第 10 章 酶动力学

Michaelis 与 Menten 發展出酶动力学

Michaelis Menten

Ne

lso

n &

Co

x (2

00

0)

Le

hn

ing

er

Prin

cip

les

of

Bio

che

mis

try

(3e

) p

.25

8

转化酶 Invertase (IT)

ITSucrose

非还原糖 还原糖

Glucose Fructose

Reducing Power

+HOCH2

O

OH

1

23

4

5

66

54

32

1

1

2

3

4

5

6

HOCH2

O

OH

OHOCH2 HOCH2

OH

H2O

O

HOCH2HOCH2

HO

O

HOCH2

OHOCH2HOCH2

O

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

H2C-OH

C=O HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

1 2

提高基质浓度增強酶活性表現

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

基质浓度 mole

生成物浓度

80

60

40

20

0

S+E

↓

P

(

在固定時間內反

应)

Juang RH (2004) BCbasics

酶动力学的基本出發點

E S+ P+

Steady State TheorySteady State Theory

ES 的生成量与消失量相等，故平衡時 [ES] 浓度成一穩定狀態。

SE E

Juang RH (2004) BCbasics

酶动力学大綱 – 緣起

E + S ES E + P(vo)k2

k1 k3

k1[E][S] = k2 [ES] + k3 [ES]

vo=Vmax [S]Km + [S]

[Et] = [Ef] + [ES]vo = k3 [ES]Vmax = k3 [Et]

3.1

3.2 酶必須先与基质結合

ES 的生成量 等于其消失量[ES] 浓度恆定 3.2.1Steady State

由上式出發可推得Michaelis-Menten 公式 3.2.2

Juang RH (2004) BCbasics

(vo)

酶动力学基本观察

k1 [E][S] = k2 [ES] + k3 [ES]

[Et] = [Ef] + [ES]

vo = k3 [ES]

Vmax = k3 [Et]

(I)

(II)

(III)

(IV)

E + S ES E + Pk2

k1 k3

Juang RH (2004) BCbasics

(1) 整理 (I) 可得： (k2 ＋ k3) [ES] = k1 [E][S]

k1 k2 ＋ k3 [E][S] 故 [ES] = ─── [E][S] ；另設 ─── ＝ Km 則 [ES] = ─── k2 ＋ k3 k1 Km

vo vo [E][S] k3 [E][S](2) 由 (III) 得 [ES] = ─ ，故 ─ ＝ ─── 即 vo ──── ＝ (V) k3 k3 Km Km

(3) 由 (II) 得 [Ef] ＝ [Et] - [ES] ， 而 [Ef] 可視為 [E] ，故： [E] ＝ [Et] - [ES] 代入 (V) 得︰

k3 ([Et]-[ES])[S] k3 [Et][S] - k3 [ES][S] vo ─────── ─────────＝ ＝ Km Km

(4) 把 (III) vo ＝ k3 [ES] 及 (IV) Vmax ＝ k3 [Et] 代入得︰ Vmax [S] - vo [S]vo ─────── → ＝ vo Km ＝ Vmax [S] - vo [S] 移項 Km → vo Km + vo [S] ＝ Vmax [S] (VI)

Vmax [S] (5) 整理 (VI) 集中 vo 即得 M-M 公式： vo ────＝ Km + [S]

移出 [ES]

定義 Km

由 [ES]

導入 vo

分解 [E]

转换得Vmax 及 vo

提出 vo

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

动力学实验操作 (invertase)

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

双倒數作图 直接作图

1)1) 先取固定量的 酶 (invertase) → E

2)2) 加入各种不同浓度的 基质 ( 蔗糖 ) → S (x 軸 )

3)3) 在一定 時間 內測 生成物 量 (P/t) → vo (y 軸 )

4)4) (x, y) 作图得 双曲線 之一股推 漸近點 → Vmax

5)5) 當 y = 1/2 Vmax 時求其 x ( 即 [S]) 即得 → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

动力学实验操作实例实驗數據

編號1234

0.250.501.02.0

0.420.720.800.92

吸光值 v (mole/min)[S]

0.210.360.400.46

(1) 已知反应後呈色的吸光值每 0.05 吸光有 1 mole 生成物。(2) 酶催化反应的時間為 10 min 。

反应速率基质浓度 反应呈色 双倒數1/S 1/v421

0.5

2.081.561.351.16

→→ → →

1.0

0.5

0

v

直接作图

双倒數作图

2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

酶的抑制

可逆性抑制 不可逆抑制

抑制剂与酶非共价結合 抑制剂与酶行共价性修飾

Competitive

Non-competitive

Uncompetitive

Penicillin 青黴素

重金属 (Hg, Pb)

DFP, TPCK Sarin (-Ser) PCMB (-Cys)

(Mixed inhibition)

Juang RH (2004) BCbasics

酶的抑制 ( 機制 )

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Competitive Non-competitive Uncompetitive

EE

另一結合區竞争結合區抑制剂

基 质图

解

抑制基理及說明

[II] 只与自由的 [E] 結合，會与 [S] 竞争；[S]↑ 可克服 [II] 的抑制。

[II] 可与自由的 [E] 或已佔據有 [S] 的 [ES] 結合， [S]↑ 不能克服 [II] 的抑制。

[II] 只能与 [ES] 結合， [S]↑ 反而有利 [II] 的抑制。

E + S → ES → E + P + II↓EII

←

↑

E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS

←

↑

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Km

酶的抑制 ( 作图 )

I II Competitive Non-competitive Uncompetitive

直接作图

雙倒數作图

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

II II

Km [S], mM

Vmax

II

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax 不变； Km 变大 Vmax 变小； Km 不变 Vmax 及 Km 均变小

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

II

兩條平行線

II

交於X軸

1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

交於 Y 軸

= Km’

Juang RH (2004) BCbasics

思考与练习1. 1/v 对 1/[S] 的双倒数作图得到的直线斜率为 1.2×1

0-3min ，在 1/v 轴上的截距为 2.0×10-2ml.min/ n mol 。计算 Vmax 和 Km 。

2. 一个二肽酶对二肽 Ala-Gly 和二肽 Leu-Gly 的 Km分别为 2.8×10-4 和 3.5×10-2 ，哪一个二肽是酶的最适底物？该酶的两个非竞争性抑制剂的 Ki 值分别为 5.7×10-2 和 2.6×10-4 。哪一个是最强的抑制剂？

3. 根据米式方程求（ a ） Kcat 为 30s-1 ， Km 为 0.005M 的酶，在底物浓度为多少时，酶促反应的速度为 1/4 Vmax ？（ b ）底物浓度为 1/2Km ， 2 Km 和 10 Km 时，酶促反应的速率分别相当于多少Vmax ？

4. 枯草杆菌蛋白酶 ( 相对分子质量 27 600) 是一种能催化某些氨基酸酯和酰胺水解的细菌蛋白酶。对于合成的底物 N— 乙酰— L— 酪氨酸乙酯 (Ac-Tyr-OEt) ，枯草杆菌蛋白酶的 Km 和 kcat 分别为 0 ． 15mol ／ L 和 550

s-1 。 (a) 当枯草杆菌蛋白酶的浓度是 0 ． 40g ／ L 时， Ac-Tyr—OEt 水解的 Vmax 是多少 ? (b) 吲哚是枯草杆菌蛋白酶的竞争性抑制剂，抑制剂常数 Ki 为 0 ． 05mol ／ L 。当吲哚为 6 ． 25mmol ／L 时，计算 Ac—Tyr-OEt 被 0 ． 40g ／ L 枯草杆菌蛋白酶水解的 Vmax 。 (c) 计算 0 ． 40g ／ L 枯草杆菌蛋白酶与 0.25mol ／ L Ac—Tyr-OEt 和 1.0mol/L 吲哚共同存在时的 V 。

5. 红细胞中的碳酸酐酶 ( 相对分子质量为 30 000) 具有很高的转换数。它催化 C02 的可逆水合反应：此反应对 CO2 从组织运往肺部很重要。如果 l0μg 的纯碳酸酐酶在 37℃ 下 lmin 内，以最大速度可催化 0． 3g CO2 的水合反应，那么碳酸酐酶的转换数 (Kcat)

是多少

6. 酶溶液加热时，随着时间的推移，酶的催化活性逐渐丧失。这是由于加热导致天然酶的构象去折叠。己糖激酶溶液维持在 45℃12 分钟后，活性丧失百分之五十。但是若己糖激酶与大量的底物葡萄糖共同维持在 45℃12 分钟，则活性丧失仅为 3 ％。请解释，为什么在有底物存在下，己糖激酶的热变性会受到抑制？

7. 新掰下的玉米的甜味是由于玉米粒中的糖浓度高。可是掰下的玉米贮存几天后就不那么甜了，因为 50 ％糖已经转化为淀粉了。如果将新鲜玉米去掉外皮后浸入沸水几分钟，然后于冷水中冷却，储存在冰箱中可保持其甜味。这是什么道理？