PCR quantitativa “Real-Time” PCR quantitativa “Real-Time” e sue applicazioni in ambito e sue applicazioni in ambito

biomedicobiomedico

Laboratorio di Oncoematologia PediatricaDott.ssa Virginia Libri

RT-PCR convenzionaleRT-PCR convenzionale Retrotrascrizione dell’RNA in cDNARetrotrascrizione dell’RNA in cDNA

Oligo d(T)Oligo d(T)Random esameriRandom esameriPrimer specifico per il genePrimer specifico per il gene

Amplificazione del cDNA tramite PCRAmplificazione del cDNA tramite PCRTradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi:Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi:Denaturazione,Annealing,EstensioneDenaturazione,Annealing,Estensione

Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi)Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi)

Gli ampliconi sono ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di amplificazioneVengono fatti migrare su un gel di agarosio

Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio

Amplificazione selettiva in vitro di una sequenza di DNA target

COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCRCOMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR:

1)1) Sequenza di DNA targetSequenza di DNA target

2)2) DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile (Termophilus (Termophilus aquaticus, Taq polimerasiaquaticus, Taq polimerasi))

3)3) Due oligonucleotidi (15-25 bp) specifici per Due oligonucleotidi (15-25 bp) specifici per la sequenza targetla sequenza target

4)4) dNTPsdNTPs

Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio

CICLI TERMICI:CICLI TERMICI:

DENATURAZIONEDENATURAZIONE(94-96°C)(94-96°C)

ANNEALINGANNEALING(50-65°C)(50-65°C)

EXTENSIONEXTENSION(72°C)(72°C)

Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR CyclesPolymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles

DNADNAfragmentfragment

to beto beamplifiedamplified

22 copiescopies 44 copiescopies 88 copiescopies

Polymerase Chain Reaction: Polymerase Chain Reaction: vantaggivantaggi

1) Velocità e facilità d’usoIn poche ore si possono ottenere milioni di copie In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA targetdella sequenza di DNA target

2) SensibilitàVirtualmente è possibile utilizzare il DNA di una Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template (contaminazione)singola cellula come template (contaminazione)

3) RobustezzaAmplificazione possibile anche utilizzando DNA di Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualitàbassa qualità

Polymerase Chain Reaction: Polymerase Chain Reaction: svantaggisvantaggi

1) Solo sequenze noteNecessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers

2) Dimensioni e quantità limitateDimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kbQuantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio

3) ProofreadingTaq polimerasi manca dell’attività 3’Taq polimerasi manca dell’attività 3’5’ 5’ esonucleasica, 20 cicli di reazione su un esonucleasica, 20 cicli di reazione su un frammento di 1 kb produrranno frammento di 1 kb produrranno 40% di frammenti 40% di frammenti con una mutazione puntiforme (con una mutazione puntiforme (1/10000)1/10000)

Polymerase Chain Reaction: resaPolymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2n

P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)

Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza

Lo

g[D

NA

]

N° ciclitermici

EsponenzialeEsponenziale

LineareLinearePlateauPlateau

Prodotto Prodotto variabilevariabile

Polymerase Chain Reaction: plateauPolymerase Chain Reaction: plateau

Resa effettiva: effetto plateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:

Quantità dei primers

Attività della Taq polimerasi

Reannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Il plateau non dipende da TIl plateau non dipende da T

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40Cycle

PC

R p

rod

uct

Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è

raggiunto in tempi diversi ed in cicli diversiraggiunto in tempi diversi ed in cicli diversi

SoluzioniSoluzioni

Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenzialeUtilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale

Il prodotto di PCR è proporzionale al template inizialeIl prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale

Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCRfluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR

La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

RT-PCR convenzionaleRT-PCR convenzionale

Manual or Manual or automated automated

analysisanalysis

ReverseReverse transcriptiontranscription

PCRPCR reactionreaction

NestedNestedPCR reactionPCR reaction

GelGelelectrophoresiselectrophoresis

DNADNAsequencingsequencing

Southern Southern blotblot

Real-time RT-PCRReal-time RT-PCR

ReverseReversetranscriptiontranscription

PCR reaction PCR reaction Quantitative Quantitative

resultresult

Perché Real-Time?Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

RT-PCR quantitativaRT-PCR quantitativa

PlotPlot linearelineare

Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza

Cicli di PCR Cicli di PCR

•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Analisi tramite softwareAnalisi tramite software

•La fluorescenza si genera durante la PCR per

effetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sul

legame di coloranti fluorescenti che si intercalano

nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,

sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Real-Timeper PCR Real-Time

SYBR GreenSYBR Green

SYBR Green ISYBR Green: principioSYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si

lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR GreenSYBR Green

Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR GreenSYBR Green

Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del

numero di copie dell’amplicone

SYBR GreenSYBR Green

SYBR greenSYBR green

Metodica sempliceMetodica semplice

Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativaPossono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

Non costosaNon costosa

Non-specificaNon-specifica La molecola fluorescente si lega La molecola fluorescente si lega randomrandom a tutte le a tutte le

doppie eliche, includendo i dimeri di primersdoppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la È necessario ottimizzare la metodica per evitare la

formazione di prodotti aspecificiformazione di prodotti aspecifici

Curva di dissociazioneCurva di dissociazioneDopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati

e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

Tm

82.6 88.1

melting peak

Curva di dissociazioneCurva di dissociazione

TaqManTaqMan

TaqManTaqManLa Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:

coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano ( es. SYBR green), che si legano

in maniera in maniera aspecifica a tutto il DNA a tutto il DNA

sonde ad ibridazione, , specifiche per il frammento di per il frammento di

interesse, marcate con molecole fluorescentiinteresse, marcate con molecole fluorescenti

Esistono diversi tipi di sonde:Esistono diversi tipi di sonde:Dual-labeledDual-labeled (come le sonde TaqMan) (come le sonde TaqMan) Molecular beaconsMolecular beaconsScorpion Scorpion Sonde FRETSonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Sonde TaqManSonde TaqManLa sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i

primers della PCR, viene disegnato per essere primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificarecomplementare alla sequenza bersaglio da amplificare

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR

Primer

Primer3’3’

3’3’

3’3’3’3’

5’5’

5’5’5’5’

5’5’

R Q

5’5’ 3’3’

Dimensione dell’ampliconeDimensione dell’amplicone

Forward

ProbeReverse

Sonda TaqManSonda TaqMan

5’3’

Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”

Reporter-QuencherReporter-Quencher

Dye Quencher

5,6 FAM BHQ-1/TAMRA

HEX/JOE BHQ-2

Texas Red/ROX BHQ-2

Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)

6-carbossifluoresceina

6-carbossitetrametilrodamina

Reporter-QuencherReporter-Quencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette

fluorescenza 3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che

spegne la fluorescenza del reporter

5’ 3’

R Q

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

R Q

3’3’

5’5’

R

Q

3’ 5’5’

R Q

3’ 5’5’

Real-Time PCR: attività 5’>3’ esonucleasica

Forward primer

Reverse primer

Probe

L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente

proporzionale al numero di ampliconi generati

Real-Time PCR: la reazione

COMPONENTI DELLA REAZIONE:

1) DNA target

2) DNA polimerasi

3) Due oligonucleotidi

4) dNTPs

5) Probe fluorescente

50°C

2 min

95°C

3 min

55°C

30 s

65°C

1 min

50 cycles

ActivatesUNG (Uracile N-Glicosilasi)

Activates Amplitaq Gold

Run Real-Time thermal cycleRun Real-Time thermal cycle

15 s

Curve di amplificazioneCurve di amplificazione

Plot lineare

Cicli di amplificazione

Flu

ore

scen

za

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla

quantità di template iniziale

Plot di amplificazione

PCR cycle number

No

rmal

ised

re

po

rter

flu

ore

sc

en

ce

(R

n)

E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold

Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato

Linea soglia scelta dall’operatoreIn maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale

QuantificazioneQuantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto

Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione

assoluta (utilizzo di una standard curve)

Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche

quantità di campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT

Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una

standard curve)

Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro

CT con quello del controllo endogeno

Quantitativa assolutaQuantitativa assoluta

10 7

10 6

10 5

10 4

10 3

10 2

10 1

15

2 3 4 5 6 7

log10 quantity

Ct

unknown sample

3500 copies

35

25

1

Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (gene espresso costitutivamente (-actina, GAPDH, ATPs, -actina, GAPDH, ATPs, 2 2 etcetc))

Quantitativa relativaQuantitativa relativa

Plot di amplificazione

Numero di cicli

CT

SampleControl

Quantitativa relativa: analisi dei datiQuantitativa relativa: analisi dei dati

Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (espresso costitutivamente (CCTT))

Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb) (CT)

22- - ((CT,r- CT,r- CT,cbCT,cb)= 22- - CTCT

Il valore così ottenuto permette di determinare la Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target concentrazione relativa del target

Sonde FRETSonde FRET ((FFluorescenceluorescence R Resonanceesonance E Energynergy T Transferransfer))

Simili alle sonde TaqMan perché si legano al Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però sono però due sonde ognuna marcata con ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore)un solo fluorocromo (accettore e donatore)

Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato

Durante lo step di annealing PCR, entrambe le Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte un segnale fluorescente da parte

dell'accettore che viene rilevatodell'accettore che viene rilevato

donatoreaccettore

Molecular BeaconsMolecular Beacons

I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher non fluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide, non fluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide, che sono disegnate in modo da essere complementari tra loro che sono disegnate in modo da essere complementari tra loro formando una struttura stem-loopformando una struttura stem-loop

Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodotto Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodotto amplificatoamplificato

fluoroforo quencher

La vicinanza del quencher al reporter fluorescente impedisce l’emissione di fluorescenza

Molecular BeaconsMolecular BeaconsDurante lo step di annealing PCR, Durante lo step di annealing PCR,

la sonda ibridizza alla sua la sonda ibridizza alla sua sequenza target: ciò separa il sequenza target: ciò separa il colorante fluorescente dal colorante fluorescente dal reporter, producendo un reporter, producendo un segnale fluorescentesegnale fluorescente

La quantità di fluorescenza La quantità di fluorescenza prodotta ad ogni ciclo, o dopo prodotta ad ogni ciclo, o dopo la PCR, dipende dalla quantità la PCR, dipende dalla quantità di prodotto specifico in quel di prodotto specifico in quel dato momentodato momento

A differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons nonA differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons non vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclocui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo

Amplicon

FRET

EXCITATIONE

ANNEALING

Probes : Scorpions Probes : Scorpions La progettazione delle La progettazione delle

scorpion probes è scorpion probes è

simile a quella delle simile a quella delle

molecular probes, con molecular probes, con

la differenza che al 3’ la differenza che al 3’

terminale del probe terminale del probe vi

è una sequenza, PCR

primer, che è specifica

per l’ estensione del

target

Questa sequenza è Questa sequenza è

legata al 5’ terminale legata al 5’ terminale

di un primer per di un primer per

mezzo di un “blocker”mezzo di un “blocker”

3’3’5’5’

Probes : ScorpionsProbes : Scorpions

Step 1

Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA

Scorpions primer

Probe

Target di DNA

Step 2

Durante il processo di denaturazione si verifica Durante il processo di denaturazione si verifica l’allontanamento del quencher l’allontanamento del quencher dal reporter e del dal reporter e del

primer di innesco dal DNA targetprimer di innesco dal DNA target

Probes : ScorpionsProbes : Scorpions

Q

RPrimer di innesco

DNA target

Step 3

Raffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un Raffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un

riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera

target specifica. Un primer non esteso viene quenciato target specifica. Un primer non esteso viene quenciato

Probes : ScorpionsProbes : Scorpions

Riassumendo:

Metodi di rilevamento della fluorescenza

SYBR Green TaqMan Molecular Beacons

Scorpion probe

Real-Time PCR: applicazioni

Quantificazione virale Quantificazione dell’espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualità e validazione dei saggi Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRDMRD

Tali elementi neoplastici, presenti ad un livello inferiore alla capacità di rilevazione delle metodiche convenzionali, sono in grado di espandersi e dare origine alla recidiva

Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche

MRD (MMRD (Minimalinimal R Residualesidual D Diseaseisease):):

TH (Tirosina Idrossilasi)TH (Tirosina Idrossilasi)Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi

delle catecolaminedelle catecolamine

HVA-VMAHVA-VMA

TH (Tirosina Idrossilasi)TH (Tirosina Idrossilasi)

Perché la scelta di studiare l’espressione della TH?

Le cellule di Neuroblastoma (NB) hanno la Le cellule di Neuroblastoma (NB) hanno la caratteristica di sintetizzare catecolamine, che risultano caratteristica di sintetizzare catecolamine, che risultano alterate nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker alterate nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB,ma tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB,ma non dagli altri tumori a piccole cellule rotondenon dagli altri tumori a piccole cellule rotonde

Pertanto lo studio di questo enzima può essere utilizzato Pertanto lo studio di questo enzima può essere utilizzato per identificare le metastasi midollari al momento della per identificare le metastasi midollari al momento della diagnosi e per monitorare lo stato della MRD in modo da diagnosi e per monitorare lo stato della MRD in modo da individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti in remissione clinicain remissione clinica

TH (Tirosina Idrossilasi)TH (Tirosina Idrossilasi) Possibile ruolo della TH come fattore prognostico negativo nel Possibile ruolo della TH come fattore prognostico negativo nel

Neuroblastoma (Neuroblastoma (Pession et al. . Oncology Reports 10:357-362,2003)

La concordanza con le analisi diagnostiche standard evidenziata La concordanza con le analisi diagnostiche standard evidenziata nello stadio IV consente di considerare la TH quale utile parametro nello stadio IV consente di considerare la TH quale utile parametro predittivo alla diagnosipredittivo alla diagnosi

Negli stadi localizzati, dove in 3/24 (12.5%) è stata osservata la Negli stadi localizzati, dove in 3/24 (12.5%) è stata osservata la positività isolata dell’espressione della TH suggestiva di positività isolata dell’espressione della TH suggestiva di infiltrazione midollare minima, questa indagine potrebbe infiltrazione midollare minima, questa indagine potrebbe rappresentare un valido strumento di approfondimento diagnosticorappresentare un valido strumento di approfondimento diagnostico

La valutazione della TH inoltre potrebbe entrare tra le analisi La valutazione della TH inoltre potrebbe entrare tra le analisi diagnostiche indici di contaminazione neoplastica di cellule diagnostiche indici di contaminazione neoplastica di cellule staminali emopoietiche periferiche o midollari raccolte in pazienti staminali emopoietiche periferiche o midollari raccolte in pazienti positivi alla diagnosi (positivi alla diagnosi (studio in corso))