portofolio praktikum mikrobiologi

PORTOFOLIO PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Makalah ini disusun untuk Memenuhi Sebagian Tugas

Mata Kuliah Praktek Mikrobiologi

Disusun oleh:

1. Enggar Bagus Rakasiwi 11.012

2. Fathurrohman 11.016

3. Mega Ayu Anggraeni 11.028

4. Nurfidya Intan Permana 11.031

5. Septyana Elizabeth 11.039

6. Tika Merdiana 11.041

7. Tria Risky Pambudi 11.042

AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

PUTRA INDONESIA MALANG

2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sediaan farmasi seperti kosmetik, makanan serta obat-obatan merupakan bahan-bahan

yang digunakan dan erat kaitannya dengan kebutuhan manusia yang harus dipenuhi bagi

pemeliharaan, pertumbuhan. Oleh karena itu, berbagai sediaan farmasi sangat dibutuhkan

oleh setiap manusia agar segala kebutuhannya dapat terpenuhi dengan baik. Namun

sediaan farmasi juga dapat berperan sebagai sarana pengganggu kesehatan bagi manusia

karena dapat terkontaminasi oelh cemaran fisik, kimia maupun mikroba.

Hampir semua bahan dari sediaan farmasi tercemar oleh berbagai mikroorganisme

dari lingkungan sekitarnya. Beberapa jenis mikroba yang terdapat pada bahan pangan

adalah Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, kapang, kamir serta

mikroba patogen lainnya. Pencemaran mikroba pada bahan dari sediaan farmasi

merupakan hasil kontaminasi secara langsung maupun tidak langsung dengan sumber-

sumber pencemaran mikroba, seperti tanah, air, udara, debu, saluran pencernaan dan

pernafasan manusia maupun hewan. Hanya sebagian saja dari berbagai sumber pencemar

yang berperan sebagai sumber mikroba awal yang selanjutnya akan berkembang biak

pada bahan sediaan farmasi tersebut, tetapi apabila kondisi lingkungan memungkinkan

mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat, maka bahan dari sediaan farmasi

akan rusak karenanya.

Keamanan bahan-bahan yang digunakan pada sediaan farmasi sangat pentig dalam

menjamin bahan-bahan tersbut aman dan layak untuk dikonsumsi. suplai bahan-bahan

baku sediaann farmasi yang aman tidak hanya melindungi kesehatan masyarakat

Indonesia, tetapi juga meningkatkan kualitas generasi muda dengan sediaan farmasi yang

aman dan layak untuk dikonsumsi. indonesia telah memiliki standar nasional yang

berkaitan dengan keamanan produk-produk sediaan farmasi tersebut, yaiu Standar

Nasional Indonesia (SNI). Standar ini memuat bagaimana memproduksi produk sediaan

farmasi yang benar, bagaimana mengukur cemaran dan menyajikan batas maksimum

cemaran yang diperbolehkan. Standar ini diharapkan dapat memberikan jaminan

keamanan produk sediaan farmasi Indonesia.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah dalam sampel sediaan farmasi yang berupa sirup suspensi ibuprofen,

mayonaise dan bedak tabur merk “viva” terdapat cemaran mikroba?

2. Bagaimana cara mengidentifikasi adanya cemaran mikroba dalam sediaan farmasi

berupa sirup suspensi ibuprofen , mayonaise dan bedak tabur merk “viva” ?

3. Berapa banyak koloni yang ditemukan dalam percobaan identifikasi cemaran mikroba

dalam sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk “viva”?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui ada tidaknya cemaran mikroba dalam sampel yang diteliti berupa

sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk “viva”.

2. Untuk mengetahui cara dentifikasi cemaran mikroba pada sampel yang diteliti berupa

berupa sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk “viva”.

3. Untuk mengetahui banyaknya koloni cemaran mikroba pada sampel yang diteliti

berupa sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk “viva”.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Produk

Dalam pengujian mutu sutu produk sediaan farmasi yang meliputi makanan, minuman,

kosmetik dan obat-obatan diperlukan berbagai uji yang mencakup uji fisik, uji kimia, uji

mikrobiologi dan uji organoleptik. Uji mikrobiologi merupakansalah satu uji yang penting,

karena selain dapat menduga daya tahan simpan suatu produk farmasi, juga dapat digunakan

sebagai indikator sanitasi atau indikator keamanan produk farmasi tersebut. Pengujian

mikrobiologi diantaranya meliputi uji kualitatif untuk menentukan mutu dan daya tahan suatu

produk, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, dan uji

bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi produk tersebut.

Tabel Spesifikasi Persyaratan Mutu Mayonaise

No Jenis Uji Satuan Persyaratan

1 Keadaan Normal

1.1 Bau - Normal

1.2 Rasa - Normal

1.3 Warna - Normal

1.4 Tekstur - Normal

2 Air, b/b % Maks 30

3 Protein, b/b % Maks 0,9

4 Lemak, b/b % Min 65

5 Karbohidrat, b/b % Maks 4

6 Kalori K cal/100g Min 600

7 Pengawet - Sesuai SNI 01-0222-1995

8 Cemaran logam

8.1 Timbal (Pb) mg/kg Maks 1,5

8.2 Tembaga (Cu) mg/kg Maks 10,0

8.3 Seng (Zn) mg/kg Maks 10,0

8.4 Timah (Sn) mg/kg Maks 10,0

8.5 Raksa (Hg) mg/kg Maks 0,03

9 Cemaran arsen (As) mg/kg Maks 0,1

10 Cemaran mikroba

10.1 ALT Koloni/g Maks 104

10.2 Bakteri bentuk coli APM/g Maks 10

10.3 E.coli Koloni/10g Negatif

10.4 Salmonella Koloni/25g Negatif

Tabel Spesifikasi Persyaratan Mutu Kosmetik

1. Persyaratan cemaran mikroba

Persyaratan

Pengujian

Kosmetika untuk:

i. Anak dibawah 3 tahun

ii. Area sekitar mata

iii.Membran mukosa

Kosmetika selain untuk:

i.Anak dibawah 3 tahun

ii. Area sekitar mata

iii.Membran mukosa

Angka lempeng total Tidak lebih dari 5x102 koloni/g

atau koloni/ml

Tidak lebih dari 103 koloni/g

atau koloni/ml

Angka kapang dan

khamir

Tidak lebih dari 5x102 koloni/g

atau koloni/ml

Tidak lebih dari 103 koloni/g

atau koloni/ml

P.aeruginosa Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml

sampel (contoh uji)

Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml

sampel (contoh uji)

S.aureus Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml

sampel (contoh uji)


sampel (contoh uji)

C.albicans Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml

sampel (contoh uji)


sampel (contoh uji)

2. Persyaratan cemaran logam berat

Jenis cemaran Persyaratan

Merkuri (Hg) Tidak lebih dari 1mg/kg atau 1mg/L (1 ppm)

Timbal (Pb) Tidak lebih dari 20 mg/kg atau 20 mg/L (20 ppm)

Arsen (As) Tidak lebih dari 5 mg/kg atau 5 mg/L (5 ppm)

2.2 Parameter Uji Cemaran Mikroba

A. Uji Angka Lempeng Total

Metode kuantitatif yang digunaan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada

pada suatu sampel, umumnyadikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka

Lempeng Total dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil

menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara

visual berupa angka dalam koloni (cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang

digunakan antara lain dengan cara tuang sebar, cara tetes dan cara sebar.

Prinsip pengujian ALT menurut metode analisis mikrobiologi yaitu pertumbuhan

koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasi pada media lempeng agar

dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujian Angka

Lempeng Total digunakan PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan

menggunakan PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya.

Hasil pengamatan dan perhitungan yang diperoleh dinyatakan sesuai persyaratan

sebagai berikut:

1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni

antara 25-250. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan

dengan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total

dari tiap gram atau tiap ml sampel.

2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25

atau lebih dari 250, dihitung jumlah rata-rata koloni. Kemudian dilakukan

faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dari tiap

gram atau tiap ml sampel.

3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan

menunjukkan jumlah koloni antara 25-250, maka dihitung jumlah koloni dari

masing-masing tingkat pengenceran, kemudian dikalikan dengan faktor

penegncerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi

diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni rata-

rata pengenceran dibawahnya, maka ALT dipilih dari tingkat pengenceran yang

lebih rendah. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi

diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari dua kali jumlah rata-raa pada

pengenceran dibawahnya maka ALT dihitung dari rata-rata jumlah koloni

kedua tingkat pengenceran tersebut.

4. Bila tidak ada satupun koloni dari cawan maka ALT dinyatakan sebagai < 1

dikalikan faktor pengenceran terendah.

Keuntungan dari metode pertumbuhan agar atau metode uji angka lempeng total

adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat

diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dari contoh. Adapun kelemahan dari

metode ini adalah:

1. Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba seperti

pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel. Kemungkinan ini

akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya.

2. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena

penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa

inkubasi.

3. Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar diseluruh

permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan

mengakibatkan mikroba lin tersebut tidak terhitung.

4. Perhitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya

antara 30-300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan

menghasilkan perhitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih

dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang samakarena terjadi persaingan

diantara koloni.

5. Perhitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang

umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

B. Uji MPN Coliform

Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran

pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri

patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya bekteri coliform fekal adalah bakteri

indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi

indikator penecemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkolerasi positif dengan

keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat

dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh bakteri coliform

adalah Escherichia coli dan Enterobacter aerogenes.

Coliform adalah kelompok bakteri gram negatif berbentuk batang yang pada

umumnya menghasilkan gas jika ditumbuhkan dalam medium laktosa. Salah satu

anggota kelompok coliform adalah E.coli dan karena E.coli adalah bakteri coliform

yang ada pada kotoran manusia maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal.

Pendekatan lain untuk numerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN

didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya

digunakan untuk menghitung jumlah bakteri khususnya untuk mendeteksi adanya

bakteri coliform yang merupakan kontaminan. Ciri utamanya yaitu bakteri gram

negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam

dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada suhu 37oC.

Prinsip pengujian angka paling mungkin (MPN) coliformm menurut metode

analisis mikrobiologi yaitu pertumbuhan bakteri coliform setelah cuplikan diinokulasi

pada media cair yang sesuai, dengan mengamati adanya reaksi fermentasi dan

pembentukan gas dalam tabung durham. Pada pengujian MPN coliform digunakan PDF

(Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer, Mac Conkey Broth (MCB) dan Brilliant

Green Lactose Bile 2% Broth (BGLB) sebagai media cairnya.

C. Uji Salmonella

Salmonella adalah suatu genus bakteri enterobakteria gram-negatif berbentuk

tongkat yang menyebabkan tifus, paratifus dan penyakit foodbone. Spesies-spesies

Salmonella dapat bergerak bebas dan menghasilakn hidrogen sulfida.

Prinsip pengujian deteksi Salmonella menurut Metode Analisis Mikrobiologi

yaitu ada empat tahap untuk mendeteksi adanya Salmonella:

1. Pra pengkayaan dalam media cair non selektif yang diinkubasi pada 37± 1oC

selama 18± 2 jam.

2. Pengkayaan dalam media cair selektif yang diinkubasi pada 41,5± 1o C

selama 24 ± 3 jam dalam RVS cair dan 37± 1o C selama 24±3jam MKTTn

cair.

3. Inokulasi dan identifikasi dalam 2 media padat selektif, media selektif

pertama diinkubasi pada 37± 1oC selama 24 ± 3 jam dan dengan media yang

digunakan.

4. Konfirmasi terhadap identitas Salmonella dengan uji biokimia dan serologi.

Pada pengujian deteksi Salmonella digunakan Buffered Peptone Water (BPW)

sebagi media cair non selektif. Muller Kaufimann Tetrathionate Novobiocin Broth

(MKTTn) dan Rappapport Vassiliadis Medium + Soya (RVS) sebagai media selektif

cair, Bismuth Green Agar (BGA) dan Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) media padat

selektif untuk mengisolasi Salmonella.

D. Uji Escherichia coli

E.coli adalah gram negatif, anaerobik fakultatif dan non spora. Sel-sel biasanya

berbentuk panjangnya sekitar 2 mikrometer (µm) dan diameternya 0,5 (µm) dengan

volme sel 0,6-0,7 (µm). E.coli menggunakan fermentasi asam campuran dalam kondisi

anaerobik, mengasilkan laktat, suksinat, etanol, asetat dan karbondioksida.

Prinsip pengujian deteksi Escherichia coli menurut Metode Analisis Mikrobiologi

yaitu pertumbuhann koloni Escherichia coli pada media lempeng selektif dan dilanjutkan

dengan konfirmasi melalui uji biokimia. Pada pengujian deteksi Escherichia coli

digunakan Tryptic Soy Broth (TSB) sebagai media cair atau penegncer dan Eosyn

Methylen Blue (EMB) sebagai media lempang selektif.

Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang, uji indol positif

dan mampu memfermentasi berbagai karbohidrat seperti glukosa, laktosa, mannitol dan

arabinosa. Ada tiga media yang dapat digunakan untuk membedakan Escherichia coli

dan mikroba lainnya yaitu media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan

mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa

seperti Escherichia coli dengan mikroba yang tidak memfermentasi laktosa seperti

S.aureus, P.aeruginosa dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa

menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelapdengan kilap logam, sedangkan mikroba

lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya Eosin Methylene Blue

membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian jika media ini digunakna

pada tahap awal, karena mikroba lain juga tumbuh terutama P. Aeruginosa dan

Salmonella dapat menimbulakn keraguan. Bagaimanapun media Eosin Methylene Blue

sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.

E. Uji Kapang

Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi, ilmu yang

mempelajari mengenai fungi disebut mikologi. Fungi adalah organisme heterotrofik,

untuk nutrisinya memerlukan senyawa organik. Beberapa fungi hidup dari benda organik

mati yang terlarut, mikroorganisme ini disebut saprofit. Segi positif dari fungi berperan

penting dalam industri fermentasi dan produksi antibiotik seperti penisilin. Tetapi segi

negatifnya yaitu sebagai parasit pada tumbuh-tumbuhan, hewan dan manusia. Fungi

lebih besar dari bakteri, ukuran fungi berkisar 1-5 µm, lebar dan panjangnya 5-30 µm

atau lebih. Fungi dapat mensintesa protein dengan mengambil sumber karbon dari

karbohidrat (glukosa, sukrosa dan maltosa), sumber nitrogen dari bahan organik atau

bahan anorgani (ammoniium dan nitrat) dan mineral dari substratnya. Fungi atau kapang

adalah fungi multiseluler yang mempunyai filamen. Kapang adlaah mikroorganisme

aerobik sejati. Heterotrop, suhu optimum kapang saprofitik 22-30oC dan kapang patogen

30-37oC.

Kapang berlawanan dengan bakteri dan khamir, seringkali dapat dilihat dengan

mata. Sifat pertumbuhan yang khas adalah berbentuk kapas dan biasnya terlihat pada

kertas-kertas yang basah, kulit-kulit yang sudah usang, dinding basah, buah-buahan

yanng membususk dan bahan pangan lainnya seperti keju dan selai. Pertumbuhan dapat

berwarna hitam, putih atau berbagai macam warna. Secara biokimia kapang bersifat aktif

karena terutama merupakan organisme saprofitik. Organisme ini dapat memecah bahan-

bahan organik kompleks menjadi yang lebih sederhana termasuk pembusukan daun-daun

dan bahan lain dalam tanah. Kegiatan yang sama dapat menyebabkan pembusukan pada

pangan yang terjadi dimana-mana.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat yang digunakan

1. timbangan analitik

2. Inkubator

3. Stomacher

4. Gelas Ukur

5. Cawan Petri

6. Tabung Reaksi

7. Rak Tabung

8. Autoclave

9. Tabung durham

10. Blue tip

11. Mikropipet

3.2 Prosedur Kerja

3.2.1 Pembuatan media

a. Pembuatan media Buffered Pepton Water

Timbang pepto sebanyak 20 gram dan dimasukkan kedalam beaker glass dan

dilarukan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian

dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipndahkan

kedalam tabung masing-masing sebanyak 9 ml, kemudian disterilisasi

menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit.

b. Pembuatan media Plate Count Agar (PCA)

PCA ditimbang sebanyak 22,5 gram, dimasukkan kedalam beaker glass dan

dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian

dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih,disterilisasi dengan autoclave pada

temperatur 121o C selama 15 menit.

c. Pembuatan media Levine Eosin Methylene Blue Agar

L-EMB ditimbang sebanyak 37,5 gram dan dimasukkan kedalam beaker glass

dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian

dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan

kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi

menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit.

d. Pembuatan media Potato Dextrose Agar

PDA ditimbang sebanyak 39 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan

(dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan

diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam

tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan

autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit.

e. Pembuatan media Nutrient Agar

NA ditimbang sebanyak 23 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan





f. Pembuatan media Lactose Broth

LB ditimbang sebanyak 39 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan





g. Pembuatan media Manitoll Salt Agar

MSA ditimbang sebanyak 111 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan





h. Pembuatan Bacto Pepton

Larutkan 1 gram dan ditambah 9 ml NaCl kedalam 1 liter air destilasi (aquadest)

atau air deionsasi.Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.

Sterilisasi kedalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC.

3.2.2 Prosedur Analisis Cemaran Mikroba

Escherichia coli

1. Uji pendugaan coliform (presumtive test).

a. Siapkan pengenceran sampel 102 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke

dalam 9 ml larutan pengencer BFP. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai

dengan pendugaan kepadatan populasi

b. Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap

pengenceran ke dalam 3 seri tabung lauryl tryptose Broth (LTB) yang berisi

tabung durham.

c. Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC ± 1oC.

Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan

kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan

kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

d. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah

tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling

Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g coliform”

2. Uji pendugaan Escherichia coli

a. Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth

yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi EC

Broth dalam waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45oC ± 0,5oC.

Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari

tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.

b. Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2

jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif

ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

c. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah

tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling

Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g faecal coliform”.

3. Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)

a. Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose

gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC + 1oC.

b. Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu

hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.

c. Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing-masing

cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan

jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC+ 1oC.

d. Jika koloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang

tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.

Angka lempeng total

1. Timbang 2 gram atau pipet 25 ml sampel sampel dengan cara aseptis dan

masukkan kedalam kantong stomacher steril.

2. Tambahkan larutan PDF dan homogenkaan dengan stomacher selama 3 detik

sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 101 dan siapkan 5 tabung atau

lebih yang masing-masing telah diisi denga 9 ml PDF.

3. Hasil homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 101

dipipet sebanyak 1 ml kedalam tabung PDF pertama, dikocok homogen hingga

diperoleh pengenceran 102 dan buat higga penegenceran 106.

4. Dari setiap pengenceran dipipet 1 ml kedalam cawan petri yang dibuat duplo,

kedalam setiap cawan dituangkan 15-20 ml media PDA.

5. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspens

tersebar merata.

6. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-46 jam dengan posisi terbalik.

Setelah itu jumlah koloni yangn tumbuh diamati dan dihitung.

Uji Salmonella

1. Pipet 1 ml sampel pada setiap penegenceran kedalam cawan petri.

2. Tuangkan 15-20 ml mediaBGA (Bismuth Green Agar) atau XLD (Xylose

Lysine Deoxycholate).


tersebar merata.

4. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-46 jam dengan posisi terbalik.

Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

Uji Candida Albiccans

1. Buat media LB cair (Luria-Bertani) dengan melarutkan 1,0 g bacto tryptone,

0,5 g bacto yeast dan 1,0 g NaCl kedalam 100 ml aquadesr. Larutkan kemudian

disterilisasi dengan autoklaf selama 30 menit.

2. Pipet 1 ml sampel kedalam 15-20 ml media LB .


tersebar merata.

4. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik.

Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

Staphylocccus Aureus dan Pseudomonas Aeruginosa

1. Ke dalam 10 g atau 10 ml sampel ditambahkan medium Fluid Soybean Casein Digest

sampai 100 ml, dicampur dan diinkubasi selam 24 jam pada suhu 32,5oC ± 2.5oC.

2. Apabila ada pertumbuhan, sebanyak satu ose suspensi koloni digesekkan pada

permukaan medium Manitol Salt Agar (MSA) dan Centrimide Agar (CETA) dalam

petri, masing-masing untuk diidentifikasi Staphylocccus aureus dan pseudomonas

aeruginosa. Petri ditutup dan dibungkus dalam kondisi terbalik serta diinkubasi pada

suhu 32,5oC ± 2.5oC selama 48-72 jam.

3. Apabila tidak ada pertumbuhan, sampel dinyatakan bebas Staphylocccus Aureus dan

Pseudomonas Aeruginosa. Apabila ada pertumbuhan koloni pada medium MSA

dengan karakteristik warna kuning dan zona kuning, dilanjutkan dengan uji koagulase.

Apabila dijumpai koloni dengan zona kehijauan pada medium CETA maka dilanjutkan

dengan uji oksidase dan fluorosensi di bawah sinar ultra violet. Pada Staphylococcus

Aureus dengan media selektif berupa MSA menghasilkan koloni cembung, warna

kuning dan warna merah berubah menjadi jernih.

4. Uji koagulase dilakukan dengan cara memindahkan satu ose koloni yang dicurigai dari

media MSA kedalam tabung yang berisi 0,5 ml plasma kelinci, diinkubasi dalam tangas

air pada suhu 37o . pengamatan dilakukan setiap tiga jam selama 24 jam. Uji terhadap

kontrol positif dan kontrol negatif dilakukan dengan cara yang sama secara simultan.

Apabila tidak terjadi koagulasi, maka sampel dinyatakan bebas Staphylocccus Aureus.

5. Uji oksidase dilakukan dengan cara meltakkan kertas saring yang telah diimpregnasi

dengan larutan N’N-dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorid 1% diatas permukaan koloni

yang dicurigai pada media CETA. Apabila tidak terbentuk warna pink yang berubah

menjadi biru dalam waktu 20-60 detik, sampel dinyatakan bebas Pseudomonas

Aeruginosa.

6. Uji fluorosensi dan piosianin dilakukan dengan cara menggesekkan koloni yang

dicurigai pada permukaan media Agar Pseudomonas F (APF) dan media agar

Pseudomonas P (APP) dalam petri yang ditandai untuk dibagi menjadi 4 bagian

(masing-masing dapat digesekkan koloni yang dicurigai secara terpisah). Petri ditutup

dan dibungkus dalam kondisi terbalik serta diinkubasi pada suhu 35o± 2o C selama tidak

lebih dari 3 hari. Apabila pada media APF tidak dijumpai koloni berwarna kuning

kehijauan dan berfluorosensi kekuning-kuningan dibawah sinar UV, sedangkan pada

media APP tidak dijumpai koloni berwarna hijau kebiruan serta berfluorosensi kebiruan

dibawah sinar UV, maka sampel dinyatakan bebas Pseudomonas Aeruginosa. Untuk

penegasan hasil uji sebanyak 1 g koloni yang berpigmen dari media APF dan APP

masing-masing dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambah 1 ml air suling dan

dikocok, kemudian ditambah 1 ml kloroform dan dikocok. Fluorosensi akan larut dalam

air, dan tidak larut dalam kloroform, sedangkan piosianin larut dalam air dan larut

dalam kloroform.

portofolio praktikum mikrobiologi

Documents