Informe de actividades del Proyecto: Evaluación de la actividad leishmanicida de

nuevos compuestos y extractos naturales en el modelo de Leishmania mexicana

Registro asignado por la SIP: 20071169

1. Resumen: Las leishmaniosis son enfermedades parasitarias que afectan aproximadamente 88

países en el mundo. En México, el principal agente etiológico de la leishmaniosis es

Leishmania (L.) mexicana. La Organización Mundial de la Salud (WHO) considera

prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos leishmanicidas, debido a los

severos efectos colaterales y limitada actividad parasiticida de los fármacos que se

disponen actualmente en la quimioterapia de la leishmaniosis. Nuestro grupo ha

desarrollado compuestos anti-Trypanosoma cruzi, protozoario relacionado

filogenéticamente con Leishmania spp. Objetivo: Evaluar la probable actividad

leishmanicida de tres compuestos desarrollados por nuestro grupo de investigación y

que han demostrado actividad anti-Trypanosoma cruzi y de dos extractos naturales, en

el modelo por leishmania (L.) mexicana. MATERIAL Y MÉTODOS: Se utilizaron dos

aislados de Leishmania mexicana causantes de casos de leishmaniosis cutanea

localizada, uno de los aislados origino altas densidades de promastigotes en medio

RPMI, mientras que el segundo aislado originó bajas densidades de promastigotes en el

mismo medio al día 7 postinóculo. Los Promastigotes en su etapa de crecimiento

logarítmica (día 4) se pusieron en contacto durante 24 h a concentraciones de 10 a 100

mg/ml de los extractos naturales, así como concentraciones crecientes de 1 a 250

microg/mL de los compuestos sintetizados y de referencia (Glucantine). La actividad se

determinó a través de la evaluación la cantidad de promastigotes antes y después del

ensayo y corroborando la viabilidad por la técnica del azul de trypano con microscopio

invertido (Weniger et al., 2001). Los ensayos se hicieron por triplicado. Ninguno de los

compuestos ensayados, además del fármaco de referencia (Gulcantime®) mostraron

actividad leishmanicida de interés.

2. Introducción:

Las leishmaniosis son enfermedades parasitarias que afectan aproximadamente 88

países en el mundo. En México, el principal agente etiológico de la leishmaniosis es

Leishmania (L.) mexicana. La Organización Mundial de la Salud (WHO) considera

prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos fármacos leishmanicidas, debido a los

severos efectos colaterales y limitada actividad parasiticida de los fármacos que se

disponen actualmente en la quimioterapia de la leishmaniosis. Nuestro grupo ha

desarrollado compuestos anti-Trypanosoma cruzi, protozoario relacionado

filogenéticamente con Leishmania spp.

La estrategia en su diseño se basa en la mayor capacidad de penetración de los

ésteres a través de membranas, lo que facilitará el paso del fármaco al promastigote de

Leishmania mexicana.

MEDIO EXTRACELULAR MEMBRANA MEDIO INTRACELULAR

CH3

CH2

CH2

C

NH

COO-

O

CH3

CH2

CH2

C

NH

C O EtO

O

CH3

CH2

CH2

C

NH

C O EtO

O

CH3

CH2

CH2

C

NH

COO-

O

CH3-CH2-OH

SÍNTESIS ESTERASAS

N-propil éster etílico del àcido éster etílico del àcido N-propil etanol Oxamato N-propil oxámico (EtNPOx) N-propil oxámico oxamato Compuesto polar Compuesto No Las Carboxi-esterasas del medio intracelular

No atraviesa Polar promueven la hidrólisis del éster etílico

a membrana atraviesa la membrana para producir el oxamato N- sustituido.

Además, se evaluarán dos estractos naturales que han sido estudiados por nuestro

grupo de trabajo, los cuales han demostrado tener potencial actividad parasiticida.

3. Métodos y materiales

3. 1 Material biológico: Los promastigotes fueron crecidos en medio RPMI adicionado de suero fetal de ternera al 10%. En la figura 1, se muestra las características de crecimiento de ambos aislados. 3. 2 Obtención de extractos naturales

3.2.1. Fruta de la Chirimoya Colectada en el municipio de Artega, Michoacán. La

especie (Annona cherimola Miller) fue identificada por el grupo de

investigación del Dr. Gerardo Zepeda Vallejo. El extracto crudo de la semilla

Annona cherimola fue obtenida en el Departamento de Química Orgánica de

la E.N.C.B por el Dr. Gerardo Zepeda Vallejo.

a) 3.2.2. La hierba de San Nicolás fue proporcionada por la Dra. María Eugenia

Ordorica del Laboratorio de Etnobotánica de la E.N.C.B.

B) PRUEBA in vitro DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LOS PROMASTIGOTES DE Leishmania

mexicana A LOS FÁRMACOS DE PRUEBA.

Los promastigotes obtenidos de los medios de cultivo RPMI fueron usados para el

experimento. Las pruebas de los fármacos se hicieron en microplacas de 96 pozos

estériles. Cada pozo contuvo 195 µL de medio de cultivo con (1.5 x 106 parásitos/mL), 5

µL de los fármacos disueltos en DMSO, resultando una concentración final de 250, 125,

62.5 y 31.25 µg/mL del compuesto a probar por pozo y una concentración final de

DMSO de 2.5 % o menos lo cual no es tóxico para el parásito. Las microplacas se

mantuvieron a 4ºC durante 24 h. Después de este tiempo se evaluó la concentración de

parásitos usando un microscopio óptico con amplificación de 400x. El conteo de los

parásitos se evaluó por la técnica de Pizzi (1957) y se determinó el porcentaje de

sobrevivencia en comparación al testigo negativo (195 µL de sangre y 5 µL de Solución

Salina Fisiológica) restando el efecto del testigo de reactivos (DMSO al 2.5% v/v,

corroborando que con esta concentración no se causa alteraciones morfológicas ni lisis

del parásito, eritrocitos o leucocitos) (Oliveira et al, 2003).

Se determinó que el testigo positivo fuera de 12.5 µg/mL de cristal violeta (causó el

100% de lisis) y el testigo de reactivos DMSO al 2.5% como concentración final en cada

pozo, ambos testigos fueron usados en todos los experimentos que se realizaron. El

experimento se hizo por triplicado por cada cepa y fármaco a probar.

C. CUENTA DE PARÁSITOS POR EL MÉTODO DE PIZZI (1957)

Se colectaron 5 L de sangre con una micropipeta, la sangre se depositó en un

portaobjetos y por presión mecánica con un cubreobjetos se distribuyó uniformemente

la sangre en el área del cubreobjetos. Se contaron 25 campos microscópicos, utilizando

el objetivo de 40x, para el conteo se tomó en cuenta el número de campos posibles que

se pudieran contar en esta área (Pizzi 1957).

4. Resultados Ninguno de los compuestos evaluados (Ésteres etílicos N-metil oxámico, N-propil

oxámico, N-isopropil oxámico y el éster bencílico y dos extractos de la semilla de

Annona cherimola Miller (Chirimoya) y Piqueria trinervia Cav. (de la hieba de San

Nicolas) mostraron actividad leishmanicida in vitro en el modelo por leishmania (L.)

mexicana utilizad, por lo que se consideró sin interés el realizar el estudio in vivo.

Se describen algunos detalles del modelo utilizado. Meta. Mantenimiento de cepas de Lesihmania mexicana. Las dos cepas de Leishmania mexicana fueron aisladas y mantenidas en el laboratorio por la Dra. Amalia Monroy Ostria, colaboradora del presente proyecto. Ambos aislados fueron obtenidos en casos clinicos mexicanos con leishmaniosis cutanea localizada.

Tiempo (días)0 1 2 3 4 5 6 7 8

No.

de

pará

sito

s / m

L

0

5x106

10x106

15x106

20x106

25x106

Aislado 1Aislado 2

Figura 1. Curva de crecimiento de dos aislados de Leishmania mexicana utilizados en el presente proyecto. Meta Obtención de extractos naturales actividades: Obtener extratos acuosos, etílicos de la Piqueria trinervia. A) OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO DE LA PLANTA DE SAN NICOLÁS (Piqueria trinervia Cav.)

La extracción de la hierba de San Nicolás se realizó a partir de la planta seca (tallo,

hojas y flores), el método empleado fue por maceración de la planta, concentración del

extracto crudo y cromatografía en columna de sílica gel que se detalla a continuación:

1. Se molieron 500 gramos de las partes aéreas de la planta ya seca.

2. Procedimos a macerar la planta en etanol al 96º por 7 días. El etanol posee

propiedades del agua y de compuestos orgánicos (polares y no polares

respectivamente) y por lo tanto arrastra consigo sustancias afines a ambos (Stuart,

1979)

1. Filtramos para separar el etanol del material sólido (residuos de la planta)

obteniendo aproximadamente 2 ½ litros, evaporamos hasta sequedad en rota vapor a

60º c hasta obtener el extracto crudo (aproximadamente 65g)

2. Para obtener el piquerol A se procedió a una cromatografía en columna con sílica

gel como soporte y eluyendo con una fase de hexano/acetato de etilo en una proporción

2:1. Para la elección del eluyente adecuado se realizó cromatografía en capa fina con

diferentes proporciones de ambos eluyentes.

3. El seguimiento de la columna se hizo con cromatografía en capa fina y RMN 1H,

obteniendo los cristales de piquerol A.

La determinación del espectro de RMN de 1H (300MHz) se realizó en un espectrómetro

VARIAN Mercury 300 empleando cloroformo deuterado (CDCL3) como disolvente y

tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. Los desplazamientos químicos se

expresan en partes por millón (ppm) respecto a la señal de TMS. Las asignaciones de

los espectros de RMN de 1H se realizaron considerando la numeración del sistema del

pinano.

RMN 1H (300MHz): δ H-6 (1H, dc, 6.03); H-5 (1H, dd, 5.87 J =3 y 9.6); H-8 (2H, d,

5.36); H-7 (2H, d, 5.09); H-1 (1H, m, 4.61); H-4 (1H, m, 4.38); H-3 (1H, d, 2.98 J=3.6); -

OH (1H, d, 2.05 J=3 Hz); CH3 (3H, d, 1.80 J=0.3); -OH (1H, d, 1.71 J=9.3), éstos

concuerdan con lo reportado en la literatura (Romo, 1970)

El peso total de los cristales que obtuvimos de Piquerol A fue de de 195mg, que

equivale a un rendimiento del 0.039%.

6. Se determinó el punto de fusión (p.f.) de los cristales de piquerol A en un aparato

Electrothermal de capilar. P.f. del piquerol A 139.8-140.2, este dato se reporta sin

corregir y concuerda con el citado en la literatura consultada (Romo, 1970)

Fig. 2 Maceración de la hierba de San Nicolás en etanol 96º

Fig. 3. 2½ l de filtrado obtenidos de la maceración de 500g de la hierba.

Fig. 4. Evaporación del alcohol y concentración del extracto crudo de la hierba en rotavapor.

Fig. 5. Extracto crudo de la hierba de San Nicolás Fig. 6. Armado de la cromatografía en columna de sílica gel

Fig. 7. Corrida de la cromatografía en columna de sílica gel como fase

estacionaria, utilizando como eluyente hexano/acetato de etilo (2:1)

Piquerol

Fig. 8. Cromatográfia en capa fina, al lado izquierdo se observa la corrida

cromatográfica del piquerol A (referencia) y se compara con los diferentes

compuestos arrastrados por el eluyente en el proceso de aislamiento del piquerol

A encontrados en la hierba de San Nicolás.

Fig. 9. Cristal de piquerol A

5. Impacto:

Se logró establecer una estrategia para evaluar in vitro la actividad antileishmania de

compuestos y/o extractos naturales, a través del modelo in vitro por Leishmania

mexicana. Se formaron tres alumnos de posgrado y 4 de licenciatura (ya graduados),

se presentaron tres conferencias sobre nuestros avances a nivel nacional, y se

publicaron dos artículos en revistas internacionales en relación al trabajo que se realiza

por nuestro grupo de trabajo.

No se detectó actividad antileishmanicida en los compuestos evaluados en comparación

con el fármaco de elección (glucantime) sin embargo la experiecia alcanzada nos

permitirá continuar con la búsqueda de compuestos alternativos.