PROTEİNLERİN EKSTRAKSİYONU

KONSANTRASYONUSAFLAŞTIRILMASI

PLANLAMA VE STRATEJİ

• Protein ne için gereklidir?

• Onun eldesi için en uygun kaynak ne olabilir?

• Protein hakkında ne bilinmektedir?

• Protein nasıl analiz edilecektir?

Protein ne için gereklidir?

Proteinlerin

• Aminoasit kompozisyonunu ve dizilişini,

• Molekül ağırlığını ve

• Fiziksel özelliklerini öğrenmek için

• Proteinin aktivitesi,

• işlev ilişkileri incelemek üzerine olabilir.

Protein ne için gereklidir?

• Bu çalışmaların gereksinimleri, ne kadar saflaştırılmış protein gerektiği, aktive kaybının tolere edilebilirliği, nasıl bir saflıkta olabilirliği ve de proteinin saflaştırma zamanı ve maliyeti üzerinde belirleyici olurlar.

HANGİ KAYNAK KULLANILMALIDIR?

• İlgilenilen proteini en stabil ve en bol miktarda içeren kaynak seçilmelidir.

• Ayrıca kaynağın elde edilebilirliği ve miktarı da göz önüne alınmalıdır.

BİYOLOJİK MATERYALLERMİKROORGANİZMALAR

HAYVANSAL ÖRNEKLER

HAYVAN DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRLERİ

BİTKİLER VE BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ

PROTEİN HAKKINDA NE BİLİNMEKTEDİR?

• Proteinin en azından fiziksel ve kimyasal özelliklerinden bazılarının bilinmesi ve onun hücre içinde bulunduğu yer ekstraksiyon ve saflaştırma basamaklarının tasarımında yardımcı olacaktır.

• Eğer protein daha önce başka bir kaynakta izole edilmişse ona ait bilgilerin çoğu yeni bir kaynaktan proteinin izolasyonunda kullanılabilir.

• Proteinin hücre içi ya da dışı olması, çözünür, çözünmez yada membrana bağlı olması, hücre altı organellerde bulunması seçilen ekstraksiyon yöntemi ve kullanılan tampon çözelti bileşenlerini etkiler.

• Molekülleri doğrudan hücre içindeki durumlarıyla izlemeye yönelik bazı yöntemler de bulunmakla birlikte,

• moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde saflaştırılmış moleküllerle yapılan çalışmalara dayanmaktadır.

• Bu amaçla gerçekleştirilen işlemlere özütleme (ekstraksiyon) adı verilir.

• Özütleme sırasında ardışık iki temel uygulama aşaması (parçalama ve ayırma-saflaştırma) vardır.

• Bunun için öncelikle proteinin ekstre edileceği kültür, doku yada organın hazırlanır.

• Hayvan dokusu ile çalışılacaksa doku, kan ve diğer hücre dışı materyal kalıntılarını uzaklaştırmak için fizyolojik su veya tamponlanmış tuz çözeltisi ile yıkanır.

• Bitkisel materyal söz konusu ise, ilgili bitki kısmı toprak vb. kalıntılardan temizlendikten sonra küçük parçalara ayrılarak dondurulur veya kurutularak kullanılır.

• Mikroorganizmalardan ekstrakte edilecekse, hücreler santrifüjlendikten sonra tamponda süspanse edilirler.

• Daha sonra materyale uygun ekstraksiyon tamponu ile parçalama yöntemi seçilerek lizis edilir.

Protein denatürasyonundan ve inaktivasyondan korunmak için

çalışmanın her aşamasındapH ve SICAKLIK kontrol altında

tutulmalıdır!Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA (genelde 4oC’da) gerçekleştirilmesiyle önlenir.

pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur.

Ortam pH’sının 7 ve 7’ye yakın değerlerde olduğu koşulda en geniş çapta kullanılan tamponlar tris ve

fosfat tamponlarıdır.

TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT EDİLMESİ GEREKENLER:EDİLMESİ GEREKENLER:

• Çalışma pH’sı,Çalışma pH’sı,• Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması,Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması,• İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi,İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi,• Kimyasal etkinlik,Kimyasal etkinlik,• Biyolojik etkinlik,Biyolojik etkinlik,• Diğer bileşenlerle etkileşim,Diğer bileşenlerle etkileşim,• Biyolojik membranların geçirgenliği,Biyolojik membranların geçirgenliği,• Toksisite,Toksisite,• Maliyet,Maliyet,• ÇözünürlükÇözünürlük

Parçalama (Homojenizasyon)• Bu aşamada, çalışılacak molekül grubunu (nükleik

asit yada protein) içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir.

• Elde edilen yapıya homojenat denir.• Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta,

serbest yada organeller içerisindeki, hücre bileşenleri parçalamanın yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon halinde bulunurlar.

• Hangi yöntemin uygulanacağına kullanılan organizmanın doku ve hücre tipine veya amaçlanan çalışmaya göre karar verilir.

HOMOJENİZASYON:Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar

yapılarını parçalama işlemi

Fiziksel işlemler•Mekanik işlemler•Ultrasonikasyon•Ozmotik şok•Dondurma-çözme

Kimyasal işlemler•Çözücülerin kullanılması•Enzimlerin kullanılması

Mekanik İşlemler:ALETLİ HOMOJENİZASYON

Mekanik İşlemler:OZMOTİK ŞOK

Mekanik İşlemler:DONDURMA-ÇÖZME

Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak.....

Kimyasal İşlemler:Çözücülerin Kullanılması

Organik çözücülerDeterjanlar,

Bazik çözeltilerle...

BİYOLOJİK MOLEKÜLLERİN İZOLASYONU (EKSTRAKSİYON) :

MASERASYON

Kimyasal İşlemler:Enzimlerin Kullanılması

Lizozim,Tripsin,

Proteinaz K,Zimoliyaz gibi enzimlerle...

Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama yöntemleriparçalama yöntemleri

Teknik Materyal tipiNazikOzmotik şok EritrositlerEnzim uygulaması Bakteriler, mayalarDeterjan uygulaması Doku kültürü hücreleriHavan veya pistonlu homojenizatör Karaciğer vb yumuşak dokularDiğer aletlerle parçalama Kas vb. Dokular

Orta şiddetteMilli homojenizatörle par. Hayvansal ve bitkisel dokularKum, alumina vb. ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler

SertFransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakterilerUltrasonikasyon Hücre süspansiyonlarıBalistik parçalama Hücre süspansiyonları

Parçalama (homojenizasyon) Parçalama (homojenizasyon) yöntemleri uygulanarak doku yöntemleri uygulanarak doku veya hücrelerin çeper ve zar veya hücrelerin çeper ve zar

yapıları yok edilir.yapıları yok edilir.

Ele geçen ve çalışılacak Ele geçen ve çalışılacak molekül grubunu içeren molekül grubunu içeren

karışıma karışıma HOMOJENATHOMOJENAT denir. denir.

Ayırma (seperasyon) ve Saflaştırma (Pürifikasyon)

• Parçalamaya ardışık olarak, üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki diğer moleküllerden ayırıp saf şekilde elde etmeye yönelik bir seri işlem uygulanır.

• Bu işlemler homojenattaki molekül gruplarının genellikle çözünme özelliklerine ya da kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel özelliklerine göre birbirlerinden ayrılmalarını sağlayan yöntemleri kapsarlar.

• Bir makromolekülün izolasyon ve saflaştırılmasında genellikle çeşitli teknikler ardışık olarak kullanılmaktadır.

• Bu yöntemlerin başlıcaları şunlardır:• Süzme (filtrasyon)• Çöktürme• Enzim uygulaması• Santrifüjleme• Kromotografi• Elektroforez

SÜZME (FİLTRASYON)SÜZME (FİLTRASYON)

Moleküler biyolojide en çok Moleküler biyolojide en çok kullanılan filtre edici materyaller:kullanılan filtre edici materyaller:

• Müslin (tülbent veya gazlı bez)Müslin (tülbent veya gazlı bez)• Filtre kağıdı Filtre kağıdı (bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324)(bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324)

• Sinterli cam huniSinterli cam huni• Membran filtreler Membran filtreler (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s. (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s.

324)324)

Membran filtreler veya ”membranlar” özgül por çaplarına sahip polimer filmlerden oluşur.Porlardan geçemeyecek büyüklükteki partiküller ve mikroorganizmalar için fiziksel bir bariyer oluşturur ve bunları zarın yüzeyinde tutarlar.

ULTRAFİLTRASYONULTRAFİLTRASYON

Moleküllerin boyut, biçim Moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ve/veya yüklerine göre

ayrılmasını sağlar.ayrılmasını sağlar.

Centricon tipiCentricon tipiultrafiltrasyon ultrafiltrasyon

tüpütüpü(vakumdan (vakumdan yararlanılır)yararlanılır)

Kapan hücresiKapan hücresi(basınçtan (basınçtan yararlanılır)yararlanılır)

SANTRİFÜJLEMESANTRİFÜJLEME

Santrifüjler yardımıyla yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışına göre ayırım sağlayan teknik

Santrifüjleme sonundaÜst faz (sıvı faz)“süpernatant”

Alt faz (çökelti)“pellet”

Homojenattaki zar (membran) Homojenattaki zar (membran) parçalarını, parçalanmamış parçalarını, parçalanmamış doku ve hücreleri doku ve hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uzaklaştırmak amacıyla uygulanan uygulanan ÖN AYIRMAÖN AYIRMA işlemlerinden sonra ele geçen işlemlerinden sonra ele geçen sıvıya sıvıya HAM ÖZÜT adı verilir.adı verilir.

• Laboratuvarda protein ekstraksiyonu aşamasından sonra santrifüjleme ve elektroforez yönteminden yararlanacağız.

Protein Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Konsantrasyonun belirlenmesi için kullanılan 4 metot vardır;

• A280/A260 (Warburg-Christian yöntemi)• Biuret yöntemi• Boya-bağlama (Bradford) yöntemi• Lowry yöntemi

Bu yöntemler protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi veya bir belirteç ile reaksiyonu sonucu oluşan renkli bir bileşiğin görünür alanda spektral olarak belirlenmesine dayanır.

a) Biüret Yöntemi

Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir.

Reaksiyonun temeli belirteçteki bakır iyonlarının (Cu+2) peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540-560 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleksin oluşumuna dayanır.

Cu+2 iyonlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit çeşitlerinin ölçümler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.

Proteinler amid grupları içerirler. Bir amino grubu ile bir karboksil grup

peptit bağı ile birbirine bağlandığında, amino grupları bir amid grubu

oluştururlar. Bu yüzden, uygun pH’ta proteinler bakır iyonlarıyla bir kompleks

oluştururlar.

Buna biüret reaksiyonları denir. Bu reaksiyon protein konsantrasyonu ölçümlerinde kullanıldığında biüret

protein tahlili adı verilir.

• Biüret Yönteminin Amacı

• Konsantrasyonu bilinmeyen maddelerin

standart eğriden tayin edilmesi

Lowry yöntemi alkali koşullarda meydana gelen iki farklı reaksiyona dayalıdır.

Hassasiyet aralığı 5 - 100 μg/ml’dir.

Bunlardan birincisi amid bağları ile bakır iyonları arasında meydana gelir ve indirgenmiş bakır oluşumu ile sonuçlanan Biüret reaksiyonudur.

İkincisi ise Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenmesidir.

İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir

Lowry yöntemi

*Warburg-Christain yönteminde, çalışılan *Warburg-Christain yönteminde, çalışılan çözeltinin UV absorbsiyonu doğrudan ölçülür çözeltinin UV absorbsiyonu doğrudan ölçülür

ve protein derişimi hesap yoluyla bulunur.ve protein derişimi hesap yoluyla bulunur.*Diğer yöntemlerde ise belirteçlerle işlem *Diğer yöntemlerde ise belirteçlerle işlem

sonucu oluşan renkli bileşiğin absorbsiyonu sonucu oluşan renkli bileşiğin absorbsiyonu belirlenir ve derişimleri bilinen satandart protein belirlenir ve derişimleri bilinen satandart protein

çözeltilerinin ortaya koyduğu verilerle çözeltilerinin ortaya koyduğu verilerle karılaştırılır.karılaştırılır.

Warburg-Christian Yöntemi

Warburg-Christian Yöntemi

Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok proteinin 280 nm’de maksimum absorbsiyon gösterme özelliğinden yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için kullanılan hızlı bir yöntemdir.

Çok duyarlı değildir.

Kolaydır ve hızlı sonuç verir.

Warburg-Christian Yöntemi

260 nm’de maksimum absorbiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon yetenekleri olduğundan nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba ekstreler ile çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir.Bunun önüne geçmek için Warburg ve Christian tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü kullanılır.

Protein çözeltisinin saflık derecesi yükseldikçe hatalar da en aza indirgendiğinden,bu yöntem daha çok yarı saf ve saf protein çözeltilerine uygulanır.

Warburg-Christian Yöntemi

İşlem şu şekilde yapılır :

Protein çözeltisinin 280 nm ve 260 nm’deki absorbansı ölçülür.

A280 / A260 oranı hesaplanır.

Tablodaki değerlerden hata düzeltme faktörü bulunur.Faktör,formülde yerine konularak protein derişimi hesaplanır. Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = Faktör x A280

A280/A260 oranı Nükleik Asit(%) Faktör

1.75 0.00 1.116

1.63 0.25 1.081

1.52 0.50 1.054

1.40 0.75 1.023

1.36 1.00 0.994

1.30 1.25 0.970

1.25 1.50 0.944

1.16 2.00 0.899

1.09 2.50 0.852

1.03 3.00 0.814

0.979 3.50 0.776

0.939 4.00 0.743

0.874 5.00 0.682

0.846 5.50 0.656

0.822 6.00 0.632

0.804 6.50 0.607

0.784 7.00 0.585

0.767 7.50 0.565

0.753 8.00 0.545

0.730 9.00 0.508

0.705 10.00 0.478

0.671 12.00 0.422

0.644 14.00 0.377

0.615 17.00 0.322

0.595 20.00 0.278

Warburg-Christian Yöntemi

Schleif ve Wensink, sadece 280 nm ve 260 nm’de ölçülen absorbanslardan giderek yaklaşık protein miktarının hesaplanabileceği bir formül geliştirmişlerdir:

Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = 1.5 x A280 - 0.75 x A260

Boya Bağlama (Bradford) Yöntemi:

• Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının farklı

• konsantarsyonlardaki protein çözeltilerinde değişik şiddette

• mavi renk ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir.

• Boyanın özellikle arginin gibi bazik amino asitler ve

• Bazı aromatik amino asitlere bağlanma eğiliminde olduğu gösterimiştir.

• Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi• vardır.• Duyarlılık sınırları, total reaksiyon karışımında (5.1 ml)• 20-140 μg olan bu yöntemde (örnek konsantrasyonunun• 0.2-1.4 mg/ml arasında olması demektir) asidik boya• proteine bağlanır ve 495-595 nm arasında maksimum• absorbsiyon değerleri elde edilir.• Bu deneyde standart protein olarak miktarı belirlenecek• proteinin kendisi kullanılırsa en doğru sonuç alınır.• Standart olarak çoğunlukla kullanılmakta olan sığır serum• albumininden (bovine serum albumin, BSA) yararlanılabilir,• ancak BSA, boya bağlama kapasitesinin fazla olması• nedeniyle, Bradford deneyinde diğer yöntemlere göre daha• yüksek değerler ortaya koyar.• Bu da protein miktarının gerçeğinden daha düşük çıkmasına• yol açar.• Bu nedenle standart protein olarak sığır γ-globulin ya da• yumurta albumini tercih edilir.

Araç ve Gereçler

• 1 mg/ml standart bovine serum albumin (% 0.9 NaCl içinde),• % 0.9 NaCl• Distile Su• Bradford çözeltisi;• 25 mg Coomasie brillant blue G-250, 12.5 ml %95 etanolde

çözündürülüp, 25 ml %85• fosforik asit (H3PO4) eklenir. Bu boya çözeltisi 250 ml’ye

tamamlanır. Kullanılacağı• zaman 5 kere sulandırılır. Whatman no.1filtreden geçirilir ve bir cam

şişede, oda• sıcaklığında saklanır. Kullanılmadan kalan Bradford stok çözeltisi

ortalama 1 yıl 4oC’de• saklanabilir.• Test Tüpü• Pipet (1 ve 5 ml. lik pipet)• Kolorimetre tüpler

İzlenecek Yol

İzlenecek Yol• 1) Kör tüpü (1 no.lu tüp) ve Örnek tüpleri (7 ve 8 no.lu tüpler) hariç bütün

tüplere tabloda verilen miktarlarda (µl) BSA (Standart Serum Albumin) ilave edin.

• 2) 7 ve 8 no.lu tüplere, farklı konsantrasyonlarda ancak bizim derişimlerini bilmediğiniz protein örneğinden 20-100 µl arası ekleyin. Eğer 100 µl’den az örnek kullandıysanız son hacmi su ile 100µl’ye tamamlayın.

• 3) Bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda d-H2O (distile su) ekleyin• 4) Bütün tüplere 5.9 ml NaCl ekleyerek hacimleri 6 ml’ye tamamlayın• 5) Bütün tüplere 1’er ml Bradford çözeltisi ilave edin.• 6) Oluşan rengin sabitlenmesi için 10 dakika bekleyin.• 7) 595 nm ye ayarlı spektrofotometrede 1 numaralı kör tüpüne karşı

2,3,4,5,6, 7. ve 8. tüplerin absorbanslarını okuyun ve kaydedin.• 8) 2,3,4,5 ve 6. Tüpler için okuduğunuz absorbans değerlerini ordinatta

(y ekseni),bu tüplerdeki BSA derişimlerini absiste (x eksenine) göstererek Standart grafiği çizin.

• 9) Bu standart grafiği kullanarak derişimini bilmediğiniz 7 ve 8 no.lu tüpteki örneklerinizin protein derişimini bulun ve kaydedin.

Protein miktarlarına göre renk göstergesi (en sağdaki tüp kör tüpüdür)

ELEKTROFOREZSDS-PAGE

• Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayrılmaları temeline dayanan elektroforez tekniği proteinlerin analizinde ve ayrılmasında da geniş çapta kullanılır.

• Temelde protein tanımlama (molekül ağırlığını, oligomerik mi, monomerik mi olduğunu, miktarını, saflığını belirlemek vb) ve saflaştırma amacıyla kullanılan bu yöntem doğal veya rekombinant bir proteinin sentezlenip sentezlenmediği; sentezleniyorsa işlevsel olup olmadığı hakkında da bilgi verir.

Elektroforez Cihazının Parçaları

SDS-PAGESodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Gel Elektroforezi

• Proteinlerin elektroforetik ayrımında nişasta, agaroz ve selüloz asetat gibi çeşitli jeller kullanılmakla birlikte, genelde en iyi ayrışımın sağlandığı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) tekniği uygulanır.

• PAGE'de destek matrisi olan poliakrilamid, akrilamid monomerlerinin çapraz bağlayıcı ("cross-linker") moleküller (N,N'-metilen-bis-akrilamid, kısaca bis) yardımıyla kovalent olarak bağlanmasından oluşan bir polimerdir.

POLYACRYLAMIDE MATRIX

SDS-PAGE

Jelin Boyanması

• Elektroforetik ayırım bittikten sonra jel Coomassie blue ile en az 30 dakika boyanır.

• Boyama işlemi tamamlandıktan sonra jel, yıkama tamponu ile yaklaşık 2 saat boyunca yıkanır ve fazla boya uzaklaştırılır. Bu işlem protein bantları belirmeye başlayana kadar yapılır.

Protein Jelin Analizi• Polipeptidin molekül ağırlığının 10 tabanına göre

logoritması ile jeldeki göç hızının bir ifadesi olan Rf değeri arasında doğru orantı vardır.

• Rf değeri, jelin üst kısmından bandın bulunduğu yere kadar olan mesafenin, jelin üst kısmından işaret boyasının olduğu yere kadar olan mesafeye bölünmesi ile elde edilen sabit bir sayıdır.

• Bu değer yardımıyla standart eğri hazırlanır. Standart eğri, standart polipeptidlerin Rf değerleri ile molekül ağdıklarının log10 değerlerini gösterir.

• Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri standart eğride bulunarak molekül ağırlığının logoritmik değeri belirlenir. Bu değerin antilogoritması molekül ağırlığını verir.