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Virus Regulation

© 2009 by Ruth Brack-WernerMolekulare Virologie

Virale Expressionsstrategien

Ziel:

Abruf der im Genom gespeicherten Information

zur richtigen Zeit und in der richtigen Menge

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Genomgrössen von verschiedenen sequenzierten Organismen

http://www.genomenewsnetwork.org/articles/02_01/Sizing_genomes.shtml

Amoeba dubia670 billion (= 109) bp

Plasmodium falciparum0.023 billion bp

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Genomgroessen von verschiedenen Viren: DNA Viren

> 400 nm ø.

DS DNA Genom1.2 x 106 BP911 Gene

DNA Virus:MimivirusWirt: Amoeba

ES (-) DNA Genom1.8 - 2.3 x 103 Basen 12-26 nm ø;.

DNA Virus:CircovirusWirte: Schwein, Vögel

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Genomgroessen von verschiedenen Viren: RNA Viren

80-160 nm ø; Behüllt.

SS (+) RNA Genom16 - 21 x 103 Basen

CoronavirusWirt: Säugetiere

ES (+)RNA Genom7.2 - 8.4 x 103 Basen

28-30nm ø; Unbehüllt.

PicornavirusWirt:Wirbeltiere, Insekten

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Baltimore Klassifikation zur Einteilung der Viren.

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DNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen I-II

From Fig. 1.10. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

Nucleic AcidCapsid Symmetry

Naked or enveloped

Genome architecture

Baltimore class

Family name

Virion polymeraseVirion ø(nm)

Genome size(kbp)

Classification Criteria

Properties

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RNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen III-V


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Retroviren: Baltimore Klasse VIBeispiel HIV

Nucleic Acid RNASymmetry of capsid ? conical

morphologyNaked or enveloped envelopedGenome architecture (+) SS

Classificationcriteria

Baltimore class VI

Family name RetroVirion polymerase YesVirion diameter (nm) 145 ± 25

Properties

Genome size (kbp) ~10

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Anforderungen an Informationsspeicherung und -Abruf bei Viren

Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms;

Zeitliche Koordination der Synthese viraler Bestandteile;

Behauptung in der Konkurrenz um zelluläre Ressourcen;

Erhaltung der Virusfamilie: Vermehrung; Erhaltung auch unter ungünstigen Bedingungen;

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Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms

Beispiel HIV: 1 Gen ergibt 15 Proteine

vif

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit2/viruses/hivgenes.html

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Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms

Beispiel HIV: Überlappende Leseraster

Vif TatRev

VprVpu

NefGag

Pol env

LTR LTR

Env

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Der Preis: Veränderung eines Nukleotids kann sich auf mehrere Proteine auswirken

G T T T C A G A C C C A C C T C C T A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A AEnv (gp 41) F Q T H L L I P R G P D R P E GRev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R NTat Exon 2 P T S

Substitution: C -> T

G T T T C A G A C C C A C C T C C C A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A AEnv (gp 41) F Q T H L P I P R G P D R P E GRev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R NTat Exon 2 P T S Q S R G D P T G P K E

.... C T C C C A A T C

P I

Auswirkungen:

Env (gp 41) CCA -> CAA P -> Q

Rev Exon 2 CCC -> CCA kein Effekt

Tat Exon 2 CAA -> AAA Q -> K

Tat

RevEnv

LP N

S Q

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Strategien zum Abruf und zur Umsetzungder im Genom gespeicherten Information

Alternatives Splicing von einem Primär-Transkript

RNA-Prozessierung

Beispiele: AdenoviridaeOrthomyxoviridaePapillomaviridaePolyomaviridaeRetroviridae


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Voraussetzung: mRNAs müssen in den Zellkern

Balt. Genom1 Familien RNA Klasse (Beispiele) Syntheseort2

I dsDNA Herpesviridae KAdenoviridae KPapovaviridae KPoxviridae Z

II esDNA Parvovoridae K

III dsRNA Reoviridae Z(segmentiert)

IV (+) esRNA Picornaviridae ZCoronaviridae ZFlaviviridae ZTogaviridae Z

V (-)ssRNA Orthomyxov iridae K(segmentiert)unsegm. Paramyxovi ridae Z

Rhabdoviridae Z

VI RNA ->DNA Retroviridae K

VII DNA3->RNA Hepadnaviridae K

1 Ds: doppelsträngig; es: einzelsträngig.2 Z = Zytoplasma; K = Kern3 DNA-Viren mit RNA als Zwischenstufe

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Überlappende Transkriptionseinheiten: Bildung von verschiedenen Primär-Transkripten

Beispiele: AdenoviridaeHepadnaviridae

RNA-Synthese


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Editieren der RNA Sequenz: Gezielte Veränderung des Ribonukleotids während oder nach Synthese

Beispiele: Paramyxoviridae: Ko-transkriptionellFiloviridae: Ko-transkriptionellHepatitis delta Satelliten virus: Post-transkriptionell

RNA-Prozessierung

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Leaky Scanning: Start der Translation an verschiedenen Start-Kodons möglich

Beispiele: OrthomyxoviridaeParamyxoviridaePolyomaviridaeRetroviridae

Proteinsynthese

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Wiederbeginn der Translation an einem strom-abwärts gelegenen Start-Kodon: Voraussetzung: Strom-Aufwärts gelegenes Start Codon.

Beispiele: OrthomyxoviridaeHerpesviridae

Proteinsynthese

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IRES (internal ribosmal entry site): Bindung von Ribosomen an interne Sequenzen des Transkripts

Beispiele: FlaviviridaePicornaviridae

Proteinsynthese

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Überlesen von Translations-Stop-Signale

Beispiele: AlphavirusesRetroviridae

Proteinsynthese

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Translationsstrategien von Viren

Proteinsynthese von poly-cistronischen mRNAs

UTR: Untranslated region

ORF: Open reading frame

Fig. 11.1. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Regulation der Initiation der Translation

Translationsinitation von zellulären mRNAs:Vorrangiger Mechanismus

• Interaktion der 40S Untereinheit der Ribosomen mit verschiedenen Initiationsfaktoren und mit Met-tRNAi;

• Interaktion des Prä-Initiationskomplexes mit der mRNA;

• “Scanning” der mRNA bis zum Start-Codon (oft das erste ATG)

• Freisetzung der Initiationsfaktoren und Zusammenbau des vollständigen Ribosoms

• Proteinsynthese

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Das RNA “Cap”: Essentiell für die Translation von vielen mRNAs in eukaryotischen Zellen

http://cats.med.uvm.edu/cats_teachingmod/microbiology/courses/gene_regulation/pro_euk/2.6.grg.cap.html

5’Ende der mRNA

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Regulation der Initiation der Translation:

12

3

4

5

Fig. 11.3A. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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“Leaky Scanning”: Überlesen des ersten Start-Kodons beim Scanning

Viral Source Identifier Sequenceflanking firstAUG codon

Proteins

SV40 Late 19S mRNA UCCaugG VP2 u. VP3capsid proteins

Hepatitis BVirus

2.1 kB mRNA GCCaugC Middle andsmall surface

proteinsHIV-1 Spliced mRNA CCUaugG Rev and Nef

regulatoryproteins

Cellular Glucocorticoidreceptor gene

human CUGaugG Long and shorttrans-activators

Optimalsequence

GCCR*CCaugG

Beispiele:

Kozak M., 2002. Gene 299, 1-34*R = Purine (A oder G)

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Wiederbeginn der Translation durch erneute Gewinnung von met-tRNAi durch die an RNA gebundenen 40 S Untereinheit.

Voraussetzungen: Stromaufwärts-gelegener offene Leseraster;

CMV gp48

StartStop

Influenza B VirusRNA Segment 7

Fig. 11.12. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Alternative Strategien zur Translationsinitiation

IRES: Internal Ribosomal Entry Site

Initiation der Translation ist abhängig von einer RNA-Sekundärstruktur, nicht von der CAP-Struktur.

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Alternative Strategien zur Translationsinitiation:IRES

Type I: Poliovirus Type II: Encephalo-myocarditis virus


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Alternative Strategien zur Translationsinitiation:IRES

Bei Poliovirus:Spaltung von eIF4G durch virale protease 2Apro:

=> Hemmung der zellulären mRNA Synthese;Stimulation der Translation an der IRES

Cap-abhängige Initiation

IRES-gesteuerte Initiation

Fig. 11.3C. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

Komar, A. A. et al. J. Biol. Chem. 2005;280:23425-23428

Schematic representation of the cap-dependent ribosome scanning (left panel) and internal initiation (right panel) pathways for the formation of 80 S initiation complexes

ITAF: IRES trans-acting factors

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Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES

Hepatitis C Virus:Typ III IRES

Direkte Bindung von 40S Untereinheit mit IRES

Konformationsänderung der 40S Untereinheit =>Positionierung des ATG;Bindung von Met-tRNAi-eiF2-GTP Komplex

TranslationsstartFig. 11.5 and 11.3A,C. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Verwendung von IRES fuer die Molekularbiologie: Ko-expression von Selektions-Bzw. Markergenen.

Box 11.2. “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Leserasterverschub

Problem: Gag und Protease bzw. Gag und Protease und Pol werden von unterschiedlichen Lesrastern kodiert.

Lösung: kontrolliertes Rutschen der Ribosomen in ein anderes Leseraster.

http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Retroviruses.html

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Programmierter -1 Leserasterverschub

Gag-ProteinLeserasterverschub:Gag-Protease-Pol

Gag;1. Leserasterverschub:Gag-Protease2. Leserasterverschub:Gag-Protease-Pol

http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Retroviruses.html

EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9: 168-174

FIGURE 1. Overview of programmed -1 ribosomal frameshifting

Ribosom pausiert während der Elongation

Verlagerung des Ribosoms um eine Position in 5’ Richung

Verschiebung des Leserasters; Auflösen des Pseudoknotens

Rutsch-Stelle:X XXY YYZG GGA AAC

XXX: 3 identische Nukleotide

YYY: 3 identische NukleotideZ: A,C oder U; nicht G

Linker Region

Pseudoknoten

Leserasterverschub bei dem SARS-Coronavirus.

Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32, 1081-1083

S: Spike; E: Envelope; N: Nucleocapsid; M: membrane protein; ORF, X: weitere Leseraster.

RNA Pseudoknoten Strukturen in verschiedenen Coronaviren.

Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32, 1081-1083

Modell für den Beitrag von Pseudoknoten zum Leserasterverschub.

EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9: 168-174

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Überlesen vom Terminations-Kodon: Murines Leukämie Virus

Gag Pro Pol

Pseudoknotenhttp://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Retroviruses.html

Staple DW and Butcher SE 2005.PLoS 3, 956-959. Fig. 11.13 “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Die Wunderwaffe der Viren

RegulationsfaktorenAufgaben:• Aktivierung/Hemmung der Expression von viralen Proteinen;

• “Priming” der Zelle für die Virusreplikation;•• Zeitliche Koordination der Virusreplikation

Gemeinsame Eigenschaften

• Multifunktionell;

• Interagieren mit vielen verschiedenen Proteinen

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Virale Transkriptionsaktivatoren

Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die keine Sequenz-spezifische DNA Bindung zeigen.

Faktor Virus Interaktion mitzellulären DNA-bindendenProteinen

Effekt

E1A(289;243 AS)

Adenovirus TFIID Aktivierung/Repression

Tax HTLV CREBVP16 Herpes

simplexvirus

OCT-1 Aktivierung

EBNA2 EBV RBP-J Aktivierung

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Virale Transkriptionsaktivatoren

Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die an spezifische Nukleinsäure Signale binden.

Faktor Virus Wirkungdurch direkteBindung anSignale inNukleinsäuren

Effekt

ICP4 Herpesvirus DNA Aktivierung/RepressionT-Antigen Polyom avirus DNA Aktivierung (spät

Gene); Repression(frühe Gene)

Tat HIV RNA Aktivierung

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Einige Grundlagen zur Transkription:Der Promoter

Aus “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Einige Grundlagen zur Transkription:Beipiele für virale Promotoren

Fig. 8.4 “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors: NFkappaB

Fig. 8.6A aus “Principles of Virology”;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

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Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors

Beispiele für virale Promotoren die durch NF-kappaB aktiviert werden:

HTLV-IHIV-1SV40

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Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators:Polyoma T-Antigen

Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p. 2156.

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Die Kontrollregion im SV40 Genom

Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p. 2146.

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Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators:HSV VP16

Viru

s par

ticle

:http

://w

ww

.stdg

en.la

nl.g

ov/s

tdge

n/ba

cter

ia/h

hv1/

herp

es.h

tml

α-genesImmediate early

β-genesearly

γ-geneslate

-

+

Latency

VP16

500 - 1000 molecules

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VP16 funktioniert als Komplex mit zellularen Faktoren

POU domains

Oct-1: Octamer 1 transcription factor

HCF-1: human factor C1

Acidic activation domain

Wysocka J and Herr W. 2003.TIBS 28, 294-304.

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VP16 Domänen

Core-Domäne:•Essentiell für die Bildung von VIC (VP16-induced complex);•Interagiert mit Oct-1 und HCF-1;•Nur schwache DNA Bindung alleine; •Sequenz konserviert zwischen verschiedenen α-Herpesviren;

AD:Transkriptions-Aktivierungsdomäne

Wysocka J and Herr W. 2003.TIBS 28, 294-304.

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VIC: Warum so kompliziert?

Mögliche Erklärung:

Oct-1 und HCF-1 sind wichtig für die Zellproliferation;

Durch die Interaktion mit diesen beiden Faktoren

“tastet” VP16 die Bereitschaft der Zelle für die

Virusreplikation ab (lytische Phase).

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