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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, ANTI MUTAGENICA Y
ANTICARCINOGÉNICA DE HETERANTINA Y DITAXINA PRESENTE EN LAS SEMILLAS
DE AZAFRAN DE BOLITA (Ditaxis heterantha Zucc)
INFORME TÉCNICO FINAL
DRA. MARIA EUGENIA JARAMILLO FLORES.
México DF. Enero 2008
Índice
CONTENIDO
Página
INDICE DE CUADROS ………………………………………………………… iii
INDICE DE FIGURAS…………………………………………………………... iv
I. Introducción……………………………………………………………….. 1
1.1 Carotenoides
1.2. Azafran de Bolita
II. Justificación
III. Objetivos
3.1 Objetivo General
3.2 Objetivo particulares
IV. Materiales y Métodos
4.1 Materiales
4.1.1 Material vegetal
4.1.2 Reactivos
4.1.3 Equipo
4.2 Métodos
4.2.1 Extracción del pigmento
4.2.2 Separación cromatográfica
2
V. Desarrollo experimental
5.1. Determinación de la actividad de antioxidante
5.1.1. Actividad antioxidante mediante DPPH·
5.1.2. Actividad antioxidante mediante ß-carotene
5.1.3. Actividad antioxidante mediante ABTS·
5.2. Determinación de la capacidad antimutagénica
5.3. Determinación de la capacidad anticarcinogénica
5.3.1. Viabilidad
5.3.1.1. Viabilidad empleando MTT
5.3.1.2. Viabilidad empleando Rojo Neutro
53.1.3. Viabilidad empleando Azul Trifán
5.3.2. Apoptosis
5.4. Determinación Biodisponibilidad
VI. Resultados y Discusión
6.1. Resultados
6.1.1. Capacidad de antioxidante
6.1.2. Capacidad antimutagénica
6.1.3. Capacidad anticarcinogénica
7.2. Discusión
VII. Conclusiónes
VIII. Bibliografia
I. Introducción
3
1.1 Carotenoides
Los carotenoides son una clase de compuestos hidrocarbonados denominados en general
carotenos (C40H56) y sus derivados oxigenados, las xantofilas. Dentro de estas últimas son
comunes los grupos hidroxi (OH), particularmente en las posiciones 3 ó 4. Muchos carotenoides
poseen un grupo epoxi y oxi, usualmente en las posiciones 5-6 y 5-8, a menudo esterificados.
Carotenoides son pigmentos liposolubles, cuya molécula está formada por ocho unidades de
isopreno (Figura 1). Estructuralmente la mayoría presenta un esqueleto de 40 átomos de carbono
y 9 dobles enlaces conjugados.
Figura 1. Estructura básica de Carotenoides
Los carotenoides se encuentran casi por todas partes de la naturaleza, y son responsables de
muchos de los colores amarillos y rojo de los productos vegetales y animales. Los animales son
incapaces de sintetizarlos, por lo que los obtienen a tráves de su alimentación (Rodriguez-
Amaya,1999).
La hidroxilación de γ-caroteno da como resultado la formación de rubixantina (monohidroxi) la
hidroxilación de licopeno de licoxantina (monohidroxi) y licofilina (dihidroxi).
Otros ejemplos clásicos de carotenoides únicos son la bixina, pigmento mayoritario del annato,
colorante de alimentos, y crocetina, el principal compuesto del azafrán. Los carotenoides existen
en forma libre disueltos en el fracción lipídica del tejido vegetal, formando complejos con
4
proteínas, ó unidos a carbohidratos mediante un enlace glucosídico o como ésteres de ácidos
grasos (Badui,1993).
La formación de carotenoides puede ser resultado de mecanismos no específicos como por
oxidación por lipoxigenasa y fotooxidación, también como mecanismos específicos donde
dioxigenasas particulares operan en la formación de compuestos tales como vitamina A (Von
Lintig et al, 2000), ácido absícico (Schwartz et al, 1997), compuestos aromáticos (Enzell et al,
1985) y pigmentos (Winterhalter et al, 2000), y los productos de oxidación de carotenoides
tienen potencialmente efectos biológicos sobre la salud humana (Zhang, et al., 2003).
Éstos pigmentos le confieren varias funciones en las plantas, como impartir color en flores,
frutas y bacterias; compuestos auxiliares en fotosíntesis, protegiendo del daño causado por la
radiación visible a las células, actúa como precursor de vitamina A, adicionalmente juega un
importante papel como protector biológico contra la formación y la acción de los radicales libres,
y el ß-caroteno se usa para el tratamiento de las personas que tienen un hipersensibilidad a la luz.
Se tienen evidencias de su efecto estimulante sobre el sistema de inmunólogico (Britton, 1996;
Gross, 1991).
La bixina se encuentra en la cáscara de las semillas de Bixa orellana, y es el producto de la
ruptura de la molécula de licopeno (Bouvier et al, 2003a). Similarmente, la crocetina es un
apocarotenoide que se produce de la ruptura de la zeaxantina, carotenoide que se encuentra en
los pistilos de Crocus sativus (Bouvier et al, 2003b). Sobre las bases de una extensa observación
epidemiológica, las frutas y vegetales ricas en carotenoides, se piensa que proporcionan
beneficios a la salud disminuyendo el riesgo de padecer diversas enfermedades, particularmente
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ciertos tipos de cáncer (Abdullaev et al, 2004; Molnar et al, 2005; Krinsky et al, 2005). En
parte, los efectos benéficos de los carotenoides se cree es debido a su papel como antioxidantes.
Se ha demostrado que la inducción de radicales oxígeno se relaciona claramente con eventos
genotóxicos. Básicamente el daño al DNA en las células es crítico para la quimioprevención de
la carcinogénesis y diversos reportes sugieren que los carotenoides pueden modificar el daño
oxidativo al ADN (Palozza, P. 2005). Consecuentemente, una disminución del daño al AND,
bajo la intervención de carotenoides, puede interpretarse como una disminución en el riesgo de
enfermedades crónicas. Adicionalmente, diversas investigaciones indican que los carotenoides
pueden alterar la apoptosis por un mecanismo REDOX (Palozza, P. 2005).
La espectroscopía UV-VIS es uno de las herramientas básicas que se usan como primer criterio
de identificación de carotenoides. El cromóforo o parte estructural responsable para la absorción
de luz, es el sistema conjugado de doble enlaces. En una determinada región del espectro, el
punto de máxima absorción es afectado por la longitud del cromóforo y la posición de los
dobles enlaces de estas substancias, principalmente en la región azul (430-470 nm) pero también
en el azul-verde (470-500 nm) y en el verde (500-530 nm), para todos los compuestos se
presenta un espectro típico de tres picos. El disolvente usado afecta directamente a la posición
del punto de máxima absorción (Gross, 1991). El espectro de carotenoides está entre 400 y 500
nm, con un prominente pico alrededor en 450 nm y otros dos son más pequeños, uno en cada
lado, (Harborne,1973).
1.2 “Azafrán de bolita” (Ditaxis heterantha)
El "Azafrán de la bolita" (Ditaxis heterantha Zucc) es una planta que pertenece a la familia de
las Euphorbiaceas (Martinez, 1990).
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Clasificación taxonómica (Van Welzen, 1999; Walters, 1996):
División: Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Rosidae
Orden : Euphorbiales
Familia : Euphorbiaceae
Tribu : Crozophoreae
Subtribu : Ditaxinas
Género : Ditaxis
Subgénero : Ditaxis
Especie : heterantha
Es una planta endémica de México, crece en regiones semiáridas, distribuyéndose en estados del
centro y del occidente de México: Querétaro, Jalisco, Sinaloa, Guerrero, Guanajuato, Hidalgo,
Michoacan, Guerrero y San Luis Potosi (Martinez, 1979). La germinación de semillas en el
norte de Jalisco es relativamente fácil, sobre todo cuando esta práctica se realiza durante el
ciclo primavera-verano.
Esta especie es un arbusto de hojas alternas con alturas que van de 2,5 a 3 m. El fruto es una
cápsula dehiscente de tres cavidades abultadas en forma de costillas que alberguen a las semillas
que tiene un pedicelo de 4 a 5 cm de largo; su cáscara es dura, color verde oscuro y en la
madurez es notoria la porción central amarilla. Localmente el nombre es conocido como
"Azafran", "Azafrancillo" o "Azafran de bolita" (Arana-Sedano, 2004).
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El endospermo de la semilla de Azafrán de bolita contiene un pigmento amarillo atractivo,
utilizado para colorear y sazonar alimentos en la cocina tradicional de las comunidades nativas
del Estado de Jalisco (Lugo et al. 2000).
Arana y Sedano, 2004 encontraron, que la semilla del azafrán de bolita contiene factores
antinutritivos: taninos, saponinas, fitatos, glucósidos- cianogénicos y lectinas, también contiene
esteres de forbol, pero estos compuestos podrían ser eliminados por tratamiento térmico.
Méndez-Robles et al. 2004 extrajo y caracterizó el pigmento del endospermo. Los pigmentos
pertenecen a la familia de los carotenoides, con 7 fracciones que correspondes a 7 diferentes
compuestos de los cuales 2 fueron estruturalmente caracterizados.
Muchos de los antioxidantes naturales, exhiben una amplia gama de efectos biológicos incluso
el antibacteriano, antiviral, anti-inflamatorio, el antialergénico, antitrombótico, y actúa como
vasodilatador (Cook and Samman, 1996). Los antioxidantes son potentes secuestrantes de
radicales libres y funcionan como inhibidores de procesos neoplásicos, y poseen una propiedad
fundamentalmente importante para la vida. Muchas de las funciones biológicas, como la
antimutagenicidad, anticarcinogenicidad, y antienvejecimiento, entre otros, y se originan de la
capacidad antioxidante (Cook and Samman, 1996; Huang et al. 1992).
En pruebas de laboratorio se estudió el efecto de la crocetina purificada aplicándola en piel de
ratones, encontrando actividad antitumoral, lo más probable debida a su actividad como
antioxidante (Giaccio, 2004).
La dieta juega un papel muy importante en la prevención y/o desarrollo de ciertas enfermedades
como el cáncer. Los alimentos contienen mutágenos y o carcinógenos, así como antimutagenos
y anticarcinógenos algunos de los cuales se encuentran naturalmente, y otros que podrían
producirse durante la preparación o industrialización de los alimentos (Starvic,1994).
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Rauscher. Et al, 1998, han demostrado que individuos que frecuentemente consumen las frutas
y verduras ricos en carotenoides, reducen significativamente la activación metabólica de pro
mutágenos. Las propiedades antimutagenicas, antitumorales y anticarcinogénicas de los
carotenoides han sido demostradas contra varios compuestos mutagénicos.
González del Mejía et al. (1998) encontró que cinco extractos de pimienta contenían una mezcla
de agentes antimutagenicos (ß-caroteno y xantofilas) y los carotenoides en cada extracto
probablemente tiene un efecto sinergista sobre mutagenesis, además explican que el ß-caroteno
presente en los extractos es uno de los principales agentes responsables para que actúe como
antimutagenico contra los nitroarenos estudiados.
Escribano et al, (1998) sugirieron que la crocina de azafrán (Crocus sativus L.) induce
apoptosis, además consideran que los compuestos de azafrán pueden probarse como agentes
terapéuticos contra el cáncer. Por otra parte, Abdullaev et al, 2002 encontraron, que algunos de
compuestos de azafrán y su extractos tienen actividad inhibitoria contra diferentes tipos de
células malignas humanas en experimentos in Vitro. Estudiaron los carotenoides extensamente
por sus propiedades biomédicas, sobre todo por su potencial quimio-preventivo contra cáncer.
Mendez-Robles et al, (2006) demostraron que los compuestos activos de Ditaxis heterantha
presentan actividad antioxidante y presentan efecto protector contra el daño oxidativo a ADN.
En la búsqueda continua para encontrar nuevos agentes antitumorales, los investigadores
dedican sus esfuerzos en estudiar los compuestos naturales y sus efectos contra el cáncer
modificando la carcinogenesis, o inhibiendo la formación de los tumores.
Los fármacos con efecto citotóxico inducen la muerte celular a través de la inducción de
apoptosis. Esto puede ser debido a la activación de varias rutas de muerte celular (England et al,
2006).
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Toxicidad es la medida del grado de como un compuesto es tóxico. Puede referirse al efecto
sobre un organismo como el humano, una bacteria o planta, o en una subestructura como la
célula (citotoxicidad) o un órgano (organotoxicidad tal como el hígado, hepatotoxicidad). El
concepto básico de toxicología es tales efectos son dosis-dependientes, aunque generalmente el
agua no es considerada tóxica, puede conducirse a intoxicación por agua cuando se toman
grandes dosis de la misma, mientras que para una sustancia tóxica, tal como el veneno de
serpiente existe una dosis debajo de la cual no se presenta efecto tóxico detectable (Wikipedia,
the free encyclopedia, 2007). El ensayo con MTT es una prueba calorimétrica de laboratorio
estandarizada para medir proliferación celular. Es empleada para determinar el potencial
citotóxico de agentes medicinales u otros materiales tóxicos (Wilkipedia, the free encyclopedia,
2007).
El cáncer cervico-uterino es el tercer tipo más común de cáncer en mujeres a nivel mundial
(Ren, D., 2006). Existen muchos factores que pueden afectar la sensibilidad de los tumores a la
radiación. Un mecanismo común de varios regimenes terapéuticos, incluyendo la radiación, es
la muerte del tumor vía apoptosis. Se ha sugerido que diversos agentes pro y anti-tumorales
afectan el crecimiento celular vía modulación de la apoptosis (Palozza, P., et al. 2001).
Apoptosis, o muerte celular programada, es requerida para el desarrollo normal de un animal,
tanto como para mantener la homeostasis de los tejidos. El mal funcionamiento de este proceso
se cree coincide con la incidencia de un gran numero de enfermedades humanas, incluyendo
desórdenes neuro-degenerativos y el cáncer. El proceso apoptotico (el cual difiere de necrosis)
se caracteriza por una serie de alteraciones morfológicas y bioquímicas incluyendo la
inflamación de la membrana, encogimiento celular, condensación de cromatina y fragmentación
de ADN. La apoptosis se caracterizó inicialmente por cambios morfológicos en células muertas.
Durante la apoptosis se presenta encogimiento celular y la desaparición de los microvellos de la
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membrana plasmática. En la etapa final el núcleo se condensa, y fragmenta, y las células
también se fragmentan pero manteniendo el contenido celular al interior. Uno de los rasgos
bioquímicos de la apoptosis es la fragmentación del AND cromosómico en núcleo somas,
unidades celulares apoptóticas que puede reconocerse tiñendo el núcleo condensado con el
colorante fluorescente Hoechst. El ADN fragmentado puede detectarse mediante el
procedimiento TUNEL (Terminal deoxynuclotidyltransferase-mediated UTP end labelling) o
por electroforesis del ADN aislado en geles de agarosa.
A pesar del desarrollo de nuevos agentes del quemo terapéutico, hay algunos problemas con
quimioterapia que incluye toxicidad, el desarrollo de tumores que son resistente a la
quimioterapia, y la habilidad de quimioterapia de matar dividiendo rápidamente sólo células
(Abdullaev, 2002). Subsecuentemente los tiempos antiguos, se usó azafrán español en medicina
pariente como un agente del anticancer contra los tipos diferentes de tumores y cánceres.
II. Justificación
"El Azafrán de bolita" (Ditaxis heterantha Zucc) es una planta silvestre de la región norte de
estado de Jalisco, con un gran potencial como colorante amarillo natural así como fuente de apo
carotenoides y como alternativa del azafrán español, sin embargo, existen pocos estudios sobre
las propiedades fisicoquímicas y sobre su actividad biológica.
III. Hipótesis
Heterantina y ditaxina, pigmentos del "Azafrán de bolita" (Ditaxis heterantha Zucc), son
apocarotenoides que tienen actividad antioxidante, protegen del daño oxidativo al ADN y
presentan efecto citotóxico para las células de cáncer cérvico-uterino.
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IV. Objetivo
4.1. Objetivo general.
Determinación de la actividad antioxidante, antimutagénica, y anticarcinogénica de heterantina
y ditaxina presente en la semilla "Azafrán de bolita" (Ditaxis heterantha Zucc).
4.2. Objeto particulares
a. Extracción y purificación de heterantina y ditaxina presentan en las semillas Ditaxis
heterantha
b. Determinación de la actividad antioxidante de heterantina y ditaxina.
c. Determinación de la protección contra el daño oxidativo al ADN por heterantina y ditaxina.
d. Determinación de la capacidad anticarcinogénico de heterantina y ditaxina en línea celulares
cervico-uterino.
V. Material y métodos
5.1. El material
Las semillas Azafrán de bolita (Ditaxis heterantha Zucc) se colectaron de un mercado local en
Jalisco, México. Los linfocitos tomados de tejido cardiaco de rata fueron proporcionados por el
laboratorio de patología de Centro de Investigación y el de Asistencia en Tecnología y Diseño
del Estado de Jalisco (CIATEJ), Guadalajara, Jalisco. Las líneas celulares humanas de cáncer
cervico-uterino (HeLa y CaLo) y la línea celular no maligna (McCoy) fueron proporcionadas
por el Laboratorio de Citopatología Ambiental de Instituto Politecnico Nacional, México (IPN).
5.2. Métodos
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5.2.1. Extracción del pigmento
La muestra se pulverizó en un molino eléctrico Straus Modelo 4E, se mantuvo en agitación con
suficiente hexano durante 1 hora protegido de la luz y a temperatura ambiente. Una vez
finalizada la extracción, la mezcla se filtro con papel Whatman 42. Al extracto se le evaporó el
disolvente en rotavapor a una temperatura no mayor de 40° C para recuperar la oleorresina. Para
eliminar las grasas, la oleorresina se disolvió en acetona y se congeló utilizando un baño de la
acetona con bióxido de carbono sólido como medio de congelación. Para posteriormente
filtrarla, reteniendo en el filtro al vacío la grasa solidificada. La acetona que usó se evaporó con
rotavapor a temperatura no mayor de 40° C. El extracto de carotenoides se guardó en
congelador hasta su uso (Rodríguez Amaya, 1999).
5.2.2. Separación de las fracciones del pigmento mediante cromatografía en columna
abierta (OCC)
Las columnas (tubos de vidrio de cromatografía de 2.5 x 50 cm. con chaqueta de enfriamiento)
se empacaron con MgO se empacaran en seco, de acuerdo con el procedimiento citado por
Rodríguez-Amaya (1999). Agregando pequeñas porciones y compactando con una varilla de
vidrio, hasta lograr un asentamiento de las partículas por gravedad. Como eluyente se utilizó
éter etílico y éter petróleo en gradiente Se pasó éter de petróleo a través de la columna y se
ajustó la circulación de agua fría a través de 4° C. Los fragmentos obtenidos se colectaron en
frascos oscuros y guardaron a -20 hasta su análisis (Rodríguez-Amaya et al. 1976; Abott y
Andrew, 1973).
5.2.3. Cristalización de las fracciones
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Para obtener cada fracción en forma sólida y con alto grado de pureza, se cristalizaron mediante
saturación. Cada una de ellas se disolvió en la menor cantidad posible de una mezcla de éter
etílico-éter petróleo (1:3), mediante nitrógeno se concentró la mezcla hasta cristalización y
posteriormente se separó de la mezcla de disolventes mediante filtración. Se repitió el
procedimiento con los cristales recuperados para lograr mayor pureza. Finalmente, se secaron
mediante nitrógeno para eliminar residuos de disolventes.
5.2.4. Cromatografía en capa Fina (TLC)
Para el análisis de pureza de las fracciones, se realizaron pruebas en cromatografía de capa fina
con gel de sílice (Alltech Associates, Deerfield, IL) en placas de 20 x 20 cm. x 0.25 mm. Se
aplicaron en la línea base de la placa 50 µl de las fracciones y se corrieron en una caja de vidrio
conteniendo una mezcla de éter etílico-éter de petróleo (40:60, v/v) cantidad suficiente para
llegar a la línea base, donde fueron aplicadas las muestras. Se espera hasta que el disolvente
llegue a la parte superior de la placa, para finalmente secar al aire y visualizar las manchas
coloridas correspondientes a cada compuesto.
5.2.5. Determinación de la capacidad antioxidante.
La actividad antioxidante se determinó mediante las técnicas de DPPH· (Martínez, 2002), el
método de cooxidación de �-caroteno con ácido linoléico (Martínez 2002), y el método con el
ABTS· (Braham et al, 2005).
5.2.5.1. Ensayo de DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
El ensayo de DPPH se basa en la habilidad de los antioxidantes de secuestrar el radical estable 2,
2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH.). Este ensayo evalúa la disminución en la absorbancia
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producida a 515-528 nm por la decoloración de una solución de DPPH en metanol generada por
la acción del compuesto antioxidante. Así, el grado de decoloración de la solución indica la
eficiencia de la capacidad secuestrante de la substancia agregada.
Se hicieron modificaciones al método de DPPH original de Brand-Williams et al. (1995), y el
procedimiento modificado (Fukumoto y Mazza, 2000) se adaptó para el uso en micro placas. La
solución de DPPH· (150 µM) se preparó en metanol al 80%. Las muestras se agregaron a cada
pozo en una placa de 96 pozos de-fondo plano para luz visible, conteniendo 200 µl de solución
de DPPH·. Las muestras se prepararon por triplicado para cada concentración (150 - 1500 µM).
La placa se cubrió con su tapa protegido de la luz a temperatura del cuarto (20°C). Después de
60 min, se leyó la absorbancia a 515 el nm en un espectrofotómetro (Spectramax Plus 384).
La concentración de la muestra se calculó restando de la unidad la relación de las absorbancias
de la muestra y el control (DPPH· en etanol) multiplicados por 100, reportando como actividad
antirradical (ARA), ecuación definida por Burda y Oleszek, 2001:
ARA = 100 x (1 – Absorbancia de la muestra/Absorbancia del control) (1)
5.2.5.2. Cooxidación de ß-caroteno y ácido linoleico
El método evalúa la capacidad de minimizar la oxidación acoplada del ß-caroteno y ácido
linoleico en una emulsión, que es observada por la perdida de color de caroteno.
Las reacciones de oxidación se efectuaron en microplacas de 96-pozos de fondo plano (ICN Inc
Biomédico., Aurora, OH). Se leyó la reacción a 470 nm y a temperatura ambiente (MRX plate
reader; Spectramax Plus 384) a los cero y a los 60 minutos. La emulsión fue preparada
mezclando en vortex 1 ml de ß-caroteno (2 mg/ml en cloroformo), 0.2 ml de ácido linoleico y 2
15
ml de Tween 20. El cloroformo se evaporó empleando corriente de nitrógeno por 1-1.5 h. Se
agrega agua burbujeada con aire (20 ml) a la mezcla y nuevamente se mezcla en vortex para
formar una solución clara. La solución de prueba (20 µl) y 200 µl de la solución del caroteno se
agregó a cada pozo. Las muestras se prepararon por triplicado para cada concentración (600-
1500 µM), y por lo menos se usaron cuatro concentraciones diferentes. Para iniciar la reacción
se agregó ADIBA (30 µl, 0.3 M) a cada pozo. La oxidación de la emulsión se registró mediante
las lecturas de la absorbancia. Se tomó el promedio de las tres lecturas y se calculó la pendiente
de la velocidad inicial de reacción (Fukumoto y Mazza, 2000).
El método de cálculo se basa en una cinética de reacción de primer orden. La actividad l
antioxidante se expresa como por ciento de inhibición relativo después de 60 minutos de
incubacion (Al-Saikhan et al.; 1995) y le usa del siguiente ecuación:
AA = 100 (DRc – DRs)/DRc (2)
Donde AA es la actividad del antioxidante, DRc es la proporción de degradación del control [=
(ln(a/b)) /60], DRs es la proporción de degradación de la muestra [= (ln(a/b)) /60], a es la
absorbancia inicial en 0 minuto, y b está el absorbancia en 60 minutos.
5.2.5.3. Capacidad Antioxidante con el radical ABTS (2,2’-Azinobis-(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))
La actividad para atrapar el cation ABTS·+ se evaluó con el método de TEAC modificado de Re
(Braham et al.; 2005). El ABTS (7 mM) se disolvió en agua oxigenada y se agregó ferro
sulfato de potasio a una concentración final de 2.4 mM. La mezcla de reacción se deja de 12-16
h en la oscuridad a temperatura ambiente, y la solución del catión se diluyó con (1 ml de
16
solución en ca 60 ml de agua) para dar un valor del absorbancia de 0.70 + 0.03 a 734 nm. El
trolox, el extracto completo de la semilla de Ditaxis heterantha, la ditaxina y heterantina fueron
ensayadas por separado en metanol a 3 concentraciones (150, 750 y 1500 µM). Se prepararon ß-
caroteno y Astaxantina en acetona a las mismas concentraciones. Se mezcla en un Vortex la
solucion de ABTS·+ (2.8 ml) con 0.2 ml de las soluciones de las muestras por 30 s. Se registró la
disminución de absorbancia de la mezcla a los 6 min a 734 nm. La actividad para atrapar el
cation ABTS·+ se estimó dentro del intervalo de la curva correspondientes a las concentraciones
ensayadas de trolox y se expresó la Capacidad Antioxidante como el equivalente Trolox
(TEAC), que se define como la concentración (mM) de Trolox que tiene la capacidad
antioxidante equivalente a 1.0 mM de Trolox o a 1 mg/mL de la muestra probada.
5.2.6. Estudio del daño oxidativo de ADN mediante Electrofóresis de Célula Simple
(Ensayo Cometa)
Células mononucleares de sangre periférica se colectaron de sangre de ratas (Winstar), usando
para ello tubos con heparina-litio. La sangre se colocó en tubos con regulador PBS (1:1, v/v), se
adicionó el mismo volúmen de lymphoprep, y centrifugó a 1500 rpm a 4°C durante 20 minutos.
Se extrajeron cuidadosamente los limfocitos de las mezclas y se lavaron 3 veces con PBS.
Finalmente el precipitado se diluyó con PBS y se guardó en refrigerador hasta se usó.
1.0% (60°C) de agarose de punto de fusión normal (NMA) se preparó en PBS. Cada laminilla se
cubrió con 200 µl de 1.0% NMA en PBS, y dejó por unos 5 min. Enseguida, 50 µl de los
linfocitos con 10µl de muestra (extractos de D. Heterantha, ditaxina y heterantina) y 20 µl de
peróxido se mezclaron con 150 µl de agarose al 0.65% de bajo punto de fusión (LMA) a 37°C
extendiendo y cubriendo la laminilla, dejando solidificar a 4°C en una caja húmeda.
Posteriormente la laminilla se sumerge en una solución de lisis recientemente preparada (2.5 M
17
NaCl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris; pH 10-10.5; 1% Triton X-100 y 10% DMSO simplemente
agregó antes del uso) por lo menos 1 h.
Las laminillas se retiran de la solución lisis y se colocaron en la camara de electroforesis, la que
se cubre con regulador alcalino fresco (300 mm NaOH y 1 mm EDTA, pH 13). Las células se
expusieron a la solución alcalina por 45 min para permitir que el ADN se desenrrolle y se
muestren los sitios labiles al alcali. Se corre la electroforesis por 15 min a 300 mA y 25 V. En
todos los casos, se corrieron controles negativos y positivos usando linfocitos de sangre de
tejido cardiaco de ratones.
Después de la electroforesis, las laminillas se pusieron en posición horizontal y se lavaron tres
veces con regulador Tris 0.4 M, pH 7.5, con el objeto de neutralizar el álcali en exceso.
Finalmente, se agregaron 70 µl de bromuro de ethidium (2 mg/ml) a cada diapositiva, las que se
cubrieron con cubre objetos y se almacenaron a 4°C en una caja humidificada. Finalmente se
analizaron usando un microscopio de fluorescencia. Se analizó la imagen de 50 células
seleccionadas al azar. Los parámetros normalmente evaluados son longitud de la cola cauda,
intensidad relativa de fluorescencia de cabeza y cola (olive tail moment), y el momento de la
cola. La intensidad relativa de la cola es el parámetro más útil, ya que guarda una relación lineal
con la frecuencia de rompimiento. Proporciona una evidencia muy clara de cuales lucen
realmente como cometas.
5.2.7 Determinación de viabilidad celular
Crecimiento del Cultivo celular:
La línea celular de cáncer cérvico-uterino, HeLa (carcinoma de epitheloid de cerviz humano),
se adquirió de la ATCC (ATCC, Rockville, MD) y las células CaLo, línea de cáncer cérvico-
uterino, de un tumor fase clínica IV de una mujer mexicana, así como la línea celular no-
18
carcinogénica McCoy, se cultivaron en el Laboratorio de Citopatología de la ENCB (Ramon-
Gallegos, 2000). Las celulas se cultivaron en RPMI-1640 complementados con 7% de Suero
fetal bovino (Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Maryland, USA.), 1% penicilina y
estreptomicina (Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Maryland, USA). Se mantuvieron a 37°C
en incubación en atmósfera humeda con 95% air/5% CO2 (Nuaire, Plymouth, MN). Las células
se cultivaron por 4-5 días para asegurar crecimiento exponencial.
10,000 células/pozo se crecieron a 37°C en microplacas de 96 pozos con 100 µl de medio RPMI
con 7% FBS (Nuaire, Plymouth, MN) en una atmósfera humeda de 5% CO2 y 95% aire (Babich
et al, 1992). Después de 24 h, se agregaron diferentes concentraciones de ditaxin, heteranthin y
extracto completo de Ditaxis heterantha por 24 h.
5.2.7.1. Determinación de la viabilidad celular con Rojo Neutro
Se estimó viabilidad celular por medio del ensayo espectroscopico con rojo neutro. El sistema
de ensayo con rojo neutro es uno de los medios para medir células vivas vía la captación del
colorante rojo neutro (Básico Rojo 5, Toluene Red). Las células viables captan el colorante por
medio de transporte activo y lo incorporan en los lisosomas, mientras que las células no viables
no lo incorporan. Después de que se ha permitido la incorporación del rojo neutro, las células se
lavan y fijan. El colorante incorporado se libera entonces de las células empleando una solución
de etanol acidificada. Un aumento o disminución en el número de células o de su status
fisiológico en un cambio concomitante en la cantidad de colorante incorporado por las células
en el cultivo. Esto indica el grado de citotoxicidad causado por el material de prueba.
Las células se cultivan en microplatos de 96-well pozos y se incubaron en RPMI durante 24h.
Este medio fue reemplazado entonces por medio nuevo conteniendo ditaxina y heterantina a
diferentes concentraciones, enseguida el medio de tratamiento fue reemplazado por 100 µL de
19
medio de crecimiento con 50 µg/mL de Rojo Neutro (Sigma). Las placas se incubaron a 37 °C
por 3 h, después del que el medio es removido, y las células se lavan rápidamente con 100 µL
de formol-calcio (40% formol y 10% calcio). Un volumen de 100 µL de 50% etanol y 1% ácido
acético fue agregado para disolver el tinte incorporado por las células, y las placas se leyeron a
540 nm. Todos los experimentos se efectuaron por cuadruplicado.
Absorbancia a 540 nm indica la cantidad de Rojo Neutro incorporado por las células por
endocitosis, y es directamente proporcional a viabilidad celular. El porcentaje de células viables
en la población celular a cada concentración de los compuestos ensayados se calculó por medio
de la fórmula siguiente:
(100control células las de promedio aAbsorbanci
tratadascélulas las de promedio aAbsorbanciViabilidad % ×= ) (3)
5.2.7.2. Determinación de la viabilidad celular con MTT
La Viabilidad celular fue evaluada por MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromuro], ensayo que se basa en la reducción de MTT por la
deshidrogenasa de la mitocondria de las células intactas dando como producto púrpura de
formazan que diferencia las células muertas de las vivas. La disminución en DO mide el grado
en que las células de cáncer han disminuido, empleando para ello la Ecuación 3.
Las células se cultivan en microplatos de 96- pozos y se incubaron en RPMI durante 24h. Este
medio fue reemplazado entonces por medio nuevo conteniendo ditaxina y heterantina a
diferentes concentraciones, (15 mM; 7.50 mM; 3.75 mM; 1.875 mM; 0.938 mM y 0.465 mM),
posteriormente el medio del tratamiento fue reemplazado por 100 µl de medio de crecimiento
que contiene MTT (Sigma) y, se incubaron a 37 °C por 4 h. El medio es removido sin retirar el
20
formazan formado, adicionando enseguida 100 µl de isopropanol acidificado (pH 4.0), y
agitando por 15 min. La solución se transfiere a tubos eppendorf y se lee la absorbancia a 570
nm. Todos los experimentos se efectuaron por cuadruplicado.
5.2.7.3. Determinación de la viabilidad celular con Azul trifan
La mortalidad celular se estimó con el ensayo de azul trifan. Se reemplazó el medio que
contenía ditaxina y heterantina con tripsina para remover las células de cada pozo, y la solucón
resultante se centrifuga y el precipitado se resuspende en 1.0 ml de medio fresco. El azul trifán
se agrega a la suspensión celular (1:10 v/v). El porcentaje de viabilidad así como mortalidad
celular en cada concentración probada de los compuestos, se determinó por calculo de el
número de células muertas (células teñidas; el color oscuro) así como las células viables
(transparentes) por medio de fórmula (3)
5.2.8. Determinación de apoptosis
5.2.8.1. Ensayo de Hoechst
1 x 106 cells/pozo se incubaron con y sin el ditaxina. La morfología HeLa y CaLo las células
malignas humanas expusieron al ditaxina durante diferentes tiempos (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 y 24
horas) se observó primeramente bajo el microscopio invertido. Entonces Hoechst 33258 que
mancha fue acostumbrado a observar la morfología del apoptotic. Las células eran fijas con 4%
formaldehído en buffered de fosfato salino (PBS) para 10 min, manchado por Hoechst 33258
(10g/l) para 1 h, y entonces sujetó a la microscopio de fluorescencia. Después del tratamiento
con ditaxina, el morfológicas cambia incluyendo condensación del cromatina nuclear se observó.
Hoechst que 33258 tintes de ADN se aplicaron como nuclear manchando lo opuesto. La
microscopio fluorescencia es principalmente usada para el análisis cualitativo o para la
21
documentación (Paddy, 1998). El Hoechst 33258 signo de fluorescencia (con la luz fluorescente
más fuerte) se usó por enfocar. Se examinaron células tratadas con microscopio de fluorescencia
(FM) (Carl Zeiss). Las células evaluadas fueron teñidas por Hoechst 33258 antes examinado por
FM. Se volteó fluorescencia en las longitudes de ola de excitación de 359 nm. Se descubrió
intensidad de fluorescencia a la longitud de onda de la emisión de 460nm. Las imágenes fueron
analizadas usando visión de Axio LE construya software. Se realizaron experimentos del mando
en la misma condición. La luz fluorescente se descubrió para Hoechst 33258 al filtro ponga No.
2 (todos los filtros de Carl Zeiss) usando un filtro de la excitación (G 365), un hendedor de la
viga (FT 395) y un filtro de la emisión (LP 420 nm); la resolución espacial del sistema era 1
µm2/pixel.
6. Análisis estadístico
Una manera analiza de variación (ANOVA) se usó a lo largo de con la prueba uno- detrás de de
Dunnett para disminuciones del mando (p> 0.05). Para los experimentos con compuestos
múltiples, los análisis se corrieron separadamente para cada concentración y el mando era
incluido para cada carrera. Se analizaron datos usando software de Sistema de Análisis
Estadístico (Instituto de SAS Inc., Cary, NC 27511, EE.UU. Descargo 6.02). los Valores fueron
considerados significantes cuando P <0.05.
7. Resultado y discusión
7.1. la composición de las semillas Ditaxis heterantha
La composición química del D heterantha. es: proteína 21.2, engrase 38.9, fibra cruda 24.1,
humedad 5.7 y ceniza 2.6%, y el ditaxina y heterantina encontraron en cantidad pequeña
(0.01%).
22
7.2. pureza de heterantina y ditaxina.
Siete fraciones del carotenoides estaban separados y dos de ellos fueron purificados por
cromatografía de la columna abiertos. El primer fracion obtenido de la MgO2 columna de Celite
tenía un color anaranjado y se identificó como Ditaxina, el segundo fragmento se identificó
como heterantina. Tenía un color amarillos fuertes. El sistema de TLC fue usado para examinar
la pureza de estos compuestos usando 40% éter del etilo en éter de petróleo. La mancha
expresada limpia en esta hoja tiene la pureza alta (Figura 2).
Figura 2. Manchas de los fracciones analizado médiate de TLC
23
igura 3. Estructura Ditaxina del Ditaxis heterantha
Figura 4. E
.3. La actividad de Antioxidante
xina, heterantina, y el extracto completo de semilla Ditaxis
F
structura Heterantina del Ditaxis heterantha
7
La actividad del antioxidante de dita
heterantha comparada con algún antioxidante estándares sea moderada por ß-caroteno que
palidece método, DPPH ensayan y ensaye de ABTS.
24
El método�-caroteno que palidece fue usado para evaluar actividad del antioxidant en el ditaxin,
heteranthin y extracto completo de la semilla Ditaxis Heterantha. Se ajustaron muestras con
volumen del carotenoids alto a la concentración diferente. Se usaron Catechin y -tocopherol
como standares a 750, 1350 y 1500 µM. El resultado de actividad del antioxidant del extracto
completo de la semilla D. Heterantha, ditaxin y heteranthin por el método linoleic del �-
caroteno que palidece y muestras en Figura 5.
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
750 900 1050 1200 1350 1500
Concentration of compounds (µM)
Ant
ioxi
dant
act
ivity
Extract Heteranthin DitaxinCatechin Alfa-tocopherol
Figure 5. Antioxidant activity of Ditaxin, Heteranthin and completely extract of Ditaxis
le hing assay
a actividad del antioxidant por -caroteno que palidece prueba mostró ese ditaxin era más alto
Heterantha seed, Catechin, and �-tocopherol by the �-carotene linoleic
b ac
L
que el heteranthin y extracto (Fig.5). La actividad de Antioxidant de compuestos con estructuras
diferentes que usa el -caroteno que palidece métodos puede compararse, porque estos métodos
son basado en la inhibición de linoleic las reacciones de la oxidación ácidas. La solubilidad
25
pobre en las soluciones ácueas y estorbo del steric de compuestos puede haber contribuido a la
diferencia observada.
El DPPH radical libre que recoge la basura potencial del ditaxin, heteranthin, y el extracto
completo de Ditaxis heterantha semilla comparó con astaxanthin y -caroteno a 6
concentraciones diferentes (150 - 1500 µM) se da en Figura 6. Ditaxin a través de 1500 µM de
nivel de la concentración mostró a un radical de DPPH más alto que recoge la basura actividad
comparado con heteranthin y el extracto completo. Astaxanthin como el mando positivo mostró
la actividad más alta. Los valores altos de actividad del antiradical al método de DPPH indicado
como una concentración de DPPH alta necesitaron reaccionar con cada molar del micro de
compuestos y por consiguiente, la actividad del antioxidant potencial más alta.
0.0
15.0
30.0
45.0
60.0
0 300 600 900 1200 1500
Concentration of compounds (µM)
AR
A v
alue
(%)
Extract Ditaxin Heteranthinb-carotene Astaxanthin
26
Figure 6. Anti Radical Activity of ditaxin, heteranthin and completely extract of
Ditaxis Heterantha seed compare with Astaxanthin and �-carotene by
DPPH methods.
La DPPH método medida que un compuesto ha reaccionado con DPPH que es dependiente en
su estructura estructural, DPPH reacciona directamente con un compuesto, -caroteno
palideciendo coincide con oxidación primaria de ácido del linoleic, y el malonaldehyde se forma
de la descomposición de peróxidos hidros durante las reacciones de la oxidación secundarias de
ácido del linoleic. Estas diferencias podrían llevar a las variaciones en la medida de actividad
del antioxidant. Porque los métodos de medir actividad del antioxidant son sumamente
dependientes en las condiciones usadas y los substrates o productos supervisaron, todos los
métodos no dieron los mismos resultados para la actividad.
El resultado demostró que cada antioxidant difirieron en su capacidad del antioxidative hacia las
fuentes diferentes de radicales libres y otros oxidants. Una comparación del heteranthin, ditaxin,
y el extracto completo de D. Heterantha sembra anteriormente en los dos ensaye proporciona
alguna visión en el mecanismo potencial de acción. Este estudio indica que la cadena más larga
de ditaxin y con la presencia de grupo del hydroxyl en uno lado de ditaxin podría aumentar la
actividad del antioxidant de este fragmento. La cadena carbónica más corta y menos los
hydroxyl probablemente se agrupan en estructural de heteranthin contribuya a la actividad del
antioxidant débil.
El ensaye de TEAC es basado en recoger la basura de cation radical duradero ABTS. Porque los
TEAC han realizado en un pulidor ácueo que los compuestos sólo agua-solubles son moderados.
Como comidas generalmente contenga ambos agua-y lipid los compuestos solubles con
27
capacidad del antioxidant, sería atractivo poder usar un método por proteger en potencial que
recoge la basura capacidad. Nosotros parecíamos en la posibilidad de evaluar compuestos lipid-
solubles en el TEAC ensaye por solubilizing estos compuestos, sobre todo el astaxanthine y -
caroteno, en el medio del ensaye ácueo que usa solventes convenientes.
Samples
HeteranthinDitaxin
Extract
Astaxanthin
b carotene
TE
AC
Val
ue
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Figura 7. Valor del TEAC Value por Ensayo de ABTS
Los TEAC valoran en estudio actual mostró ese ditaxin (0.99) era significally más alto (p <0.05)
que el astaxanthin (0.58), -caroteno (0.39), heteranthin (0.17) y el extracto completo de
heterantha de D. sembra (0.37) (Figura. 7).
Ditaxin demostró el antioxidant más alto potencial con aproximadamente el triple de la
actividad del -caroteno. Un TEAC bajo valora del -caroteno podría reflejar cualquiera actividad
recogiendo la basura limitada o la solubilidad limitada. Las aplicaciones del ensaye para
28
completar el extracto y los compuestos activos de Ditaxis heterantha son complicadas. A pesar
de estas complicaciones, nosotros seguro que el TEAC es herramienta útil por proteger la
capacidad del antioxidant de ambos puro y antioxidants de las mezclas. ABTS todavía ensayan
aplicación en productos de colour de comida que más investigación se necesita, sobre todo con
respecto al solubilization de los compuestos en el ensaye.
7.4. el efecto de Antimutagenic
El ensaye del Cometa normalmente es más más aplicó a las células animales, si en cultura o
aisló del organismo (ej., Lymphocytes separó de sangre, o células de los tejidos del
disaggregated), Collins, 2004. Midiendo los ADN cuerda descansos da información limitada;
los descansos pueden representar el efecto directo de algún agente perjudicial. Para hacer el
ensaye más específico así como más sensible, nosotros introdujimos el paso de digerir el
nucleotide. En cada caso, los sitios enzima-sensibles convirtieron a ADN descansos aumento
cola intensidad adicional.
ADN es visualizado por microscopía de fluorescencia después de manchar con ADN-ligar tinte.
Bromuro de Ethidium (EB) normalmente es más más usó. EB es un tinte intercalando que liga
más eficazmente. El parámetro normalmente usado para califique ensaye del cometa es longitud
de la cola, intensidad de fluorescencia relativa de cabeza y cola (aceituna de momento de cola) y
cauda de momento de cola. La longitud de la cola mala no es muy útil (Collins, 2004), cuando
sólo aumenta mientras se establecen colas primero, a los niveles de daño relativamente bajos.
La intensidad de la cola relativa es el parámetro más útil, cuando lleva una relación lineal para
romper frecuencia. También da una indicación muy clara de lo que los cometas realmente se
parecían. Obtener los cometas representativos resultan que la gel era scaned de manera
29
sistemática. El análisis de solapar cometas es imposible, por lo menos con análisis de la
computadora. El análisis de 50 cometas por la diapositiva se recomienda.
Treatment
Control positive
Control negative
Extract(1000µM)
Extract(500µM)
Ditaxin(1000)
Ditaxin(500)
Heteranthin(1000)
Heteranthin(500)
Tail
mom
ent o
live
(µm
)
0
5
10
15
20
30
Figure 8. Tail moment olive as parameter of DNA oxidative damage on protection effect of
Ditaxin, Heteranthin, and completely extract of D. Heterantha seed by
Comet assay
El descanso de ADN frecuentemente se relaciona linealmente al porcentaje de cola ADN-a a
cierto nivel. En figura 8. mostró daño proteccionista es persona a cargo de la dosificación, Los
Lymphocyte sin el oxidative dañan protección (compuestos activos de heterantha de D.) mostró
el valor de longitud de cola más alto como parámetro de oxidative los daño y perjuicios de ADN.
Ditaxin y heteranthin en ambos la concentración mostró la protección alta contra el oxidative
dañe (peróxido) comparó con el lymphocyte sin esto compone como un mando (K-
L+DMSO+P). El valor diferente de longitud de la cola puede reflejar la composición diferente
de cada compuestos.
En este peróxido del estudio (H2O2) usó como un mutagens causó daño alto a las células de las
sangres del lymphocyte. Nosotros asumimos los dos de presente de los compuestos activo en D.
que la semilla de Heterantha sea protegido las células de las sangres del lymphocytes del daño
de oxidative de peróxido. En concentración alta (1000 µM) D. Hetrantha sembran el extracto
mostró protección más alta que en concentración más baja.
7.5. El efecto anti carcinogénico
7.5.1. las mortalidad lascélulas
La viabilidad así como la mortalidad de células era exposición siguiente moderada a la
concentración diferente de ditaxin y heteranthin. Se estimó viabilidad celular por medio del
31
spectrophotometer rojo neutro ensaye, y también se hizo en paralelo con otro ensaye como MTT
y Triphan el ensaye azul.
7.5.1.1. la mortalidad la célula de cáncer humana HeLa.
Las células se incubaron con el ditaxin, heteranthin y extracto completo de azafran de la bolita
para 24 h. Ditaxin causó toxicidad de la célula más alta que el presente por células de
mortalidad altas en HeLa célula línea cuando comparó al heteranthin y extrae a través de ambos
métodos. Este cytotoxicity estaba en una concentración la manera dependiente. El extracto y
heteranthin eran significativamente diferentes en todo las dosis, mientras el ditaxin era
poderosamente similar en dosis alta.
Figure 9 muestras los efectos del cytotoxicity contra la HeLa cáncer célula linea a través de seis
concentraciones (15.0; 7.50; 3.75; 1.875; 0.938 y 0.469 mm) del heteranthin, ditaxin y extracto
completo de Azafran de la bolita. Ambos métodos MTT ensayan y las muestras del ensaye
Rojas Neutras que los ditaxin exhibieron efecto alto en célula de cáncer (por ciento de muerte de
la célula). Por MTT ensaye (9a) el ditaxin, según las concentraciones arriba expresado, muestra
la mortalidad más alta valora (89.67; 84.52; 77.52; 69.33; 62.88; y 56.46%), seguido por el
extracto completo de Azafran de la bolita (91.09; 80.53; 44.92; 38.30; 25.89 y 14.78%) y
heteranthin con menos efecto que los otros los compuestos (48.15; 35.36; 28.05; 21.75; 15.69 y
6.16). Usando ensaye rojo Neutro (9b), las tres muestras de los compuestos el efecto más bajo
que el ensaye de MTT. Ditaxin mostró la mortalidad más alta (57.52; 42.67; 20.56; 18.55; 10.22
y -43.40%), seguido por extracto completo de Azafran de la bolita (33.77; 22.63; 13.79; 5.35;
1.53 y -8.03) y al final por heteranthin con el efecto más bajo (39.58; 27.37; 24.40; 19.14; 12.42
y 11.81%).
32
Concentration of compounds (mM)
0,469mM
0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM
15,00mM
He-
La c
ell m
orta
lity
by M
TT a
ssay
(%)
0
20
40
60
80
100
Heteranthin Ditaxin Extract
Concentration of Compounds (mM)
0,469mM
0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM
15,00mM
He-
La C
ell m
orta
lity
by N
etra
l red
ass
ay (%
)
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Heteranthin Ditaxin Extract
33
Figura 9. la mortalidad de la Célula de HeLa la célula de cáncer humana con Ditaxis heterantha
diferente compone y concentración diferente a través de dos ensaye diferentes (A. MTT; B. el
ensaye Rojo Neutro)
7.5.1.2. Mortalidad del celulas cancerosa del humano CaLo.
Concentration of compounds (mM)
0,469mM0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM15,00mM
CaL
o ce
ll m
orta
lity
by M
TT a
ssay
(%)
0
20
40
60
80
100
Heteranthin Ditaxin Extract
34
Concentration of compounds (mM)
0,469mM0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM15,00mM
Cal
o ce
ll m
orta
lity
by
Net
ral r
ed a
ssay
0
20
40
60
80
100
Heteranthin Ditaxin Extract
Figure 10. Mortalidad cellular de la línea celular humana de cancer cervico uterino CaLo con
diferentes compuestos de Ditaxis heterantha a diferentes concentraciones y dos ensayos
different assays (A: MTT; B. Neutral Red assay)
Figure 10. muestras los efectos del cytotoxicity contra la CaLo cáncer célula linean a través de
seis concentraciones (15; 7.50; 3.75; 1.875; 0.938 y 0.469 mm) del heteranthin, ditaxin y
extracto completo de Azafran de la bolita. Ambos métodos MTT ensayan y las muestras del
ensaye Rojas Neutras que los ditaxin exhibieron efecto alto en célula de cáncer (muerte de
célula de por ciento). Por MTT (10a) los ditaxin del ensaye mostraron la mortalidad más alta
valora (94.82; 90.77; 90.31; 84.19; 39.87; y 9.03), que el extracto completo de Azafran de la
bolita (97.15; 63.31; 36.11; 34.57; 22.02 y 5.86) seguido por heteranthin (66.96; 58.68; 46.25;
34.24; 19.42 y 17.65).
En ensaye rojo Neutro (10b) los ditaxin mostraron la mortalidad más baja valora que MTT
ensayan (81.29; 78.68; 78.63; 75.89; 48.61 y 27.78), seguido por extracto completo de Azafran
35
de la bolita (76.35; 72.83; 48.54; 37.77; 24.35 y 13.97) y finalmente por heteranthin (44.65;
40.50; 31.06; 24.88; 18.70 y 18.22).
7.5.1.3. Mortalidad de celulas no carcinogenicas McCoy.
Concentration of compounds (mM)
0,469mM0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM15,00mM
McC
oy c
ell m
orta
lity
by M
TT a
ssay
(%)
-150
-100
-50
0
50
100
Heteranthin Ditaxin Extract
36
Concentration of compounds (mM)
0,469mM0,938mM
1,875mM3,75mM
7,5mM15,00mM
McC
oy c
ell m
orta
lity
by N
etra
l red
ass
ay (%
)
-600
-400
-200
0
Heteranthin Ditaxin Extract
Figure 11. Mortalidad cellular de Mc-Coy cell con diferentes compuestos de Ditaxis heterantha
a diferentes concentraciones y dos tipos de ensayo (A: MTT; B. Neutral Red assay)
Figure 11 muestras los efectos de citotoxicidad contra la línea no carcinogénica McCoy a seis
concentraciones (15,0; 7,50; 3,75; 1,875; 0,938 y 0,469 mm) de heterantina, ditaxina y extracto
completo de Azafran de la bolita. En ambos métodos, MTT y los ensaye Rojos Neutros
mostraron que ditaxina y el extracto completo no tienen efecto tóxico contra la McCoy célula
línea (células no-carcinogénicas) en casi todas las concentraciones demostradas, exceptúe a las
concentraciones altas.
El efecto de mortalidad de ditaxin sea 71.87; 30.49; 3.03; -19.07; -29.50 y -47.93; el extracto
completo de Azafran de la bolita: 68.45; 58.60; 21.94; -65.51; -88.50 y -144.37; seguido por
heteranthin (87.95; 81.15; 78.88; 74.54; 66.27 y 33.74) (11a). En ensaye rojo Neutro (11b) los
ditaxin mostraron la mortalidad más baja valora (43.12; 32.43; 19.40; -2.63; -54.47 y -130.83),
37
comparó con extracto completo de Azafran de la bolita (11.75; -39.91; -628.77; -628.77; -
628.77; y -628.77) por heteranthin (74.23; 69.46; 58.55; -73.46; -69.99 y -120.51).
7.5.2. Apoptosis celular.
7.5.2.1 Apoptosis por el método de Hoechst
Evaluar si el cytotoxicity efectúa de ditaxin era asociado con el apoptosis, un método
manchando, que Hoechst 33258 que usa tryhydrochloride de Benzimide Bis fue realizado. La
influencia de ditaxin en apoptosis fue examinada a través de fluorescencia microscópico con
Hoechst que mancha técnica y el cinético a 0 a 24 se estudiaron horas usando ditaxin con
concentración 30 mm y la concentración final en medio de la cultura 0,3 mm, encontrar el
tiempo que induce apoptosis.Después de que las células trataron con 30 ditaxin del mm para 0,
1, 2, 4, 8, 12, 16 y 24 horas, se encontraron los marcados cambios del morphological de
apoptosis de la célula como condensación de chromatin y las fragmentaciones nucleares usando
Hoechst 33258 que mancha claramente (Figura 12 y Figura 13). las células de Apoptotic
aumentaron gradualmente por un tiempo la manera dependiente en HeLa y CaLo las células
malignas. Apoptotic efectúan en HeLa y CaLo las muestras de células de cáncer humanas en
cuadros debajo:
38
0
25
50
75
100
0 2 4 6 8 10
Ditaxin Heteranthin extract
Figura 12. Apoptosis de células de cáncer HeLa por del ensayo
el Hoechst
0,00
30,00
60,00
90,00
0 2 4 6 8
Ditaxin Heteranthin extract
Figura 13. Apoptosis de células de cáncer CaLo por del ensayo
el Hoechst
39
Figure 13 muestras la apoptosis en diferentes tiempos después de la exposición a la ditaxina, el
cuerpo apoptotico se presenta 2h después de la exposición del ditaxin. Después de 12 de
incubación con ditaxina los organelos nucleares se condensaron, el tamaño del núcleo es más
pequeño.
8. Discusión.
Los resultados mostraron que la viabilidad celular en HeLa y CaLo las células de cáncer
cervicales humanas, era inversamente proporcional a la concentración del apocarotenoids
(contestación dosis-dependiente). Cuando las concentraciones de ditaxin, se aumentaron
heteranthin y extracto, la viabilidad de célula de cáncer fue disminuida. Este efecto podría ser
posible porque el ditaxin, heteranthin y extrae, pudo modificar ROS profundamente
(Palozza,2005; Carpintero, 2006) la producción en HeLa y CaLo células de cáncer cervicales
humanas causadas por propiedades químicas de ditaxin y heteranthin y produce cambios en
crecimiento de la célula. Probablemente, a las concentraciones altas los apocarotenoids
aumentaron la formación de radicales libres y por consiguiente, crecimiento de la célula
inhibido induciendo apoptosis. Hay informes que fuertemente sugieren que los productos de la
oxidación tienen efectos biológicos potencialmente, como involucró en tumor célula
crecimiento inhibición (Zhang et al, 2007). además, durante la oxidación del carotenoids formar
las especies de oxígeno reactivo se conocen (ROS) y los radicales libres. Se ha informado
(Palozza, 2002a,; Palozza, 2002b), que la habilidad de ß-caroteno inhiba crecimiento de la
célula incluso el melanoma, y ese carotenoid que la modificación inducido de ciclo de la célula
lleva a la inhibición de crecimiento de célula y inducción de apoptosis, y incubación de HL-60
(la célula del leukaemia linea) con -caroteno de ß producido un aumento significante en las
40
especies de oxígeno reactivo (ROS) (Sacha et al, 2005) En este experimento, el aumento de
concentraciones del ditaxin causó un efecto fuerte en viabilidad de la célula.
Nosotros encontramos los cytotoxicity efectúan de ditaxin después de 24 incubación de h en
toda la concentración usada (0.468; 0.938; 1.875 y 3.75 mm) en célula carcinogénica.
Diferencial se usaron líneas de célula de cáncer cervicales como una referencia para comparar
normal o no la célula de los epitelios carcinogénica. Las células del tumor son mucho más
sensibles al en pro de-apoptotic los efectos en el carotenoids que células normales que en
contraste son a menudo protegido del apoptosis por estas moléculas (Palozza, 2002b). En este
estudio mostró los ditaxin tenían efecto bajo contra células de McCoy comparadas a las células
de cáncer y indican especificidad contra las células de cáncer.
MTT y las muestras de los ensaye rojas Neutras el mismo behaviour con los compuestos
probado, mostrando diferencias en la efectividad de cada compuesto en la mortalidad de células
malignas uterinas cervicales (como mostrado en Figura 9 y 10), donde los ditaxin
constantemente muestran el efecto más alto en todos los tipos de la célula. Figure 11 efecto de
muestras del ditaxin, heteranthin y extracto completo de heterantha de D. adelante no la célula
del cancerinogenic. En este experimento por ensaye rojo neutro la concentración que causó
mortalidad de la célula sea 3.75, 7.5 y 15.0 mm por ditaxin y heteranthin, y 15.00 por extracto
completo. MTT ensayan muestras que los heteranthin causaron la mortalidad en todas las
concentraciones que se han usado, y por ditaxin y el extracto completo concentraciones 3.75, se
causaron 7.5 y 15.00 la mortalidad de no la célula del cancerinogenic. El Azafran de la bolita
podría estar seguro consumir en la dosis más baja. El valor de la diferencia entre el ensaye rojo
neutro y el ensaye de MTT fue ocurrido porque en las MTT ensaye medidas la disminución en
actividad del mitochondria de las células que a su vez pueden reflejar una disminución en
proliferación de la célula. En este caso MTT liberará el cytochrome C que llevó para liberar el
41
caspase 9 y igualmente probablemente es que refleja toxicidad que lleva a la pérdida de
viabilidad de la célula (Palloza, 2002b).
El ensaye Rojo Neutro mide la disminución en daño de la membrana de las células que a su vez
pueden reflejar una disminución en proliferación de la célula. En este experimento los
absorbance perseguían moderados 24 incubación de h con compuestos diferentes. El
cytotoxicity de células era asociado con la actividad del anti-oxidant de estos compuestos,
donde las actividades del anti-oxidant causadas por esta concentración (0.468 mm) de ditaxin,
heteranthin y extracto completo (McVaught, 1980), tiene efecto similar en viabilidad de la
célula por MTT y los ensaye Rojos Neutros. Ambos ensaye perseguía determinado 24
incubación de h con compuestos y " completamente el extracto de azafran de bolita que supone
el apoptosis fue ocurrido y mostró los valores del ensaye rojos Neutros eran más bajos que todos
de MTT ensaye valores. Los resultados de estos experimentos demostraron que ambos presente
de los compuestos activo en Ditaxis heterantha (ditaxin y heteranthin) tiene efecto en el HeLa y
CaLo las células malignas. Todos probaron que las células malignas mostraron una contestación
buena al efecto del Ditaxin y heteranthin. Se sabe bien que el proceso del apoptotic es esencial
para el desarrollo normal, diferenciación, y homeostatis del tejido. Se considera que la pérdida
del mando celular de mecanismo del apoptosis es un evento crítico en la iniciación, promoción o
progresión de cáncer (Thompson, 1995).
En este estudio, usando cáncer cervical humano HeLa y CaLo células líneas, nosotros hemos
mostrado que los efectos de ditaxin en proliferación de la célula y en la inducción de apoptosis
en una célula la manera específica. El microscopio de fluorescencia fue usado para observar los
cambios del morphological de Hela y células de Calo con o sin tratamiento de ditaxin. Después
del tratamiento con tiempo diferente de exposición, la morfología de Hela y células de Calo se
cambió incluso el encogimiento de la célula, fragmentación nuclear y condensación del
42
chromatin que eran los carácteres típicos de células del apoptosis. Mostró que ese ditaxin
indujeron el apoptosis en ambas líneas de célula de cáncer. El proapoptotic efectúa de ditaxin y
heteranthin que es influenciado profundamente probablemente por el tipo de la célula debido al
hecho que las células difirieron en su habilidad de incorporar el carotenoid. Según esta hipótesis,
las células de CaLo eran mucho más sensibles al en pro de-apoptotic el efecto de ditaxin y
heteranthin que las células de HeLa.
El envolvimiento de mitochondria en el en pro de-apoptotic los efectos de carotenoids han sido
demostrados claramente por el hecho que el ß-caroteno indujo el descargo de cytochrome c del
mitochondria y alteró la membrana del mitochondrial potencial en células del tumor diferentes
(Palozza et al, 2003). Los datos actuales son compatibles con la noción que la pérdida de
potencial de membrana de mitochondrial constituye un evento irreversible en el apoptotic del
profesional procese y ese agentes de cáncer de anti como ditaxin y heteranthin inducen
apoptosis provocando una ruptura de potencial de membrana de mitochondrial.
El mecanismo de apoptosis carotenoids-inducido no es muy aclare todavía. El cambio de
transición de permeabilidad de mitochondria se ha conocido para ser un mecanismo común y
crucial en muerte de la célula. Se ha encontrado que el permeabilization de membrana de
mitochondrial es un evento temprano de apoptosis. En la mayoría de los modelos de apoptosis,
las células manifiestan una ruptura del mitochondrial potencial del transmembrane interno que a
menudo precede degradación de ADN nuclear. Nuestro estudio mostró que la ditaxina podría
disminuir el potencial de trans-membrana de mitochondria. Por consiguiente, la pérdida de
transmembrane potencial probablemente tomó parte en ditaxin el apoptosis inducido. El
microscopio de fluorescencia se ha aplicado ferozmente a la biología de la célula incluso la
identificación del morphological de apoptosis, organización de chromatin, el apoptotic la
fragmentación de ADN (Palozza, 2005).
43
El estudio presente demostró que ese apoptosis inducido por ditaxin fue acompañado por un
aumento en mortalidad. Y el efecto de ditaxin en la mortalidad estaba en una concentración y
tiempo la manera dependiente. Nosotros observamos que nuestros compuestos ejercen una
actividad selectiva contra las células de cáncer, con un efecto bajo en el McCoy las células
normales.
9. Conclusiones
En general los efectos recogiendo la basura en el radical de DPPH aumentado grandemente con
concentración creciente de todas las muestras y normas. Los ARA más altos valoran de todo el
presente de los compuestos activo en D. heterantha semilla se encontró en ditaxin. Los
resultados obtuvieron en el estudio presente, es evidente que la interacción de un antioxidant
potencial con DPPH depende de su estructura estructural. Los TEAC valoran del ditaxin (0.99)
era significally más alto (p <0.05) que el astaxanthin (0.58), -caroteno (0.39), heteranthin (0.17)
y completamente el extracto de las semillas D. heterantha (0.37). Ditaxin demostró el
antioxidant más alto potencial con aproximadamente el triple la actividad de -caroteno. Las
aplicaciones del ensaye para extraer y los compuestos activos de Ditaxis heterantha son
complicados. A pesar de estas complicaciones, nosotros nos sentimos seguros que el TEAC es
una herramienta útil protegiendo la capacidad del antioxidant de puros antioxidants y " mezclas.
Para la aplicación del ensaye a comida los productos coloridos, más investigación se necesita,
sobre todo con respecto al solubilization de los compuestos en el ensaye. Éste es el primer
estudio y actividad de antioxidant de informe de heteranthin, ditaxin, y completamente el
extracto de D. Heterantha sembra por -caroteno-linoleic ácido que palidece métodos, DPPH que
radical-recoge la basura ensaye y ensaye de ABTS.
44
El ensaye del cometa, en varias guisas, se establece ahora bien como un método sensible para
los descansos de la cuerda detectores en el ADN de solas células. El resultado en el estudio
presente mostró esa capacidad de la protección de todos el ditaxin, heteranthin y extracto
completo de D, heterantha. sembra contra ADN oxidative daño es persona a cargo de la
concentración. La capacidad proteccionista de ditaxin en este estudio mostró el cola momento
aceituna valor más bajo como parámetro de oxidative de ADN dañe (trabajador migratorio de
ADN), siguiendo por completamente el extracto de semilla D. heterantha y heteranthin.
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