第五章 诊 断 酶 学
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第五章 诊 断 酶 学. 湘南学院医学检验系 临床生化检验教研室. 教学目标. [ 教学时数 ] 6 学时. [ 掌握 ] 血清酶的分类、生理变异、病生机制等,同工酶及其亚型测定,临床诊断中常用的血清酶及其同工酶,重要血清酶的测定、原理及评价 。 [ 熟悉 ] 酶的有关酶基本知识,酶活性浓度的测定技术及酶的免疫化学测定 。. 第一节 血 清 酶. 血浆特异酶. 血浆特异酶. 外分泌酶 细胞酶. 外分泌酶 细胞酶. 非血浆特异酶. 非血浆特异酶. 一般代谢酶 组织专一酶. 一、血清酶的来源. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
第五章第五章 诊 断 酶 学诊 断 酶 学湘南学院医学检验系湘南学院医学检验系 临床生化检验教研室 临床生化检验教研室
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教学目标[ 教学时数 ] 6 学时
[[ 掌握掌握 ]] 血清酶的分类、生理变异、病生机制等,同工酶及其亚型测定,临床诊断中常用的血清酶及其同工酶,重要血清酶的测定、原理及评价 。 [[ 熟悉熟悉 ]] 酶的有关酶基本知识,酶活性浓度的测定技术及酶的免疫化学测定 。
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第一节 血 清 酶
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一、血清酶的来源 根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况,将其分为:
一般代谢酶组织专一酶
血浆特异酶
非血浆特异酶 外分泌酶
细胞酶 一般代谢酶组织专一酶
血浆特异酶
非血浆特异酶 外分泌酶
细胞酶
血 清 酶
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名称
血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞酶
一般代谢酶 组织专一酶
来源 肝 消化腺或其它外分泌腺 各组织器官 (无器官专一性) 肝 (有器官专一性)
种类 凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纤溶酶原、 ChE 、CER 、 LCAT 、脂蛋白脂肪酶等
胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP 、 AL
P 等
LDH 、 AST 、 ALT 、CK 、 MDH 等
OCT 等
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二、血清酶的去路酶蛋白在血管内的失活与降解(主要代谢去路)
血清酶的半寿期( T1/2) :酶失活至原来活性一半所需时间。有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异。
肝或网状内皮系统对血清酶的清除 少数以酶原形式存在的血清酶类(凝血酶原、纤溶酶原)在活化后迅速被肝清除,网状内皮系统也可能参与血清酶( LD 、 AST 、 AMY 、 CK 等)的清除。
血清酶的排泄 尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途径,如胃蛋白酶原、淀粉酶( AMY )。
转入其它体液 只有血清酶的来源与去路保持平衡,才能维持酶活性保持相对恒定。但一些病理情况往往促使这种平衡被打破,导致血清酶活性的变化。
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三、血清酶变化的病理机制(一)合成异常
合成减少
合成增多
肝损害导致合成酶的能力受损( ChE 、 LCAT )酶基因变异引起酶合成减少(铜氧化酶)增生性疾病(骨骼疾病, ALP)恶性肿瘤(前列腺癌, ACP)
酶的诱导作用(乙醇, γ-GT )
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(二)释放增加(大多数血清酶增高的主要机制)细胞内外酶浓度的差异 对于非血浆特异酶,细胞内外浓度差可在千倍以上,只要有少量细胞坏死或病变,血中酶浓度明显升高。对血浆特异酶,细胞病变很少引起血中酶浓度明显升高。酶的相对分子量(影响细胞内释出的关键)
酶从细胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。如 AMI 时,血中最先升高的是 CK( MW : 85kD) , LD ( MW : 125kD)出现升高明显延迟。酶的组织分布
含酶量高且血流丰富的组织器官,其细胞内酶进入血流的可能性大;除少数组织专一性酶以外,大多数血清酶不能特异反映某个特定组织的病变。但同工酶的发现大大提高酶检测的组织的特异性。
酶在细胞内的定位及存在形式 线粒体酶不易从细胞中释出,如 ASTm 的检测往往反映肝细胞的损伤程度,且是 AMI 中最后升高的酶,用于判断预后;有些酶在细胞内与结构蛋白结合,较难释放。
ATP
ATP 不足,细胞内酶容易释放。
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(三)排出异常肾功能减退,血清 AMY 活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留。胆道梗阻,血清 ALP 升高的原因是梗阻区 ALP 合成加强, ALP 排泄受阻而逆流入血。大多数酶,不存在以上的清除机制。
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四、血清酶的生理差异(一)性 别
多数酶无差异,少数有差异男性高于女性: CK、 ALP、 γ-GT女性高于男性: LDH1(青年妇女)(二)年 龄 最明显的例子是 ALP,新生儿血清中 ALP略高于成人, 1 ~ 5岁增至成人的 2 ~ 3倍,然后逐渐下降,到 10~ 15岁, ALP又明显升高,可达成人的 3~ 5倍, 20 岁后降至成人值。
(三)饮 食 血清中大多数酶不受进食影响,故测定酶活性不一定需要空腹采血。(四)运 动
激烈的肌肉运动可使血清中多种酶,如 CK、LD、 AST 、 ALD、 ALT 等活性升高。(五)妊 娠(六)其 它
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第 二 节
酶活性浓度的测定技术
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酶活性浓度的测定技术酶活性浓度概念酶活性浓度测定连续监测法检测酶活性浓度工具酶血清酶活性浓度测定条件的优化酶活性浓度的单位
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一、酶活性浓度的概念1. 酶的特性:微量性、高效性等。直接测量非常困难( mmol/L 或 mg/d
l ) 通过测定被加速化学反应的反应速率,来间接反映酶的浓度
2. 酶促反应
S
S
E
E + ES
E P
E + P
V= dsdt 或 V=dp
dt
E S
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3. 酶活性浓度 即酶所催化的化学反应的反应速率,用酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。注意:只有当酶所催化的反应速度仅与 [E] 成正比,而不受其它因素影响时,即在酶促反应的零级期,才能根据酶所催化的化学反应速率来确切表示酶活性浓度的大小。
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实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的量,因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件及技术条件非常高,价格昂贵,不适用于临床检测,因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最为常见的方法,具有迅速、灵敏、成本低等特点。 但仅在上述前提下,只能在反应的零级期,即只有在酶促反应的最适条件下,才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线,采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。
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零级 一级[P]
[S]
V = dpdt
反应级数
时间
4. 酶促反应进程
延滞期
线性期非线性期
Lag phase
Zero order
Linear phase
First order
酶促反应时间进程曲线
17单试剂测定体系酶促反应进程曲线
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结论: 为了计算酶活性浓度,必须根据线性反应期(零级反应期)的反应速率才能准确计算出酶活性浓度否则将导致误差。 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到 Vmax ,即在过量底物存在下的零级反应期的 V ,此时 V 与 [E]之间有线性关系。
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二、酶活性浓度测定方法(一)按检测方法分类
1 、量气法 其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力,从而计算出气体的变化量适用于测定在反应中产生或 消耗气体的酶2 、分光光度法
酶促反应的底物与产物结构不同,光吸收谱也有差异,不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度,还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质3 、荧光法和放射性核素法
通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率,此速率与酶浓度成正比4 、其它方法
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(二)按反应时间分类1 、定时法(取样法、终点法、两点法)优点:简单,测定时酶促反应已被终止,故比色计或分光光度计无需保温设备,显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。缺点:无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零
级反应。注意:应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期,确定线性时间;保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要精确。
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定时法,早期测定酶活性浓度的方法,大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应的平均速度。
连续监测法,即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据,求出酶促反应初速度,间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。
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2 、连续监测法(动力学法、速率法)优点: 容易找到直线区域,选择线性反应期来计算酶活性,
不需终止反应。缺点: 线性反应期因酶种类和反应条件而异,必须用实验方法进行确定,必须选取酶促反应的最适反应条件,需要有可以连续监测的设备。3 、平衡法 目前临床应用较少,通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。
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三、连续监测法测定酶活性浓度(一)种类
1.直接法 不终止酶促反应条件下,直接通过测定反应体系中底物或产物理化性质的变化(如: A 、荧光、旋光性, pH 、电导率、粘度等),从而计算出酶活性浓度。
评价 方法简单,但只有底物与产物之间,在理化性质方面有显著性差异时,才能使用直接法,只有很少一部分酶能用直接法测定。
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( 1 ) 目前以分光光度法最为广泛,利用 340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。
NAD(P)++H+ NAD(P)H
仅在 260nm处有吸收峰 在 260 、 340n
m处有吸收峰
340nm处 A 的变化可以反映反应体系中 NAD(P)H量的增减,进而反映酶活性浓度。( 2 ) 利用一类人工合成的所谓色原性底物,其本身为无色或微黄色,酶作用后生成有色化合物。
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( 1 )在原反应体系中加入一些试剂,其只和酶反应物迅速作用,产生可被检出的物质,但该试剂不和酶反应,也不影响酶的活性。S PE + 试剂 可被检出的物质
( 2 )酶偶联法 目前应用最多,即在原反应体系中加入另一些酶试剂,所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。
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(二)酶偶联反应 反应模式A B PEx Ei
被测酶被测酶 始发反应
始发反应
指示反应指示酶
指示反应
指示酶
A B C P
Ex Ea Ei
辅助酶辅助反应酶偶联体系
辅助酶
辅助反应
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1. 酶偶联反应时相 酶偶联反应一开始不能反映酶活性,在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的 ALT 的检测为例,在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶,反应原理如下:
L-丙氨酸+ α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸α-丙酮酸+ NADH 乳酸+ NAD+
ALT
LDH
此时反应的方向由 NADH 转变为 NAD ,随反应进行,A应随之而下降,通过检测反应产物 A 在 340nm处 A 的变化速率,可以检测指示酶反应。
ALT双试剂法测定中,首先使血清与缺少 α-酮戊二酸的底物溶液混合, 37°C保温 5m ,将样品中所含的内源性 α-酮酸消耗完。然后再加入 α-酮戊二酸启动ALT 催化的反应。
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反应一开始加入的试剂 1 中只有丙氨酸,不存在 α-酮戊二酸,在此时相中,存在于样品中的干扰物质(内源性α-酮酸)消耗完。
加入试剂 2 (即 α-酮戊二酸)启动反应,在初始阶段,产物 α-丙酮酸开始出现,并逐渐增多,但处于较低水平,指示酶反应速度也较低,不能代表待测酶的 Vx 。
随着产物 α-丙酮酸增加到一定程度, Ex和 Ei反应 V相同,达到稳态期。此阶段340nm处 A出现明显的线性变化。最后由于底物的消耗,反应 V逐渐减慢,偏离线性。
P150
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2. 酶偶联反应注意事项(1)延滞期应越短越好,测定时间要避开此期。(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定,酶偶联反应 V应超过或等于 Vx, Ei反应必须是一级反应,即指示酶反应速率和测定酶的产物 B浓度成正比。只有使用大量的 Ei及其 Km值很小时才能做到。(3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶(指示酶)制剂。(4)适当的指示酶的用量,反复实验法确定,即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高,并在所选的最适条件下,指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。
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(三)干扰因素(1) 其他酶和物质的干扰(2) 酶的污染(3) 非酶反应(4) 分析容器的污染(5)沉淀形成
解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正,另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。
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四、工具酶工具酶:酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。
(一)工具酶
(二)常用工具酶常用工具酶多为氧化还原酶类工具酶纯度不必要求过高工具酶中杂质的含量有一定的限制
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(三)工具酶参与的指示反应 临床生化检验中,很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理--共通(通用)反应途径。1. 偶联 H2O2 的工具酶及其指示反应葡萄糖尿酸胆固醇甘油丙酮酸
葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶胆固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶
H2O2
以 H ( e )为受体的指示酶
以 NAD(P)H 为辅酶参与的指示酶
触酶
POD(最常用)
2H2O2+4-AAP+酚 醌亚胺 (红色 )+4H2OPOD
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例:葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖Glu+ O2+ H2O GA+ H2O2
H2O2+ 4-AAP+酚 H2O+ O2+红色醌类化合物GOD
POD
葡萄糖氧化酶( glucose oxidase , GOD )利用 O2和 H2O 将 Glu 氧化成 GA ,并释放 H2O2 ,过氧化物酶( peroxidase , POD )在色原性氧受体存在时将 H2O2 分解为 H2O和 O2 ,并将色原性氧受体 4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物,即 Trinder反应。红色醌类化合物的量与 Glu含量成正比。 即 POD 催化下, H2O2 氧化芳香族胺色素原生成有色色素,此类色素原供氢体包括: OT 、 DAB 、 ODA 、 TMB 。
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2. NAD(P)+ 或 NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原反应,尤其是作为工具酶如 LD 、 GLD 、G6PD 等参与时,常将底物的 H 去除后传递给 NAD (P)+ 形成NAD(P)H 。借助 NAD(P)H340nm处特征性的光吸收,借此用分光光度法检测。 如:葡萄糖、尿素、 β-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT 、 AST 、 LD 、 GLD 、 CK 、 ALD 、 G6PD 、 ICD等。
例:尿素+ H2O 2NH3+ CO2
NH3+ α-酮戊二酸 + NADH+ H+ 谷氨酸+ NAD++ H2O
尿素酶GLD
P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) +
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五、血清酶活性浓度测定条件的优化方法仪器设备试剂自动生物化学分析仪参数设置标本的采集、运输与保存
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标本的采集、运输与保存溶血:细胞内酶而言,细胞内外浓度差异大;所以应及时进行分离,静脉采血后应在 1~ 2h 内分离血清。抗凝剂:利用草酸盐、枸橼酸盐、 EDTA抗凝的血浆一般不用作酶活性测定;肝素对 ALT 、 AST 、 CK 、 LD 、 AC
P 检测均无影响,可用于急诊;临床多用血清为首选测定标本。温度:大部分酶在低温中比较稳定,一般在血清分离当天测定,否则应放冰箱冷藏;通常在 0~ 4 °C下使用、处理及保存,除了一些冷变性的酶;液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。
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六、酶活性浓度单位(一)酶活性单位
惯用单位 用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位,即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位,参考值差别很大。国际单位1963年, 1IU= 1μmol/min ( 25 °C 及其他最适条件下) 1976年, 1U= 1μmol/min (特定条件下) 1979年, 1Katal= 1mol/s (规定条件下), 1U= 16.67nKatal
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(二)酶活性浓度单位以每单位体积所含的酶活性单位数表示;各国学者习惯用 U/L表示体液中酶催化活性浓度,
1U/L=16.67nKatal/L
正常上限( upper limits of normal , ULN )倍数 把酶测定值转换为正常上限值的倍数;易于比较解释来自不同方法的结果,利于各实验室间质评调查;可将 ULN进一步适当分级,制定出轻度、中度及重度增加的范围,使检测结果更加一目了然;
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(三)酶活性浓度计算 连续监测法检测酶活性浓度时,使用摩尔消光系数( ε )。其定义为:特定条件下,一定波长的光,光径为 1.0cm 时,通过所含吸光物质的浓度为 1.00mol/L 时的吸光度。
连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化( ΔA/min )U/L=ΔA
min× V×106
ε ×v× LΔA—吸光度变化 106 —把mol换算成 μmol
v—样品量( ml ) L —比色杯光径( cm )V—反应体系体积( ml ) ε —摩尔消光系数( cm2 · mol-1
)
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自动生物化学分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上讲 V , v和 L均为固定值, ε 为常数,则可将公式简写为:
U/L=ΔAmin
×KV×106
ε ×v× LK=
K 为酶活性浓度定量系数主要用于临床酶活性测定的计算与校正K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面,这些均与仪器测定的噪音有关。
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第 三 节
酶的免疫化学测定
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一、报告方式酶活性浓度单位: U/L质量浓度单位: ng/ml , μg/L
二、优点灵敏度高特异性高能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白特别适用于同工酶的检测
样品中其他方法不易测出的少量或痕量酶不受体液中其它物质的影响酶原或去辅基酶蛋白
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三、缺点要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清步骤多,操作繁琐测定成本高
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第 四 节
同工酶及其亚型测定
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一、概念同工酶( isoenzyme ) 同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体,具有相同的催化功能,但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。亚型( isoform ) 即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶,往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。
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二、分析方法 临床同工酶的分析可分为两步首先精确地分离出某酶的各同工酶组分测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性
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二、分析方法(一)电泳法
原理
使用最为广泛简便、快速、分离效果好、不破坏酶的天然构象可分为:乙酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳测定步骤为:区带分离、活性显色和检测结果
方法 同工酶氨基酸组成不同(一级结构不同), pI 不同,电泳迁移率也就不同,电泳可将其分开。
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显色染料偶氮染料四唑盐
离子型化合物,易溶于水,难溶于一般的有机试剂,利用其进行的偶合反应,生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测 受氢体作用,四唑盐可被还原成紫红色的 formazan ,常用的有: NBT 、 INT 、 MTT 等。其中 NBT 使用最多。扫描定量光密度计荧光计
P163
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(二)色谱法 柱色谱法离子交换色谱亲和色谱商品化微型色谱柱
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(三)免疫分析法免疫抑制法免疫沉淀法其它免疫学方法
利用同工酶的一种亚基与相应抗体结合后,酶活性受到抑制,测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化
利用分离提纯的同工酶作抗原制备的抗体与含该型同工酶的待测样品混合,在一定条件下抗原抗体复合物形成沉淀,离心后测定上清液中其它型别的酶活性,将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性,即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫电泳、 RIA 、 EIA和 C
LIA
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(四)动力学分析法 底物特异性分析法 抑制剂分析法 pH 分析法 热失活分析法
(五)蛋白酶水解法
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三、同工酶检测意义提高酶诊断的特异性提高诊断的灵敏度对某些疾病的预后有评价价值
有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异 有些同工酶的变化可在总酶变化之前发生
线粒体酶的测定
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第 五节 临床常用血清酶分析
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一、转氨酶( Aminotransferases )及其同工酶丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases , ALT) / 谷丙转氨酶 GPT
天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases , AST/ 谷草转氨酶 GOT
1. 催化反应L-丙氨酸+ α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸L-天冬氨酸+ α-酮戊二酸 α-草酰乙酸+ L-谷氨酸
ALT
AST
两种酶均需要磷酸吡哆醛( VitB6 )为辅基,不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白,无催化活性。
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2. 组织分布 ALT 大量存在于肝组织,其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶, α(ALTs) 、 β(ALTm) ,分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中 ALT 大多存在细胞质,少量在线粒体,肝细胞坏死时血清中以 ALTs 为主。 AST 存在多种器官,按含量多少为心、肝、骨骼肌和肾。其有两种同工酶 ASTs 、 ASTm ,分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤 ASTs显著升高,而严重损伤时ASTm 大量出现于血清中。血中 AST 升高多来自心脏或肝脏损伤。
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3. 标本 溶血标本不能用于检测 宜用血清, 4℃ 冰箱中可贮存 1星期,活性无明显改变。
4. 临床意义 ALT 是反映肝损伤的一个灵敏指标
急性肝炎早期升高, ALT>AST; 急性肝炎恢复指标 Deritis比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归 酶胆分离是肝细胞坏死先兆
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AST 主要用于肝脏疾病的诊断 AMI 发病 6-8h即升高, 48-60h达高峰, 4-5d恢复正常。由于 AST 在 AMI 时升高迟于 CK ,恢复早于 LD ,故目前诊断 AMI 价值不大。 急性肝炎, AST 升高程度不及 ALT;慢性肝炎,特别肝硬化、慢性活动性肝炎时, AST 升高程度超过 ALT 。
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二、 γ-谷氨酰转移酶及其同工酶γ-谷氨酰转移酶 ( γ- glutamyl transpeptid, γ- GT/GGT )
1. 催化反应又称: γ-谷氨酰转肽酶 ( γ-GTP/GGTP)
一种含巯基的线粒体酶,可催化 γ-谷氨酰基从 GSH 或其它含 γ-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。 GSH+氨基酸 γ-谷氨酰氨基酸+半胱氨酰甘氨酸GGT
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2. 组织分布 肾脏中含量最多,其次为胰、肺、肝等。血清中的GGT 主要来自肝胆。 3. 标本
GGT较稳定,室温下可放置 2d , 4℃可存放 1w, -20℃可储存 1y; RBC 中几乎无 GGT ,因此溶血标本可以检测。
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4. 临床意义
有助肝胆疾病的鉴别诊断 与 ALP联合进行肝脏疾病检测
胆道疾病, GGT阳性率高,而且升高明显,可高达 5-30ULN ,肝实质疾病是GGT 一般只是中度升高,可达 2-5ULN 。
若 ALP 升高而 GGT正常,则完全排除 ALP 的肝来源,若 ALP和 GGT都增加,则应先排除肝外引起 GGT 增加的原因,一旦排除,则 GGT 增高为肝病所致。(1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶
(2) 用于判断恶性肿瘤有无肝转移 (3) 乙醇、巴比妥类药物等可诱导 GGT 的升高。
P168
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三、 肌酸激酶及其同工酶和亚型肌酸激酶 ( creatine kinase , CK )
1. 催化反应 CK 催化肌酸和 ATP 或磷酸肌酸和 ADP之间的磷酸转移的可逆性反应,所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键,是肌肉收缩时能量的直接来源。
磷酸肌酸+ ADP 肌酸+ ATPCK
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2. 组织分布 广泛分布于全身,在骨骼肌含量最高,其次是心肌和脑。CK由两种不同亚基( M , B )组成的二聚体,细胞质中存在三种同工酶: CK-BB(CK1) 、 CK-MB(CK2) 、 CK-MM(CK3) ,线粒体中存在 CK-Mt(CK4) ,其电泳速率最慢。 CK 同工酶又可分为不同亚型, CK-MM 有三种亚型,CK-MM1 , CK-MM2 , CK-MM3 ,电泳速率依次减慢; CK-MB 有 CK-MB2和 CK-MB1两种亚型。
3. 标本 不得用溶血标本, RBC 中含有 AK ,可干扰测定,引起测定值偏高;测定样品宜用血清或肝素抗凝血浆,其它抗凝剂都抑制 CK 活性。
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4. 临床意义 CK 及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一,主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。
(1) AMI 的早期诊断总 CK 在 AMI 诊断中意义不大CK-MB 为诊断 AMI 的金指标CK-MM3/CK-MM1>1.0 为诊断 AMI 的标准(排除急性骨骼肌损伤)CK-MB2>1.9U/L 或 CK-MB2/CK-MB1>1.5 为诊断 AMI 的标准之一 (2) 全身疾病特别是肌肉疾病时, CK极度升高
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四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型乳酸脱氢酶 ( lactate dehydrogenase , LD/LDH )
1. 催化反应 LD 催化乳酸氧化成丙酮酸,同时将氢转移给辅酶而成为 NADH ,依条件不同而有可逆性。
L-乳酸+ NAD+ 丙酮酸+ NADH+ H+pH8.8~ 9.8
Ph7.4~ 7.8
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2. 组织分布 LD 是一种含锌的糖酵解酶,广泛存在于人体各组织中,以肝、心肌、肾、肌肉、 RBC含量最高。 LD 是由两种不同亚基( M和 H )组成的四聚体,形成 5种结构不同的同工酶,即 LD1(H4) , LD2(H3M) , LD3(H2M2) ,LD4(HM3)和 LD5(M4) 。 1. 以 LD1 为主,主要在心肌,可占总 LD 活性 50%以上,
也存在于 RBC 内; 2. 以 LD5 为主,以横纹肌为代表,肝脏中也有; 3. 以 LD3 为主,存在于脾肺。 一般成年人血中 LD 同工酶存在如下规律: LD2>LD1>LD3>L
D4>LD5 ,部分正常儿童血中可见 LD1>LD2 。
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3. 标本 一般用血清,用血浆需离心去除血小板(血小板中含有大量的 LD ),采血后迅速分离血清;因 RBC 中 LD含量比血清高 100 倍以上,不宜用溶血标本。 LD4 、 LD5宜冷变性,不应放在冰箱中, 25 ℃放 2-3d , LD 活性变化不大。
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4. 临床意义 亚急性心肌梗死诊断有一定价值,但其特异性差;
(1) 诊断心脏疾病 心肌梗死和心肌炎时以 LD1和 LD2 升高为主,大多数 AMI患者血中会出现“反转比率”,即 LD1>LD
2; (2) 诊断肝脏疾病 肝细胞损伤时常出现 LD5>LD4; 急性肝炎时 LD1LD2 相对下降, LD5 升高;慢性肝炎时 LD5 升高,且 LD1<LD3;肝硬化时为 LD2下降和 LD5 升高;肝癌时 LD5 升高,但 LD1>LD3;
(3) 诊断骨骼肌疾病 骨骼肌损伤时常出现 LD5>LD4;
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五、碱性磷酸酶及其同工酶碱性磷酸酶 ( alkaline phosphatase , ALP/AKP )1. 催化反应 一种含锌的糖蛋白,在碱性环境中( pH10.0 )可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。2. 组织分布 ALP广泛存在于各组织器官中,其含量以肝脏为最多,其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的 ALP 主要来自肝脏和骨骼。 生长期儿童血清内 ALP 主要来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞,少量来自肝。
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3. 标本 空腹采血,避免脂肪餐的影响;样品用血清,不能用明显溶血标本;在室温或冰箱放置,活性逐渐升高,可增加 5-10%,应在采血当日测定。 4. 临床意义 很多骨骼疾病如变形性骨炎等患者血中 ALP 升高,我国常用于早期诊断佝偻病和软骨病。 (1) 诊断骨骼性疾病
(2) 诊断肝胆系统疾病,尤其是黄疸 急性肝炎时 ALP 增高达 2-5ULN ,肝硬化、胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积, ALP 增高达 5-20ULN 。 90%以上肝外胆道阻塞患者血清 ALP 升高,升高程度和阻塞程度、病变程度成正比。
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六、酸性磷酸酶及其同工酶酸性磷酸酶 ( acid phosphatase , ACP )
1. 催化反应 作用类似 ALP 的磷酸酶(最适 pH 在 7.0 以下)
2. 组织分布 ACP 存在于人体不同组织,如前列腺、红细胞、血小板、肾脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉及骨髓中,以前列腺含量最多。正常男性血清中 ACP约有 1/3-1/2 来自前列腺。
3. 标本 血清或肝素抗凝血浆, 37 ℃ 或偏碱时灭活很快, pH降至 6.5 以下,酶比较稳定。
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临床意义 主要用于诊断前列腺癌,血清 ACP显著上升,转移性癌患者可达 40-50ULN 。由于 ACP 不稳定,测定困难,目前正被其它前列腺标志物如 PSA 所取代。
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七、淀粉酶及其同工酶淀粉酶 ( amylase , AMY/AMS )
1. 催化反应 将多种糖化合物,如淀粉、肝糖原等水解成糊精、麦芽糖和少量葡萄糖等产物的一组酶。
2. 组织分布 人体胰腺含 AMY最多,唾液腺也分泌大量 AMY 入口腔,还见于卵巢、肺、睾丸、横纹肌和脂肪组织中。 AMY 是一种需钙金属酶,其最适 pH 在 6.5-7.5之间,卤素和其它阴离子有激活作用。
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3. 标本 多用血清或肝素抗凝血浆,其它抗凝剂都有抑制作用,不宜用去钙血浆测定 AMY 。
4. 临床意义 (1) 评价胰腺外分泌功能的一种辅助诊断指标。 (2) 急性胰腺炎早期检测血 AMY ,在后期测定尿 AM
Y更有价值。 (3) AMY 诊断胰腺炎其增幅与病情不成比例时,常预示坏死性胰腺炎。
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八、脂肪酶脂肪酶 ( lipase , LPS/LIP ) 胰腺外分泌酶,血清中 LPS 主要来自胰腺,少量来自胃肠粘膜。
LPS 在急性胰腺炎时活性升高的时间早,上升的幅度大,持续的时间长,其诊断价值高于 AMY 。 临床发现,凡血清 AMY 升高的病例,其 LPS均升高;而 LPS 升高者 AMY 不一定升高。
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九、胆碱酯酶胆碱酯酶 ( choline esterase , ChE )
一类催化酰基胆碱水解的酶类,人体内有两种。 ChE 在肝脏合成后立即释放到血浆中,为评价肝细胞合成功能的灵敏指标。各种肝病,病情越差,血清 ChE 活性越低,持续降低无回升迹象者多预后不良。
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临床各系统疾病的酶学诊断一、肝脏疾病
诊断肝实质细胞受损的酶: AST ALT LD(LD5) 反映肝细胞合成功能的酶: ChE LCAT 凝血酶原
诊断肝纤维化的酶: MAO 诊断胆道梗阻的酶: ALP GGT 5`-NT
二、骨骼及骨骼肌疾病 诊断骨骼疾病: ALP
诊断骨骼肌疾病: CK(CK- MM) AST LD (LD5)
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三、胰腺疾病 AMY LPS
四、前列腺疾病 ACP PSA
五、心肌酶谱 CK-MB : AMI 诊断的金指标 ASTm :判断预后 LD : LD1>LD2
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思考题 : 1. 酶蛋白各级结构的组成和特点? 2. 米 - 曼式方程和林 - 贝式方程的关系? 3. 各种因素对酶促反应的影响? 4. 为何测定血清酶可协助临床诊断疾病? 2.酶活性测定的方法有哪些?各根据什么原理设计? 5. 酶促反应进程可分为哪几个期,有何意义? 6. 常用指示酶和工具酶的关系 7. 酶活性浓度用什么来表示?怎样计算? 8. 如何选择优化酶活性浓度测定的条件? 临床常用于诊断的酶有哪些?用什么方法测定?有何临床意义?