INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

DEPARTAMENTO DE PLANCTON Y ECOLOGÍA MARINA

INFORME FINAL

Programa de investigación: Efectos del enriquecimiento por nutrientes en sistemas costeros de la cuenca Lechuguilla-Ohuira-Navachiste, Sinaloa (FASE II)

Clave CGPI 651

Proyecto: Ecofisiología de especies productoras de toxinas del género Pseudo-nitzschia (Navachiste y Topolobampo)(FASE II)

Proyecto individual, mediano plazo, Clave CGPI 20071127

PRESENTA:

DRA. AIDA MARTINEZ LOPEZ

DIRECTORA DE PROYECTO

La Paz, B.C.S. enero de 2007.

4.1 Investigadores participantes

Número Nombre e institución Actividad específica a desarrollar 1 Aída Martínez López Director del proyecto

2 Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza(IPN)

Análisis molecular de cepas de Pseudonizchia sp., redacción de artículo

3 Christine Johanna Band Schmidt (IPN)

Aislamiento de cepas de Pseudo-nitzschia y determinación de sus tasas de crecimiento, participación en publicación de resultados

4 Jose Ricardo Palomares García (IPN)

Realización de experimentos de campo para probar toxicidad de las especies de Pseudo-nitzschia. Participación en publicación de resultados

5 Ana Elsi Ulloa Pérez (IPN)

Analisis de nutrientes y clorofilas, participación en publicaciones

Resumen

Con el propósito de describir las condiciones ambientales bajo las cuales las especies

del género Pseudo-nitzschia señaladas como potencialmente toxicas, éste proyecto

estudio los sistemas lagunares de la parte norte del litoral de Sinaloa, una región en la

cual, los ingresos de macronutrientes son controlados en parte por los aportes de los

drenes que incorporan aguas residuales de diversos orígenes a estos sistemas.

Estudios recientes sugieren que en estas lagunas existe un riesgo potencial para la

salud pública debido a gran la cantidad de especies que pueden formar Floraciones

Algales Nocivas (FAN), incluyendo a las diatomeas del género Pseudo-nitzschia. Los

datos generados entre enero de 2004 y agosto de 2007 revelan que este género es

importante en los sistemas lagunares estudiados. El análisis cualitativo del fitoplancton

usando microscopia electrónica y de luz muestran que las especies identificadas

Pseudo-nitzschia multistriata, P. pseudodelicatissima, P. fraudulenta, P. sinica, P.

pungens, P heimii, P subfraudulenta y P. australis se encuentran regularmente en el

sitio de estudio. Sus mayores abundancias, se encontraron en el orden de 6 x 106 céls

L-1 se encontraron bajo la influencia directa de las descargas de aguas residuales. Las

proliferación observadas se presentaron en condiciones de relativamente bajas

concentraciones de nitratos, relación N/F y salinidad y alta concentración de silicio.

Siete de las ocho especies encontradas son productoras potenciales de toxinas de tipo

amnésico. Sin embargo, no se identificaron eventos tóxicos en los años analizados. La

presencia de estas diatomeas potencialmente tóxicas, algunas de las cuales se

manifestaron en forma de proliferación en la zona más afectada por las descargas de

aguas residuales, implica un nuevo problema para la salud pública, resultando

necesario el monitoreo de fitoplancton, en la región costera de Sinaloa.

INTRODUCCION

El reconocimiento de que las Floraciones Algales Nocivas (FANs) se han incrementado

en los últimos años en el mundo. Uno de los géneros que producen eventos FANs es

Pseudo-nitzschia, el cual es un género que comúnmente forma proliferaciones. El

estudio de estas diatomeas toxigenicas, las cuales pueden producir eventos de

envenamiento amnesico por moluscos debido a la producción de Acido domóico, cobro

auge a finales de los 80s y principios de los 90`s, cuando ocurrieron varios eventos de

intoxicaciones y muerte de varias personas que consumieron mejillones, así como de

mamíferos marinos y aves en Canadá y en California. Posteriormente la ocurrencia de

estos eventos se ha extendido a otras regiones del mundo. No obstante la relevancia

del género Pseudo-nitzschia, hasta la fecha existe un conocimiento limitado de la

ecofisiología del mismo. Históricamente, se ha asumido que el crecimiento del

fitoplancton costero (diatomeas principalmente) está limitado por la disponibilidad de

nitrógeno, no obstante recientemente se ha reconocido que la disponibilidad de

silicatos podrían ser otro factor regulador entre otros de la respuesta fisiológica

asociada con la formación de proliferaciones. De igual forma se ha sugerido que las

condiciones limitantes de nutrientes pueden desencadenar un incremento en la

concentración de toxinas por estas diatomeas. En México de igual forma que en el

mundo, se ha reconocido el incremento de los eventos FAN`s (Morquecho et al., 2002),

incluyendo el género Pseudo-nitzschia. Este género desarrolla proliferaciones en el

Golfo de California (Alonso-Rodríguez y Ochoa, 2004). Sin embargo, las

observaciones de estos eventos son limitados por la falta de estudios en general. En

particular para la parte norte del litoral de Sinaloa, se ha documentado la ocurrencia de

un componente importante de especies potencialmente toxicas o nocivas, sobretodo a

principios de invierno-primavera. Este componente incluye a Pseudo-nitzschia, para

quien hace falta resolver la identificación de las especies que solo se han documentado

a nivel de morfotipos. Su correcta identificación requiere de técnicas especiales, como

es el caso del uso de la microscopia electrónica o de la biología molecular. Una vez

resuelto el problema de la identificación a nivel de especie, se tendrá una idea mas

precisa del riesgo potencial que existe en la zona de estudio de que ocurran eventos

tóxicos. (Anderson et al. 1990; Bates et al. 1991, Bates and Douglas 1993). Por lo

tanto, el objetivo de este proyecto fue describir las condiciones ambientales bajo las

cuales las especies del género Pseudo-nitzschia, señaladas como potencialmente

toxicas, se registraron en aguas costeras de Sinaloa

MATERIALES Y METODOS

Trabajo de campo

Se realizaron monitoreos mensuales durante enero de 2004 hasta diciembre del 2007

en 5 puntos del Sistema Lagunar Topolobampo y en dos sitios del Sistema Lagunar

Navachiste. En cada sitio se determinó in situ la temperatura, salinidad y pH mediante

un medidor de calidad de agua marca Horiba modelo U-10. En las estaciones

seleccionadas se recolectaron muestras de agua con un tubo muestreador segmentado

(TMS) descrito por Sutherland et al. (1992), modificado por Orellana et al. (1999) y

validado estadísticamente por Montiel Nieves (1998), que permite obtener un perfil

vertical de la columna de agua por segmentos. Del agua colectada por el tubo

segmentado se tomaron muestras para el análisis de nutrientes (nitratos, nitritos,

amoniaco, fósforo reactivo y silicatos) y clorofila a. Las muestras de agua se

almacenaron en hielo en un contenedor plástico y se transportaron al Laboratorio de

Análisis Ambiental del IPN-CIIDIR Sinaloa, para su posterior análisis. Adicionalmente,

de cada segmento se tomó una muestra de agua de 125 ml para la estimación de la

abundancia del fitoplancton fijándose con una solución de Lugol al 1%, a la cual

después de 24 horas se le agregó una solución de formol al 4%, neutralizado con

borato de sodio.

Análisis de laboratorio

Las muestras para la determinación de nutrientes, se analizaron de acuerdo a la

metodología y recomendaciones de Strickland y Parsons (1972). La determinación del

amoniaco se llevó a cabo inmediatamente después del muestreo siguiendo el método

de Solórzano (1969), la de los nitratos según la técnica de Morris y Riley (1963)

modificada por Grasshoff (1964). Para los nitritos se siguió el método de Shinn (1941),

aplicado al agua de mar por Bendschneider y Robinson (1952). Para el fósforo reactivo

se siguió la metodología de Murphy y Riley (1962), mientras que el silicato reactivo se

determinó de acuerdo a Riley (1963). Todas las lecturas de los nutrientes se realizaron

en un espectrofotómetro Termo Spectronic Genesys 2.

Las muestras de agua para determinar la concentración de clorofila a (Cla) fueron

filtradas con filtros de fibra de vidrio Whatman (GF/F 0.7 µm), los cuales se congelaron

a -20º C hasta efectuar la extracción del pigmento con acetona al 90% durante 24 h,

según lo recomendado por Strickland y Parsons (1972). Los cálculos de la

concentración de Cla se realizaron de acuerdo a las ecuaciones propuestas por Jeffrey

y Humprey (1975).

Fitoplancton (análisis cuantitativo)

Se realizo siguiendo el método de Utermöhl (Hasle, 1978). Para ello se tomaron 10 cm3

de la muestra los cuales se depositaron en una cámara de sedimentación con tapa de

vidrio por 24 h, con la finalidad de que todo el material que compone la muestra se

sedimente en el fondo para su posterior identificación y cuantificación. Posteriormente

se procedió a realizar el análisis, en un microscopio invertido Olympus® CK2 con

objetivos Olympus® 10x, 20, 40x y 100x, con contraste de fases.

Identificación por microscopia electrónica

Para la observación de células de Pseudo-nitzschia en el microscopio electrónico de

barrido (MEB) se el material colectado fue tratado de acuerdo con la técnica de Hasle y

Fryxell (1970) para eliminar la materia orgánica. El material limpio se filtro en

membranas nucleopore y se seco a temperatura ambiente. Posteriormente estas

membranas se montaron sobre los soportes para observar al MEB y se recubrieron con

oro para su análisis. Las identificaciones se basaron en características morfométricas

Aislamiento

Se colectaron muestras de fitoplancton vivo mensualmente mediante arrastres

verticales utilizando una red de 20 μm de luz de malla, se tamizaron a través de una

malla de 60 μm para eliminar organismos de mayor tamaño. Las células se inocularon

en 250 mL de medio f/2 modificado (Anderson et al. 1984). Las células vegetativas se

aislaron mediante la técnica de micropipeta utilizando un microscopio invertido Carl

Zeiss, se transferieronn a celdas de poliestireno conteniendo medio de cultivo y se

mantuvieron a 21 + 1°C, en un ciclo de luz-oscuridad (12:12) a 150 μEm2s1 de

intensidad luminosa. Una vez que se obtuvo una densidad adecuada se transferireron

las células a tubos de cultivo de 50 mL de capacidad con 20 mL de medio f/2.

RESULTADOS Y DISCUSION

Del análisis de la serie de observaciones entre enero de 2004 y diciembre de 2007, se

puede observar una alta variabilidad entre años (Fig. 1 y 2). De manera general se

encontraron las menores concentraciones en 2004. Temporalmente las

concentraciones de fosfatos, nitrógeno inorgánico disuelto (NID) y silicatos tienden a

incrementarse desde finales de verano a primavera, decreciendo sus valores en el

resto de los meses (Fig. 1y 2 a).

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Pseudo nitzschia

Temperatura

Células L -1x 100000

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NO2+NO3

Cl

C o

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n

(µM

)

PO4

(µM)

Clorofila a(m

g m-

3)

Tem

pera

tura

˚C

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b

c

Fig. 1 Distribución temporal de silicatos y fosfatos a); nitratos mas nitritos y clorofila b) y Pseudo-nitzschia

y temperatura c), en el Sistema Lagunar Navachiste durante 2004 a 2007. El sombreado representa los

periodos de proliferaciones de Pseudo-nitzschia.

En cuanto al género Pseudo-nitzschia, este se presentó a lo largo del año,

incrementándose desde finales de verano hasta alcanzar su valor máximo (3 x 105 céls

L-1) en invierno, asociado con incrementos de nitritos y nitratos y con valores bajos de

temperatura (Fig. 1y 2 b, c). Los valores de abundancia más altos, no coincidieron con

las concentraciones más altas de clorofila (2-18 mg m-3) (Fig. 1y 2 b, c). Pseudo-

nitzschia spp. co-ocurrió en invierno-primavera en proliferaciones mixtas junto con

dinoflagelados del género Prorocentrum. En tanto que en las proliferaciones de finales

de verano principios de otoño, Pseudo-nitzschia spp. estuvo acompañada por otros

géneros de diatomeas de talla pequeña como Cylindrotheca y Nitzschia.

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CL aPO

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(µM

)Clorofila a (m

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Células L-1x 10

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C

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Fig. 2 Distribución temporal de silicatos y fosfatos a); nitratos mas nitritos y clorofila b) y Pseudo-nitzschia y temperatura c), en el Sistema Lagunar Topolobampo durante 2004 a 2007. El sombreado representa los periodos de proliferaciones de Pseudo-nitzschia

En cuanto a los valores medios de la razón Si/F se encontró un valor promedio de 24,

el cual fue superado durante el periodo de de invierno primavera, destacándose los

valores entre 2005 y 2006, cuando alcanzaron el valor máximo de 87. Con base en

Dortch & Whitledge (1992) y Justic et al. (1995), los valores de la razón Si/N �20

implican condiciones limitantes por fosforo para el crecimiento del fitoplancton (Fig.3).

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Fig. 3 Razones de Si/PO4 durante el periodo enero de 2004 a diciembre de 2007 en Sistema Lagunar

Navachiste. El sombreado representa los periodos de proliferaciones de Pseudo-nitzschia.

Este hecho es relevante dado que en general no se presenta limitación por fosforo en

ambientes marinos. Esta condición puede estar ligada con el proceso de eutrofización,

desencadenado en la zona.

En tanto que limitación por silicio, solo se observo durante el periodo de agosto a

octubre de 2006 (Fig. 4).

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Si/N

ID

Fig. 4 Razones de Si/NID durante el periodo enero de 2004 a diciembre de 2007 en Sistema Lagunar

Navachiste.

El género de diatomeas Pseudo-nitzschia estudiado en este proyecto es

potencialmente toxico es común dentro del Golfo de California, comúnmente forma

proliferaciones mixtas en combinación con otras diatomeas como el género

Chaetoceros. Durante los eventos observados entre 2004 y 2007, no se encontró

evidencia de toxicidad. Sin embargo, Pseudo-nitzschia debe de considerarse y

observarse como un género potencialmente productor de toxinas amnésicas.

Las especies identificadas hasta el momento son 8 e incluyen a Pseudo-nitzschia

multistriata, P. pseudodelicatissima, P. fraudulenta, P. sinica, P. pungens, P heimii, P

subfraudulenta y P. australis. Siete de estas han sido reportadas como productoras de

envenenamiento de tipo amnésico debido a la producción de Acido domóico. Debido a

la dificultad para identificarlas es necesario combinar observaciones al microscopio de

luz y de microscopia electrónica de barrido y de transmisión. Las láminas 1 y 2 ilustran

un par de las 8 especies identificadas.

Lámina 1. Pseudo-nitzschia fraudulenta; observaciones con microscopio

electrónico de barrido (1) y con microscopio de luz (2 y 3)

Lámina 1. Pseudo-nitzschia pungens; observaciones con microscopio

electrónico de barrido (1) y con microscopio de luz (2)

Varios estudios siguieren que las proliferaciones de Pseudo-nitzschia podrían estar

relacionadas con agua enriquecida proveniente de eventos de surgencia o bien con los

escurrimientos de agua enriquecida posteriores a periodos de lluvias intensas. En los

sistemas lagunares del litoral norte de Sinaloa, las temperaturas registradas durante la

proliferación de Pseudo-nitzschia estuvieron cercanas al mínimo anual, durante un

periodo de incremento de silicio y fosfatos. El inicio de las proliferaciones ocurrió

durante la temporada de secas de la región, de tal forma que las lluvias no tienen

relación con estos eventos. Por el contrario, las prácticas agrícolas de la región aledaña

a estos cuerpos de agua costeros, descargan el excedente del agua de riego

(enriquecida) durante este periodo. Por lo que el agua enriquecida proveniente de esta

actividad parece ser más probable que contribuya a la formación de las proliferaciones

de Pseudo-nitzschia.

La mayor entrada de N y PO4 provenientes del valle Agrícola podrían llevar a un

enriquecimiento de estos micronutrientes en comparación al Silicio. Dentro de este

género existen especies que tienen la habilidad de crecer y competir con otros

fitoplánctontes a bajas concentraciones de silicio relativas al nitrógeno. Asimismo son

capaces de crecer en ambientes ricos en amonio como es el caso de las lagunas

estudiadas, en donde el amonio es la principal forma nitrogenada inorgánica (Martínez

et al., 2007). Esta capacidad le confiere una relevancia a la presencia de estas

especies potencialmente toxicas, en estas lagunas costeras ya que, representan un

riesgo potencial y justifica el que se continúe su monitoreo.

IMPACTO

En diversas partes del mundo se ha establecido que el avance en el deterioro de los

ambientes costeros conlleva inevitablemente problemas ambientales, que afectan a las

comunidades asentadas en sus márgenes y a las actividades económicas que

dependen de estos cuerpos de agua, como la pesca o la acuacultura. El proponer

medidas de manejo requiere del conocimiento amplio de la problemática integral que

presentan estas áreas, y una de ellas sin duda, tiene que ver con entender como está

respondiendo la base de la cadena alimentaria (fitoplancton), a las alteraciones

provocadas por las descargas de aguas residuales. Este proyecto ha sido exitoso en

reconocer que el periodo del año asociado con el inicio de las actividades agrícolas es

potencialmente riesgoso, debido a la proliferación de las especies de Pseudo-nitzschia.

La presencia de este género implica un riesgo potencial para la salud humana, debido

a que durante la eventualidad de un evento toxico, es posible observar concentración

de toxinas en diferentes recursos marinos que son consumidos por el hombre. El

encontrar la asociación entre la actividad agrícola y los incrementos en estas especies

es un elemento mas que puede ser usado como criterio para implementar medidas de

manejo para estos cuerpos de agua.

ANEXOS Los comprobantes de las actividades se enviaran en papel posteriormente