PENUNTUNPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

1

PROGRAM PASCASARJANAUNIVERSITAS SRIWIJAYA

PALEMBANG2015

ACARA IMIKROBA YANG TERDAPAT DI UDARA

Tujuan :

Untuk mengetahui ciri-ciri koloni-koloni mikroba yang berasal dari udara.

Dasar Teori :

Cara untuk menghitung jumlah bakteri dalam udara mula-mula dipelajari oleh

Koch dengan menggunakan media padat dalam cawan petri yang terbuka dalam berbagai

waktu yang berbeda lamanya. Cawan-cawan itu dibiarkan supaya tumbuh koloninya,

kemudian jumlah koloninya dihitung. Ini adalah suatu cara yang sederhana untuk

menyelidiki udara tetapi secara kwantitatif tidak bisa, sebab cara ini tak menunjukan

jumlah organisme yang terdapat dalam suatu volum tertentu dari gas (udara). Tetapi

metode ini memberi hasil yang relatif dan umum digunakan untuk maksud ini.

Petri menyaring udara melalui suatu pipa yang berisi pasir yang telah diayak

melalui tapisan dengan mesh number 100. Suatu volum tertentu udara diisap melalui pasir

itu dan organisme yang terkumpul di pasir itu disuspensikan dalam larutan garam dengan

jalan mengocok pasir tersebut dengan larutan garamnya. Setelah itu suspensi dipipet dan

dicampur dengan agar-agar yang masih cair baru dituang ke petridish. Tahun 1909

American Public Health Association dengan resmi menggunakan modifikasi dari pada

“sand method”nya Petri sebagai standar prosedur bagi analisa bakteri di udara. Kemudian

berturut-turut : Ruchl juga menggunakan modifikasi dari metode Petri. Wells prinsipnya

menggunakan sentrifuge untuk pemisahannya. Hollsender dan Dalla Valle menggunakan

Funnel devine untuk sampling udara dan beberapa orang lainnya misalnya Luckicsh,

Taylor dan Holladay, Lemon dan sebagainya.

Demikian Kock selain bisa menghitung secara relatif jumlah organisme dalam

udara juga menemukan adanya bakteri dan spora lapuk dalam udara. Hal ini ternyata dari

2

koloni-koloni pada agar dalam cawan petri yang disimpannya. Koloni lapuk akan berbulu

sedang koloni bakteri bulat dan mengkilat.

Bahan dan Alat:

Medium NA, medium PDA, bahan untuk pewarnaan Gram (Kristal violet, iodine, alkohol,

safranin), cawan petri, gelas benda dan gelas penutup.

Cara Kerja :

- Letakkan masing-masing 2 cawan petri yang telah berisi medium NA (untuk bakteri)

dan 2 cawan petri yang berisi medium PDA (untuk jamur), buka tutupnya berturut-

turut selama 1 menit dan 5 menit pada 2 (dua) tempat yang berbeda

- Inkubasi pada inkubator suhu 37oC atau pada suhu kamar selama 2x24 jam

- Amati sifat morfologi koloni bakteri pada medium NA lempeng yang meliputi :

bentuk, warna, tepian, permukaan, garis tengah koloni dan jumlah koloni. Gambar apa

yang dilihat ! Permukaan (rata, mengkilap, kasar, suram dan tidak beraturan). Bentuk

(titik, bulat, teratur, bentuk benang, tipis, tebal, cembung, rata).

- Ambil dari masing-masing koloni bakteri yang berbeda untuk dilakukan pewarnaan

Gram dan laporkan sifat Gram dari masing-masing isolat bakteri yang diperoleh.

- Amati koloni jamur pada medium PDA yang meliputi : warna koloni, warna sebalik

koloni, dan ukuran diameter koloni.

- Amati morfologi jamur dengan membuat preparat basah pada gelas benda yang ditetesi

dengan asam laktat dan diamati menggunakan mikroskop.

3

ACARA IIMIKROBA YANG TERDAPAT DALAM TANAH

Tujuan :

Untuk mengetahui ciri-ciri koloni-koloni mikroba yang terdapat di tanah.

Dasar Teori :

Secara umum dapat dikatakan bahwa tanah adalah media yang baik sekali untuk

pertumbuhan bermacam-macam organisme. Hal ini terutama benar bagi tanah-tanah yang

telah ditanami atau dikerjakan. Organisme yang terdapat dalam tanah antara lain : bakteri,

ragi, lapuk, alga, diatom dan protozoa dimana termasuk didalamnya ialah amoeba,

flagellata, ciliata dan rotifera. Sebagai tambahan adalah nematoda, insekta dan sebagainya.

Karena kebanyakan dari organisme ini aerobik, maka organisme itu kebanyakan

terdapat pada lapisan permukaan tanah. Jumlahnya makin menurun bila makin dalam.

Tanah yang mendapat oksigen lebih banyak berisi lebih banyak organisme dari pada tanah

yang kurang mendapat oksigen. Jumlah dan macam organisme itu tergantung dari keadaan

tanah, dalamnya, musim dari tahun, reaksinya, jumlah zat-zat organik, temperatur,

kelembaban dan sebagainya. Karena organisme-organisme itu bermacam-macam

kebutuhannya untuk pertumbuhan, maka bermacam-macam pula media pembenihan yang

harus digunakan. Organisme-organisme itu mungkin aerob, anaerob atau fakultataif.

Banyak jenis-jenis organisme yang ada dalam tanah tumbuh bersama-sama dengan yang

lain, peristiwa simbiosis, sinergisme, komensalisma dan antagonisma adalah biasa terjadi.

Pada umumnya media yang sama dan metode yang sama pula digunakan untuk

penanaman dan isolasi bakteri heterotrof digunakan pula untuk pembiakan dan pemisahan

dari sebagian besar organisme yang terdapat dalam tanah, tetapi tanah terdiri beberapa

jenis organisme yang spesifik dan tak bisa tumbuh pada medium pembenihan yang biasa.

Media dan metode tertentu yang harus digunakan untuk maksud ini, termasuk dalam

mikroorganisme ini ialah bakteri yang menambah secara non-simbiotik, bakteri penambat

nitrogen, bakteri yang mengoksidasi S, jenis-jenis yang mereduksi sulfat, yang

menguraikan urea, bakteri yang menguraikan sellulosa dan jenis yang mengoksidasi

amonia.

Fungsi dari organisme dalam tanah yang penting ialah menguraikan berbagai

macam zat-zat organik yang berasal dari tumbuh-tumbuhan, hewan dan manusia.

4

Termasuk didalamnya, misalnya pupuk kandang, pupuk hijau, akar tanaman, pupuk-pupuk

organik dan hasil-hasil lain.

Persenyawaan-persenyawaan organik yang diberikan pada tanah sebagai hasil dari

kerja biologis termasuk berbagai gula, asam-asam amino, pentosan, sellulosa, lingnin,

protein, lemak, lilin, tannin dan pigmen. Hasil-hasil ini diuraikan lagi oleh organisme

dalam tanah yang mengakibatkan pembebasan konstituen organik dan anorganik yang larut

dalam air. Salah satu dari hasil anorganiknya misalnya NH3 yang digunakan dalam

kehidupan tumbuh-tumbuhan sebagai sumber nitrogen.

Bahan dan Alat :

6 cawan petri yang berisi medium NA (untuk bakteri) , 6 cawan petri yang berisi

medium PDA (untuk jamur), sampel tanah dari 2 tempat yang berbeda, pipet ukuran 1 ml,

6 tabung reaksi berisi akuades steril 9 ml, bahan untuk pewarnaan Gram (kristal violet,

iodine, alkohol, safranin), lampu bunsen, gelas benda, dan gelas penutup.

Cara Kerja:

- Tumbuk tanah hingga halus, timbang 1 gram dan masukan dalam tabung reaksi yang

berisi aquades steril sebanyak 9 ml.

- Lakukan pengenceran hingga 10-3, dengan cara dipipet 1 ml dari suspensi sampel di

atas masukan ke dalam aquades 9 ml (10-1), demikian seterusnya hingga pengenceran

10-3.

- Pipetlah 1 ml dari masing-masing sampel dan masukan ke dalam cawan petri steril dan

ditambahkan 15 ml medium NA dan medium PDA yang sudah dicairkan, ratakan

dengan menggerakan cawan petri membentuk angka delapan hingga homogen.

- Inkubasi pada suhu 37 0C selama 48 jam.

- Amati sifat morfologi koloni pada medium NA lempeng yang meliputi : bentuk, warna,

tepian, permukaan, garis tengah koloni dan jumlah koloni. Gambar apa yang dilihat !

Permukaan (rata, mengkilap, kasar, suram dan tidak beraturan). Bentuk (titik, bulat,

teratur, bentuk benang, tipis, tebal, cembung, rata).

- Ambil dari masing-masing koloni bakteri yang berbeda untuk dilakukan pewarnaan

Gram dan laporkan sifat Gram dari masing-masing isolat bakteri yang diperoleh.

- Amati koloni jamur pada medium PDA yang meliputi : warna koloni, warna sebalik

koloni, dan ukuran diameter koloni.

5

- Amati morfologi jamur dengan membuat preparat basah pada gelas benda yang ditetesi

dengan asam laktat dan diamati menggunakan mikroskop.

6

ACARA III

ANALISIS MIKROBIOLOGI AIR

Teori :

Air merupakan salah satu bahan yang digunakan dalam pengolahan pangan,

misalnya untuk pencucian bahan mentah dan alat-alat, perebusan dan sebagai medium

dalam pengolahan. Mutu makanan yang diolah sangat dipengaruhi oleh mutu air yang

digunakan dalam pengolahan. Air yang digunakan untuk pengolahan harus bebas dari

mikroba patogen maupun mikroba penyebab kebusukan makanan. Salah satu uji yang bisa

dilakukan untuk menganalisa kebersihan air adalah uji koliform. Koliform merupakan

suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dalam air,

karena salah satu jenis bakteri koliform yaitu Escherichia coli merupakan bakteri yang

berasal dari kotoran hewan maupun manusia. Adanya bakteri koliform di dalam air

menunjukan kemungkinan adanya mikroba patogen yang berbahaya bagi kesehatan.

Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam air biasanya digunakan metode MPN

(Most Probable Number) dengan cara fermentasi tabung ganda. Metode ini lebih baik bila

dibandingkan dengan metode cawan karena lebih sensitif dan dapat mendeteksi koliform

dalam jumlah yang sangat rendah di dalam contoh. Uji kualitatif secara lengkap terdiri dari

tiga tahap yaitu :

1. Uji Penduga

2. Uji Penguat

3. Uji Lengkap

Uji ini tidak selalu dilakukan secara lengkap, tergantung dari berbagai faktor misalnya

waktu, mutu air yang dibutuhkan, biaya, tujuan analisa air dan sebagainya.

Bahan :

- Contoh air dari 2 sampel air yang berbeda (air kali/air sumur)

- 6 tabung Lactose Broth (double strength) a 10 ml + tabung Durham

- 12 tabung Lactose Broth (single strength) + tabung Durham a 10 ml atau

- 12 tabung Lactose Broth (single strength) a 10 ml + tabung Durham

- 12 agar cawan EMB (Eosin Methylene Blue) Agar

- 1 tabung Litmus Milk

- 2 tabung Tryptone Broth

- 2 tabung Proteose Broth (Medium MR-VP)

- 2 tabung Koser Citrate Medium

7

- 2 tabung larutan pengencer a 5 ml

- 1 tabung larutan pengencer a 9 ml

- Pereaksi Kovac

- Pewarnaan metil merah

- Larutan 5 % alfa neftol

- Larutan 40 % KOH

- Pewarna Gram (kristal violet, iodin, alkohol, safranin)

Alat :

- Tabung reaksi, tabung Durham, jarum ose, gelas objek, pipet 1 ml dan 10 ml, mikroskop,

inkubator 30-32 0C dan 350C.

Cara Kerja :

1. Uji Penduga Koliform

Setiap kelompok melakukan uji MPN menggunakan 9 tabung (@ 3 seri) Lactose

Broth dengan contoh seperti pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1. Volume sampel air dan medium pada uji MPN 9 tabung

Contoh Jmlh Cth per tab Jmlh tab + tab Durham Jmlh Medium per tab

Air sumur

Air kali

10 ml1,0 ml0,1 ml

1,0 ml0,1 ml0,01 ml(0,1 ml dari pengenceran10-1)

333

333

10 ml (Double strength)10 ml (Single strength)10 ml (Single strength)

10 ml (Single strength)10 ml (Single strength)10 ml (Single strength)

Semua tabung diinkubasikan pada suhu 350 C selama 24-48 jam. Amati

pembentukan gas di dalam tabung Durham, dan tabung dinyatakan positif jika

pembentukan gas sebanyak 19 % atau lebih di dalam tabung Durham. Hitung MPN

penduga sesuai dengan tabel MPN 3 seri. (Lampiran 1).

2. Uji Penguat Koliform

Terbentuknya gas di dalam Lactose broth tidak selalu menunjukan jumlah bakteri

koliform karena mikroba lainnya juga ada yang dapat memfermentasi laktosa,

misalnya bakteri asam laktat dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu perlu

dilakukan uji penguat pada agar EMB.

8

Dengan menggunakan jarum ose. Inokulasi contoh dari tabung MPN yang

menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing pada agar cawan EMB

dengan goresan kuadran. Inkubasikan semua tabung pada suhu 35 0C selama 24 jam.

Pada agar EMB dapat dibedakan antara koloni koliform fekal (E. coli) dan koliform

non-fekal. Koloni fekal mempunyai diameter yang lebih besar (1.0-3.0 mm) berwarna

merah muda dan bagian tengahnya berwarna gelap seperti mata ikan. Hitung semua

cawan EMB pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan

koliform (fekal maupun non-fekal), dan hitung MPN penguat sesuai dengan tabel

MPN 3 seri (Lampiran 1).

3. Uji Lengkap Koliform

Pilihlah masing-masing satu koloni yang mewakili koliform fekal dan satu koloni

yang mewakili koloni koliform non-fekal. Buatlah pewarnaan gram dari masing-

masing koloni tersebut, dan sisanya masing-masing dilarutkan ke dalam 3 ml larutan

pengencer. Dari suspensi bakteri tersebut masing-masing diinokulasikan

menggunakan jarum ose ke dalam tabung berisi lactose Broth + tabung Durham.

Inkubasikan tabung pada suhu 35 0C selama 24-48 jam, dan amati adanya

pertumbuhan dan pembentukan gas. Koloni yang menunjukan reaksi gram negatif

berbentuk batang dan membentuk gas di dalam Lactosa Broth merupakan uji lengkap

adanya koloni koliform.

4. Uji Kualitatif Koliform

Uji yang dilakukan untuk mengetahui jenis koliform yang terdapat di dalam contoh

adalah uji IMViC. Dari suspensi bakteri yang dibuat pada percobaan no.4 masing-

masing diinokulasi menggunakan jarum ose ke dalam 3 tabung yang masing-masing

berisi medium yang berbeda yaitu Tryptone Broth, MR-VP Broth (Proteose Broth) dan

Koser Citrate Medium. Semua tabung diinkubasikan pada suhu 350C selama 2 hari,

kecuali sisa medium MR-VP untuk uji merah metil dimana inkubasi diperpanjang

sampai 5-7 hari. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji IMViC dapat dilihat pada Tabel

4.2 sedangkan reaksi spesifik koliform dapat dilihat pada Tabel 4.3.

Tabel 4.2. Medium yang digunakan pada uji IMViC dan reaksi yang terjadi.

Uji Media Produk akhir Reaksi Positif

Indol

Merah metil

Tryptone Broth

MR-VP (Proteose Broth)

Indol

Asam organik

Warna merah pada penambahan pereaksi KovacWarna merah pada penambahan indikator merah metil

9

Voges Proskauer

Sitrat

MR-VP

Koser Citrate Medium

Asetil Metil karbinol

Alkali (NH4OH)

Warna merah tua pada penambahan 5 % alfa-neftol dan 40 % KOHTimbulnya warna keruh karena adanya pertumbuhan

Tabel 4.3. Reaksi IMViC pada Escherichia coli dan EnterobacterReaksi IMViC Escherichia coli Enterobacter

IndolMerah MetilVoges ProskauerSitrat

++__

__+±

Laporan Pengamatan :

Tabel 4.4. Hasil Pengamatan analisa koliform terhadap air

Uji Air kali Air sumur

Pertumbuhan pada Litmus MilkUji Penduga :

Tabung (+) pada Lactose BrothMPN Penduga

Uji Penguat :Cawan (+) pada EMBMPN penguat

Uji Lengkap :Pewarnaan GramGas pada Lactosa Broth

Uji IMViCIndolMerah metilVoges-ProskauerSitrat

Kesimpulan (Jenis Koliform)

. . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . MPN/ml

. . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . MPN/ml I II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . MPN/ml

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . MPN/ml I II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

Berikan pembahasan mengenai hasil pengamatan tersebut.

10

DAFTAR PUSTAKA

Barton, L.L. 2005. Structural and functional relationships in prokaryotes. Springer Science. New York

Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual, 8th Edition. The McGraw−Hill Companies. New York.

Fardiaz, S. 1987. Penuntun Paraktek Mikrobiologi Pangan. Lmbaga Sumber Daya Informasi. IPB, Bogor.

Hadioetomo, Ratnasiri. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., dan Williams, S.T. (2000) : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. ed. A Wolters Kluwer Company, Tokyo.

Koch, A. L. 2006. The Bacteria: Their Origin, Structure, Function and Antibiosis. Springer. Dordrecht.

Oxoid, 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and Other Laboratory Services. 5-th. Ed. England by. Turnergraphic Ltd. Basingstoke.

Salle, A.J. 1943. Fundamental Principles of Bacteriology. McGraw-Hill Book Company, Inc. New York.

Salle, A.J. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. 5-th. Ed. McGraw-Hill Book Co., Inc. Ltd. Tokyo.

Seeley Jr, H.W. and P.J.V. Demark. 1972. W.H. Freeman and Company, San Francisco.

Soeroso, L. 1989. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

11

Lampiran 1.

Tabel Nilai MPN untuk tiga seri tabung

Jumlah tabung positif MPN* Jumlah tabung positif MPN*

Seri A Seri B Seri C Seri A Seri B Seri C0000

0000

0000

0000

1111

1111

1111

1111

0000

1111

2222

3333

0000

1111

2222

3333

0123

0123

0123

0123

0123

0123

0123

0123

< 0.03 0.03 0.06 0.09

0.03 0.061 0.092 0.12

0.062 0.093 0.12 0.16

0.094 0.13 0.16 0.19

0.036 0.072 0.11 0.15

0.073 0.11 0.15 0.19

0.11 0.15 0.20 0.24

0.16 0.20 0.24 0.29

2222

2222

2222

2222

3333

3333

3333

3333

0000

1111

2222

3333

0000

1111

2222

3333

0123

0123

0123

0123

0123

0123

0123

0123

0.0910.140.200.26

0.150.200.270.34

0.210.280.350.42

0.290.360.440.53

0.230.390.640.95

0.430.751.201.60

0.931.502.102.90

2.404.6011.00> 24.00

*Nilai MPN bakteri dari pengenceran yang di tengah (seri B)

12

Lampiran 2.DAFTAR KOMPOSISI MEDIA DAN REAGEN

KOMPOSISI MEDIA

1. Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB) pH 7,4

Pepton : 10 grLactose : 10 grBubuk Oxgall : 10 grHijau brilliant (Brilliant Green) : 0,0133 grAquades : 1 lt

2. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) pH 6,8

Pepton : 10 grLaktosa : 5 grSukrosa : 5 grK2HPO4 : 2 grEosin-Y : 0,4 grBiru Metilin (Methylene Blue) : 0,065 grAgar : 13,5 grAquades : 1 lt

3. Koser Citrate Medium pH 6,8

KH2PO4 (kalium dihidrogen pospat) : 1 grMgSO4 (magnesium sulfat) : 0,2 grNaH4HPO4.4H2O (Na-amonium pospat) : 1,5 grNa3C6H5O7.2H2O (Na-sitrat) : 3 grAquades : 1 lt

4. Lactose Broth (LB) pH 6,9

Beef extract : 3 grPentone : 5 grLactose : 5 grAquades : 1 ltJika membuat double strength lactose-nya 10 gr.

5. Nutrient Broth (NB) pH 7,4

Beef extract : 3 grPeptone : 5 grAquades : 1 ltJika membuat Nutrient Agar (NA) tambahkan Agar 15 gr.

6. Plate Count Agar (PCA) pH 7,0

Tryptone : 5 grYeast Extract : 2,5 grGlucose : 1 grAgar : 15 grAquades : 1 lt

13

7. Potato Dextrose Agar (PDA) pH 5,6

Potato : 200 grDextrose / Glucose : 20 grAgar : 15 grAquades : 1 lt

8. Proteose Broth (Medium MR-VP) pH 6,9

Polypentone : 7 grGlucose : 5 grK2HPO4 (kalium hidrogen pospat) : 5 grAquades : 1 lt

KOMPOSISI REAGEN

1. Alfa-naftol

5 % alfa-naftol di dalam 95 % etil alkohol

2. Larutan Pewarna Gram

2 2.1. Gram A a. Kristal violet (90 %) : 2 gr etanol (95 %) : 20 ml

b. amonium aksalat : 0,8 gr aquades : 80 ml kemudian campurkan antara larutan a dan b, bila masing-masing sudah larut

dengan baik.

Gram A juga dapat dibuat dengan bahan :Kristal violet : 5 grAnilin : 2 grAlkohol 95 % : 10 mlAquades : 20 ml

2.2. Gram BI2 (Iodine) kristal : 2 grKI (kalium Iodida) : 2 grAquades : 300 ml

2.3. Gram CAlkohol 95 % : 70 mlAseton : 30 ml

2.4. Gram DSafranin O : 0,25 grAlkohol 95 % : 10 mlAquades : 100 ml

14

3. Larutan Pewarna Endospora

3.1. Malachite Greenmalachite green oxalate : 5 graquades : 100 ml

3.2. Safraninsafranin O : 0,5 graquades : 100 ml

4. Larutan Pewarna Kapang (Lactofenol)

Phenol crystal : 20 grAsam laktat : 20 mlGliserin : 40 mlAquades : 40 ml

15