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Informe Proyecto SIP20070141
Dra. Claudia Guadalupe Benítez Cardoza
Caracterización estructural de los intermediarios de la ruta de
desnaturalización de la enzima glucolítica triosa fosfato isomerasa de
Trypanosoma cruzi. Evaluación de la presencia de un intermediario de tipo
glóbulo fundido.
RESUMEN
Las enfermedades parasitarias son un problema muy importante en la salud
pública. El Trypasonoma cruzi, es un protozoario que provoca la Enfermedad de
Chagas teniendo una alta prevalecía en América Latina principalmente, esta
enfermedad actualmente es incurable y mortal Se ha descrito que las enzimas
glucolíticas son un blanco posible para dirigir un fármaco e inhibirlas
selectivamente sin comprometer la integridad del huésped; en particular, la
triosafosfato isomerasa (TIM) es un blanco muy atractivo. La TIM presenta un
plegamiento de barril TIM, un barril interno de 8 hebras-β interconectadas por
loops a 8 hélices-α, el plegamiento es altamente conservado así como el número
de aminoácidos, siendo 250 en promedio. En este informe se conjuntan los
resultados del desplegamiento por aumento en la temperatura de la TIM de
Trypansoma cruzi (TcTIM), El proceso se siguió por técnicas espectroscópicas
como Dicroísmo circular (DC) y Fluorescencia tanto intrinseca como de ANS, para
identificar la presencia de posibles intermediarios de tipo glóbulo fundido; para con
ello proponer un posible mecanismo de desplegamiento describiéndolo
energéticamente. En los experimentos del desplegamiento térmico de la TcTIM
seguido por dos técnicas espectroscópicas diferentes han demostrado que el
proceso se lleva, al menos, en tres fases y es irreversible y el proceso es
dependiente de la temperatura. En la primera fase, se observan cambios en la
estructura terciaria sin involucrar cambios en la estructura secundaria, es decir se
observa un intermediario que se puede describir como un glóbulo fundido; las dos
siguientes fases involucran cambios en la estructura terciaria acompañados por
cambios en la estructura secundaria, el proceso final implica también una
agregación de la proteína. La agregación de la muestra podría originar la
irreversibilidad del proceso. Con los valores promedio de ∆H≠ se construyó el
esquema del posible mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM, donde
se muestran las barreras energéticas calculadas para las tres fases encontradas
INTRODUCCION
Las proteínas, para ser funcionales, deben tener un plegamiento único. El
plegamiento correcto de proteínas depende de muchos factores como el pH,
concentración de iones, la presencia de algunas otras proteínas entre otros
factores externos así como, de manera principal, de la secuencia y naturaleza de
los aminoácidos que la conforman. Existen factores que favorecen tanto el
plegamiento como el desplegamiento de las proteínas. Algunos de los factores
que promueven el desplegamiento son: cambios de temperatura, del pH, de
presión y algunos agentes químicos como la urea o el cloruro de guanidinio. Al
variar la concentración de estos agentes químicos o al variar el valor de la
temperatura se induce el desplegamiento de una proteína y al seguir una
propiedad observable por métodos espectroscópicos o biofisicoquímicos se puede
conocer el mecanismo de desplegamiento. Las técnicas mías comunes para
seguir el desplegamiento de una proteína son seguir el cambio en la elipticidad por
Dicroísmo Circular en el UV lejano (DC), que cuantifica el contenido de estructura
secundaria regular de la proteína (α hélices y β plegadas) o cambios en la señal
de fluorescencia intrínseca. Esto da una medida del cambio en el entorno
hidrofóbico en los residuos aromáticos, principalmente de los triptofanos [1-4]. La
técnica del DC se basa en generar dos haces de luz circularmente polarizada, un
haz que gira a la derecha y otro a la izquierda, los cuales al interaccionar con los
planos formados por los enlaces peptídicos, son desviados generando un cambio
en la elipticidad. Cuando cambiamos el ambiente de la proteína, existirían cambios
en la estructura secundaria que se detectarían como cambios de la elipticidad.
También se puede seguir el desplegamiento de las proteínas siguiendo los
cambios en la señal de fluorescencia. Los aminoácidos aromáticos, que tienen
propiedades hidrofóbicas, presentan una fluorescencia intrínseca en la proteína
plegada, y al ser hidrofóbicos, se mantienen ocultos del disolvente acuoso.
Cuando existen cambios, debido al desplegamiento, los residuos aromáticos (F,
W, Y) se pueden exponer mas al disolvente cambiando su señal de fluorescencia,
en el caso de un medio acuoso, la longitud de onda de emisión se recorrerá a
valores mayores con respecto a los aminoácidos no expuestos. Los estudios de
estabilidad térmica de las proteínas tienen una gran relevancia para la generación
de información que nos permitan inferir el posible mecanismo de plegamiento de
una proteína y las variables de las cuales depende el proceso. El manejo de los
datos con herramientas fisicoquímicas generan información termodinámica y
cinética que permitirán proponer un mecanismo de desplegamiento desde el punto
de vista energético. Si las condiciones de reversibilidad del proceso de
desplegamiento son determinadas, el sistema podría tratarse como un sistema en
equilibrio obteniendo valores como: los cambios de energía libre de Gibbs
asociado al proceso (∆G). En el caso que no se encuentre reversibilidad en el
proceso los valores termodinámicos se denominarían aparentes. Además, para
procesos irreversibles si se obtienen datos experimentales de la cinética del
desplegamiento a diferentes temperaturas y se analizan utilizando la teoría del
estado de transición, es posible caracterizar energéticamente al estado de
transición (‡) y obtener valores del cambio de la entalpía de activación (∆H‡) que
caracterizan a la reacción. Mediante la recopilación de información, por el uso de
las técnicas antes descritas, es posible inferir los cambios estructurales que
suceden en el desplegamiento. Así mismo, se pueden identificar posibles
intermediarios en la ruta de desplegamiento. Uno de esos intermediarios es el
denominado glóbulo fundido; que aparece en los primeros estadios del
plegamiento proteico y que se caracteriza por poseer un grado elevado de
estructura secundaria pero que ha perdido la mayor parte de sus contactos
terciarios. Para determinar si un intermediario es de tipo glóbulo fundido
generalmente se utiliza el colorante ácido 8-anilino-naftaleno sulfónico (ANS). Este
colorante presenta una aumento en su emisión de fluorescencia en presencia de
ambientes hidrofóbicos. Dado que un intermediario de tipo glóbulo fundido expone
regiones hidrofobicas que estaban ocultas al solvente en el estado nativo y esas
regione sinteraccion con el ANS, aumentando este ultimo su emision de
fluorescencia. Con esto se puede proponer un mecanismo de plegamiento. Los
experimentos de desplegamiento térmico darán información de los factores que
dictan el plegamiento de una proteína para proponer la síntesis racional de
proteínas que tengan funciones determinadas o el desarrollo de fármacos que
permitan el cambio en la actividad de una proteína para combatir enfermedades.
En este proyecto se evaluó el mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM
por dos técnicas espectroscópicas, por Dicroísmo circular en el UV lejano, así
como por fluorescencia intrínseca de la proteína.
MÉTODOS Y MATERIALES
TcTIM
En este trabajo se utilizó la triosafosfato isomerasa recombinante de Trypanosoma
cruzi que se purificó siguiendo el protocolo descrito por Ostoa- Saloma y
colaboradores [5]. Una al´ıcuota de la rTcTIM fue donada por la IBI Liliana Vargas
y por el Dr. Arturo Rojo Domínguez del laboratorio de Biofisicoquímica de la UAM-
I. Todos los experimentos (a menos que se indique lo contrario) se realizaron en
soluci´on amortiguadora de fosfatos 50 mM a un pH de 7.4 a 25°C a una
concentraci´on final de prote´ına de 10 µg/mL. El agua utilizada en todos los
experimentos es agua bidestilada y desionizada. Todos los reactivos utilizados
son grado anal´ıtico y fueron adquiridos en Sigma y/o J.T. Baker
Fluorescencia intrínseca
Los experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro
PC1 de ISS (Champaign, IL). Este instrumento está equipado con un porta celdas
tipo Peltier para el control de la temperatura. A menos que se especifique lo
contrario, todos los experimentos fueron obtenidos en celdas de 1 cm de recorrido
óptico. La longitud de onda de excitación fue de 280nm. El espectro de emisión
fue obtenido en el intervalo de 300 nm a 400 nm. La longitud de onda registrada
para las cinéticas de desplegamiento térmico fue de 320 nm. La cinética de
desnaturalización de la TIM se estudió por medio de cambios en la señal de
fluorescencia a 320 nm a distintas temperaturas. Una celda de 1.0cm. de recorrido
óptico, que contenía solución amortiguadora de fosfatos, la que previamente se
llevó a equilibrio térmico con la temperatura del experimento, se le inyectó el
volumen suficiente de la solución concentrada de TcTIM para alcanzar la
concentración deseada (10µg/mL). En todos los casos se cuidó que el volumen
adicionado de proteína concentrada fuera menor al 1% del volumen final, esto
para no alterar la temperatura del experimento. Las muestras se homogeneizaron
con un agitador magnético a 550rpm para que el mezclado y equilibrio térmico se
alcanzaran de forma rápida y por completo. Inmediatamente después de añadida
la muestra, se inició la medición de los cambios en la emisión de fluorescencia.
Bajo estas condiciones el tiempo muerto de los experimentos fue menor a 10
segundos. Los datos cinéticos se ajustaron a una ecuación de decaimiento
exponencial.
Fluorescencia de ANS
Para la determinación de la fluoresncia de ANS se empleo una longitud de onda
de excitación fue de 380nm. El espectro de emisión fue obtenido en el intervalo de
400 nm a 600 nm. La longitud de onda registrada para las cinéticas de
desplegamiento térmico fue de 497 nm. La concentración de ANS fue 40µM.
Tratamiento de los datos
Con el antecedente de que el proceso no es reversible [4], se procede a realizar
cinéticas de desplegamiento para poder describir el proceso con datos cinéticos.
La cinética química explica el trayecto que toma un proceso químico, como
cambian las concentraciones de las especies químicas involucradas en dicho
proceso con respecto al tiempo. A estos procesos no se les asocia una constante
de equilibrio porque tal no existe, pero se les pueden asociar una constante de
velocidad de reacción que es dependiente de la temperatura y de la naturaleza de
las especies involucradas. Algo que se debe considerar es que los datos cinéticos
no pueden determinar sin ambigüedad el mecanismo por el cual un proceso
ocurre, pero si puede discriminar los procesos por los cuales no se efectúa cuando
los datos ajustados no concuerden con los experimentales. El plegamiento y
desplegamiento de una proteína se describe en términos de ecuaciones de primer
orden ya que son procesos intramoleculares. Sin embargo otros procesos donde
intervienen multímeros pueden ser descritos por otro tipo de ecuaciones cinéticas
de orden superior [6]. Asumiendo que la muestra es exclusivamente proteína
nativa y al someterla a un proceso de desnaturalización térmica por aumento de
temperatura, se inducirá el desplegamiento. Así entonces se genera una colección
de especies diferentes con propiedades que cambian con respecto al tiempo. La
reacción química que describe el proceso de desplegamiento es:
Donde N es la especie nativa y D es la especie desplegada, N‡ es el estado de
transición, k1, k−1 y k2 son las constantes de velocidad. La especie química N
absorbe energía, en el caso del desplegamiento térmico un aumento en la
temperatura, para llegar a un estado de alta energía, N‡, conocido como estado de
transición o complejo activado. Este complejo activado tiene dos opciones:
que libere la energía absorbida, disipándola al medio y regrese a la conformación
inicial que la energía absorbida genere cambios estructurales que le permitan
transformarse en el producto Las ecuaciones de Arrhenius y de Eyring describen
la dependencia de la velocidad de reacción con respecto a la temperatura (T). A
diferencia de la ecuación de Arrhenius, la ecuación de Eyring puede aplicarse a
sistemas gaseosos, condensados o reacciones en fases mezcladas. La ecuación
de Eyring se basa en la construcción teórica basada en el modelo del estado de
transición. Los cambios en la concentración del complejo activado N‡ en el tiempo
(t), de acuerdo con la siguiente se puede describir como:
Debido al equilibro que puede existir en la primera parte del proceso,
se cancelan, por lo que:
Por la mecánica estadística, a k2 se le define como:
Donde kB es la constante de Boltzmann [1.381 x 10−23J · K−1] y h es la constante
de Plank [6.626 x 10−34J · s]. A k2 se le conoce como la constante universal del
estado de transición y tiene un valor de 6 x 10−12s−1 a 25°C
Por otro lado [N‡] se deriva del estado quasi-estacionario entre N‡, N y D.
donde K‡ es la constante de equilibrio termodinámico
Sustituyendo las últimas dos ecuaciones
k de todo el proceso se define como:
Por otro lado, una definición termodinámica indica que:
De igual forma ∆G‡ se define como:
Donde el ∆G‡ es la energía libre de activación, ∆S‡ es la entropía de activación y
∆H‡ es la entalpía de activación del proceso. Combinando las últimas ecuaciones
se obtiene:
Sustituyendo y haciendo rearreglos de las ecuaciones se genera:
La ultima ecuación se conoce como la ecuación de Eyring, indica que al graficar el
ln k T contra 1/T se obtiene una línea recta con pendiente ∆H‡/R. De esta forma
se puede el valor de la entalpía de activación del proceso de desplegamiento
térmico. De esta forma, al obtener las cinéticas de desplegamiento térmico a
diferentes temperaturas, se tendría una colección de datos que puede ser ajustada
a una ecuación de decaimiento exponencial.
donde A es la amplitud de cada fase, y ki es la constante de velocidad asociada a
cada proceso, indica con que rapidez un reactivo se transforma en producto. Los
valores que se pueden obtener con los resultados obtenidos nos permitirán
describir un proceso químico desde el punto de vista energético. De este modo se
puede obtener un conjunto de valores de k a distintas temperaturas y con su
dependencia se puede conocer el valor del ∆H‡. Con esto se describe la
energética del estado de transición. En este caso el estado de
transición de la reacción de desplegamiento térmico de la TcTIM.
RESULTADOS
Cambios en el entorno hidrofóbico de los triptofanos determinados por
fluorescencia
Se realizaron experimentos cinéticos, determinando el cambio de la señal de
fluorescencia en el tiempo a distintas temperaturas (50°C, 54°C, 57°C, 60°C y
64°C). Los datos se presentan el la Fig. 1
Figura.1: Cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM seguidas por el cambio en la señal
de fluorescencia. Se presentan dos graficas, en el panel izquierdo se observa el
comportamiento del mecanismo de desplegamiento térmico a temperaturas menores a 60 °C
y en el panel derecho se muestra el comportamiento del mecanismo a temperaturas
mayores a 60 °C. Los experimentos se realizaron a una longitud de onda de excitación de
280 nm y el registró de la emisión de fluorescencia fue a una longitud de onda de emisión de
320 nm.
En la gráfica 1 se presentan los datos de cambios en la señal de fluorescencia a
diferentes temperaturas. Podemos observar que el proceso tiene dos
comportamientos diferentes. A temperatura baja (por debajo de los 60°C), se
pueden apreciar dos fases de decaimiento exponencial de la señal de
fluorescencia. Las curvas se ajustaron a una ecuación de decaimiento
exponencial doble (con dos factores exponenciales). A temperatura alta (por arriba
de los 60°C), se observa en la parte inicial un ligero incremento en la señal de
fluorescencia seguida por una disminución. En este caso fue necesario utilizar una
ecuación con tres factores exponenciales. El cambio de la forma de las curvas
cinéticas a distintas temperaturas podría indicar diferencias entre los mecanismo.
Los ajustes a dos o tres fases exponenciales permitieron obtener las constantes
de velocidad reportadas en el cuadro 1.
Cuadro 1: Cuadro de los valores de k para cada una de las fases del
desplegamiento térmico de la TcTIM siguiendo los cambios en la señal de
fluorescencia
Figura.2: Cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM seguidas por el cambio en la señal
de fluorescencia de ANS. Se presentan dos graficas, en el panel izquierdo se observa el
comportamiento del mecanismo de desplegamiento térmico a temperaturas menores a 60 °C
y en el panel derecho se muestra el comportamiento del mecanismo a temperaturas
mayores a 60 °C. Los experimentos se realizaron a una longitud de onda de excitación de
380 nm y el registró de la emisión de fluorescencia fue a una longitud de onda de emisión de
497 nm.
Con las constantes de velocidad del cuadro 1 se realizó el grafico de Eyring (Fig.
3). En este grafico se presentan los datos cinéticos obtenidos en un proyecto
anterior, se presentan os datos de Dicroísmos circular, fluorescencia intrínseca y
extrínseca
Figura 3: Grafico de Eyring mostrando la dependencia lineal de las k con respecto a la
Temperatura y el ajuste lineal utilizando la ecuación de Eyring. DC1 y DC2, datos obtenidos
mediante la técnica de Dicroísmo circular que refleja los cambios de estructura secundaria. FL3 y
FL4 representan los datos obtenidos para las etapas mas rápidas observadas por fluorescencia
intrínseca FL5 corresponde a los daros de fluorescencia extrínseca.
En el grafico de Eyring se observa que las constantes de velocidad (k1) de la
primera fase de los experimentos realizados a las temperaturas mas bajas,
seguidos por los cambios en la señal de fluorescencia de ANS, es decir la señal
que registra la aparición de un intermediario de tipo glóbulo fundido, siguen una
tendencia lineal. Esto permitió calcular la pendiente de la recta y a partir de ella un
valor de ∆H‡= 570 ± 80 kJ/mol. De manera similar, las constantes k2 y k3 siguen un
comportamiento también lineal. Al graficar los datos obtenidos por DC,
conjuntamente con los de fluorescencia se observa que la fase descrita por k2 de
fluorescencia coincide con la fase más rápida observada en DC. Esto indica que
se podría tratar del mismo proceso observado por las dos técnicas
espectroscópicas. De la pendiente de este conjuntos de puntos se obtiene un
∆H‡= 415 ± 30 kJ/mol. Finalmente las constantes k3, que corresponden a la fase
mas lenta observada en las cinéticas de temperatura más alta seguidas por la
técnica de fluorescencia, siguen de igual modo una tendencia lineal con el inverso
de la temperatura en el grafico de Eyring. De manera interesante, los puntos
coinciden con la reacción mas lenta, observada por DC (Fig.3). Esto podría indicar
que la estructura secundaria y terciaria de la proteína cambian de manera
concertada, es decir al mismo tiempo. Del ajuste lineal de estos puntos se obtuvo
un valor de ∆H‡= 270 ± 60 kJ/mol.
Mecanismo de desplegamiento térmico de la Tc-TIM
En los experimentos del desplegamiento térmico de la TcTIM seguido por dos
técnicas espectroscópicas diferentes han demostrado que el proceso ocurre al
menos, en tres fases y es irreversible. En la primera fase, se observan cambios en
la estructura terciaria sin involucrar cambios en la estructura secundaria, lo que
corresponde a la obtención de un intermediario en la ruta de plegamiento de tipo
glóbulo fundido; las dos siguientes fases involucran cambios en la estructura
terciaria acompañados por cambios en la estructura secundaria, el proceso final
implica también la agregación de la proteína. La agregación de la muestra podría
originar la irreversibilidad del proceso. A partir de los valores promedio de ∆H‡ se
construyó el esquema del posible mecanismo de desplegamiento térmico de la
TcTIM. En el se muestran las barreras energéticas calculadas para las tres fases
encontradas. Los valores promedio de los ∆H‡ se concentran en el cuadro 2.:
Cuadro 2. Promedio de los valores de ∆H‡ (kJ/mol) de los tres procesos del
desplegamiento térmico de la TcTIM
Cambios en estructura 3ª, asociados a la aparición de un intermediario de tipo
glóbulo fundido. Cambios en estructura 2a y 3a Cambios en estructura 2a y 3ª En
la Fig. 4 se presenta el gráfico de coordenada de reacción del mecanismo de
desplegamiento térmico de la TcTIM. El mecanismo aquí propuesto difiere con lo
reportado para el desplegamiento inducido por GuHCl de TcTIM [8]. Se reporta un
mecanismo completamente reversible con dos intermediarios estables diméricos
Estas diferencias podrían deberse a que el GuHCl y la temperatura tienen efectos
distintos en la conformación. El GuHCl solubiliza todas las partes constituyentes
de toda la proteína, tanto la cadena principal como sus cadenas laterales,
hidrofóbicas e hidrofílicas, exponiéndolas al disolvente acuoso. Por otro lado, el
incremento de la temperatura ocasiona un aumento en la energía cinética de las
moléculas, induciendo cambio en los modos vibracionales de la molécula,
originando rearreglos de puentes de hidrógeno tanto del disolvente acuoso con la
proteína como de la misma estructura interna de la proteína induciendo cambios
conformacionales.
Figura 4: Grafico de coordenada de reacción para el desplegamiento térmico de la TcTIM.
Esta gráfica muestra el mecanismo de desplegamiento térmico planteado según los datos
obtenidos por fluorescencia en este trabajo.
Además se ha observado que los estados desplegados obtenidos por GuHCl y por
incremento de la temperatura son diferentes. En el primer caso, concentraciones
altas de GuHCl originan un estado desplegado completamente extendido que
prácticamente no conserva estructura secundaria. Por el contrario, el aumento de
temperatura genera un estado desplegado final que podría presentar estructura
secundaria residual. Se ha observado que esta estructura secundaria resiudal, es
la misma observada en todas las proteínas desplegadas térmicamente [1], [9-10].
El mecanismo de desplegamiento de la TcTIM también se presenta distinto a lo
reportado para la yTIM donde se encontró un mecanismo reversible donde el
desplegamiento va acompañado de la disociación del dímero ; con
valores de ∆H‡= 480 kJ/mol. Estas diferencias podrían explicar la observación
empírica de que la TcTIM es más susceptible al almacenamiento que las TIM’s de
otras especies biológicas.
Todo lo anterior parece indicar que para la TIM de distintas fuentes, hasta el
momento, no es posible generalizar un mecanismo de plegamiento/
desplegamiento. Esto incluso se observa para la TcTIM en distintas condiciones
de medición del mecanismo de desplegamiento.
IMPACTO
En este informe se presentaron los resultados correspondientes a los objetivos de
la caracterización del mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM. De
este modo se obtuvieron las cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM
siguiendo los cambios de la señal de fluorescencia. Los datos se trataron con la
teoría del estado de transición y se obtuvieron los parámetros cinéticos
correspondientes. El desplegamiento térmico de la TcTIM seguido por dos
técnicas espectroscópicas generan las siguientes conclusiones:
1. El proceso de desplegamiento térmico de la TcTIM, es un proceso irreversible,
además se evidencia la presencia de agregados de la conformación desplegada.
2. El desplegamiento térmico involucra al menos 3 fases. a) Una fase muy rápida,
detectada únicamente por fluorescencia de ANS, de cambios de la estructura
terciaria. El estado que se alcanza en estas condiciones experimentales se puede
describir como un intermediario de tipo glóbulo fundido b) Dos fases posteriores
de cambios de la estructura secundaria, simultáneas cada una con cambios en la
estructura terciaria.
3. Las constantes de velocidad, k, muestran una dependencia lineal con respecto
a la Temperatura. Esto permitió calcular los valores de ∆H‡ de los 3 procesos.
4. Proponemos un posible mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM,
ilustrado en la Fig. 4.
Esto contribuye de manera importante al conocimiento de la estabilidad de la
enzima, y esta información puede usarse como complemento a la información
sobre su in activación para el diseño racional de fármacos contra el parasito
Trypansoma cruzi
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