
1vo
双倒數作图 直接作图
1)1) 先取固定量的 酶 (invertase) → E
2)2) 加入各种不同浓度的 基质 ( 蔗糖 ) → S (x 軸 )
3)3) 在一定 時間 內測 生成物 量 (P/t) → vo (y 軸 )
4)4) (x, y) 作图得 双曲線 之一股推 漸近點 → Vmax
5)5) 當 y = 1/2 Vmax 時求其 x ( 即 [S]) 即得 → Km
1Vmax
- 1 Km
1/2
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ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
动力学实验操作实例实驗數據
編號1234
0.250.501.02.0
0.420.720.800.92
吸光值 v (mole/min)[S]
0.210.360.400.46
(1) 已知反应後呈色的吸光值每 0.05 吸光有 1 mole 生成物。(2) 酶催化反应的時間為 10 min 。
反应速率基质浓度 反应呈色 双倒數1/S 1/v421
0.5
2.081.561.351.16
→→ → →
1.0
0.5
0
v
直接作图
双倒數作图
2.0
1.0
0
1/v
-4 -2 0 2 41/[S]
0 1 2[S]
1.0
-3.8
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
酶的抑制
可逆性抑制 不可逆抑制
抑制剂与酶非共价結合 抑制剂与酶行共价性修飾
Competitive
Non-competitive
Uncompetitive
Penicillin 青黴素
重金属 (Hg, Pb)
DFP, TPCK Sarin (-Ser) PCMB (-Cys)
(Mixed inhibition)
Juang RH (2004) BCbasics
酶的抑制 ( 機制 )
I
I
S
S
S I
I
I II
S
Competitive Non-competitive Uncompetitive
EE
另一結合區竞争結合區抑制剂
基 质图
解
抑制基理及說明
[II] 只与自由的 [E] 結合,會与 [S] 竞争;[S]↑ 可克服 [II] 的抑制。
[II] 可与自由的 [E] 或已佔據有 [S] 的 [ES] 結合, [S]↑ 不能克服 [II] 的抑制。
[II] 只能与 [ES] 結合, [S]↑ 反而有利 [II] 的抑制。
E + S → ES → E + P + II↓EII
←
↑
E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS
←
↑ ↑
E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS
←
↑
EI
S X
Juang RH (2004) BCbasics
Km
酶的抑制 ( 作图 )
I II Competitive Non-competitive Uncompetitive
直接作图
雙倒數作图
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
II II
Km [S], mM
Vmax
II
Km’
Vmax’Vmax’
Vmax 不变; Km 变大 Vmax 变小; Km 不变 Vmax 及 Km 均变小
II
1/[S]1/Km
1/vo
1/ Vmax
II
兩條平行線
II
交於X軸
1/vo
1/ Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/ Vmax
1/vo
交於 Y 軸
= Km’
Juang RH (2004) BCbasics
思考与练习1. 1/v 对 1/[S] 的双倒数作图得到的直线斜率为 1.2×1
0-3min ,在 1/v 轴上的截距为 2.0×10-2ml.min/ n mol 。计算 Vmax 和 Km 。
2. 一个二肽酶对二肽 Ala-Gly 和二肽 Leu-Gly 的 Km分别为 2.8×10-4 和 3.5×10-2 ,哪一个二肽是酶的最适底物?该酶的两个非竞争性抑制剂的 Ki 值分别为 5.7×10-2 和 2.6×10-4 。哪一个是最强的抑制剂?
3. 根据米式方程求( a ) Kcat 为 30s-1 , Km 为 0.005M 的酶,在底物浓度为多少时,酶促反应的速度为 1/4 Vmax ?( b )底物浓度为 1/2Km , 2 Km 和 10 Km 时,酶促反应的速率分别相当于多少Vmax ?
4. 枯草杆菌蛋白酶 ( 相对分子质量 27 600) 是一种能催化某些氨基酸酯和酰胺水解的细菌蛋白酶。对于合成的底物 N— 乙酰— L— 酪氨酸乙酯 (Ac-Tyr-OEt) ,枯草杆菌蛋白酶的 Km 和 kcat 分别为 0 . 15mol / L 和 550
s-1 。 (a) 当枯草杆菌蛋白酶的浓度是 0 . 40g / L 时, Ac-Tyr—OEt 水解的 Vmax 是多少 ? (b) 吲哚是枯草杆菌蛋白酶的竞争性抑制剂,抑制剂常数 Ki 为 0 . 05mol / L 。当吲哚为 6 . 25mmol /L 时,计算 Ac—Tyr-OEt 被 0 . 40g / L 枯草杆菌蛋白酶水解的 Vmax 。 (c) 计算 0 . 40g / L 枯草杆菌蛋白酶与 0.25mol / L Ac—Tyr-OEt 和 1.0mol/L 吲哚共同存在时的 V 。
5. 红细胞中的碳酸酐酶 ( 相对分子质量为 30 000) 具有很高的转换数。它催化 C02 的可逆水合反应:此反应对 CO2 从组织运往肺部很重要。如果 l0μg 的纯碳酸酐酶在 37℃ 下 lmin 内,以最大速度可催化 0. 3g CO2 的水合反应,那么碳酸酐酶的转换数 (Kcat)
是多少
6. 酶溶液加热时,随着时间的推移,酶的催化活性逐渐丧失。这是由于加热导致天然酶的构象去折叠。己糖激酶溶液维持在 45℃12 分钟后,活性丧失百分之五十。但是若己糖激酶与大量的底物葡萄糖共同维持在 45℃12 分钟,则活性丧失仅为 3 %。请解释,为什么在有底物存在下,己糖激酶的热变性会受到抑制?
7. 新掰下的玉米的甜味是由于玉米粒中的糖浓度高。可是掰下的玉米贮存几天后就不那么甜了,因为 50 %糖已经转化为淀粉了。如果将新鲜玉米去掉外皮后浸入沸水几分钟,然后于冷水中冷却,储存在冰箱中可保持其甜味。这是什么道理?