LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

ACARA VIII

UJI CEMARAN MIKROBA: ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA

KAPANG KHAMIR (AKK)

Disusun oleh :

Nama : Vivo Puspitasari Ana Maria

NIM : 118114030

Kelompok : B 1

Tanggal : 3 Mei 2012

PJ Laporan :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

ACARA VIII

UJI CEMARAN MIKROBA:

ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

A. TUJUAN

1. Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam

produk makanan.

2. Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh mengandung

mikroba melebihi batas yang ditetapkan karena berbahaya (toksik)

bagi kesehatan.

B. DASAR TEORI

Khamir yang lebih besar daripada kebanyakan bakteri timbul apabila

organism hidup sebagai parasit atau pathogen dalam jaringan, sedangkan

dalam bentuk kapang apabila organism tersebut merupakan saprofit dalam

tanah atau dalam medium laboratorium (Tortora, 2010).

Khamir itu bersifat fakultatif; artinya, mereka dapat hidup baik dalam

keadaan aerobik maupun keadaan anaerobik.Kapang adalah mikroorganisme

aerobic sejati. Cendawan dapat hidup dalam kisaran suhu yang luas, dengan

suhu optimum kebanyakan spesies saprofitik dari 22 sampai 30°C; spesies

patogenik mempunyai suhu optimum lebih tinggi, biasanya 30-37°C.

Beberapa cendawan akan tumbuh pada atau mendekati 0°C dan dengan

demikian dapat menyebabkan kerusakan pada daging atau sayur-sayuran

dalam penyimpanan dingin. Cendawan mampu memanfaatkan berbagai bahan

untuk gizinya.Sekalipun demikian, mereka itu heterotrof (Pelczar, 2008).

Pertumbuhan bakteri dapat diukur dengan beberapa cara, yaitu dengan

menghitung jumah sel dan dengan mngukur massa total populasi, yang

biasanya sebanding dengan jumlah sel. Jumlah populasi biasanya dihitung

sebagai jumlah sel dalam 1 ml cairan per 1 mg materi padat. Dengan membuat

seri pengenceran, kita dapat memperkirakan jumlah bakteri dalam sampel

(Radji, 2010).

Untuk pengujian dilakukan dengan cara :

1. Uji Angka Kapang/ Khamir Total (AKK)

Pada pengujian ini akan diketahui seberapa besar cemaran kapang/

khamir pada sediaan. Caranya dengan menghitung koloni kapang/ khamir

pada serial pengenceran sampel sediaan. Hasil pengujian akan dibandingkan

dengan standar uji cemaran mikroba SNI 19-2897-1992 (Soediono, 2007).

2. Uji Angka Lempeng Total (ALT)

Pada pengujian ini akan diketahui seberapa besar cemaran bakteri pada

sediaan. Caranya dengan menghitung koloni bakteri pada serial pengenceran

sampel sediaan. Setiap sediaan menyaratkan batas angka bakteri dan kapang/

khamir tertentu yang masih dianggap aman untuk dikonsumsi, yaitu < 104

koloni per ml untuk kapang/ khamir dan 106 koloni per ml untuk bakteri.

Hasil pengujian ini akan dibandingkan dengan standar uji cemaran mikroba

SNI 19-2897-1992 (Soediono, 2007).

Dalam perhitungan jumlah mikroba, sel-sel hidup dan mati juga

dipergitungkan. Suatu sel yang hidup dapat diartikan sebagai satu sel yang

mampu membelah diri dan dapat menghasilkan individu yang baru. Cara yang

digunakan untuk menghitung sel-sel yang hidup adalah dengan menentukan

jumlah sel-sel dalam sampel yang mampu membentuk koloni pada media agar

yang sesuai. Oleh karena itu, perhitungan jumlah koloni sel-sel hidup ini

sering dinamakan “Plate Count” atau perhitungan koloni (colony count).

Ada 2 cara melakukan suatu plate count, yaitu :

Metode Sebaran

Metode Taburan (Brooks,2004).

C. SKEMA KERJA

1. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

Alat dan Bahan

a. Media Plate Count Agar (PCA)

b. Buffered Pepton Water (BPW)

c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik)

d. Pipet volume

e. Colony counter (alat hitung koloni)

f. Cawan mortir steril

g. Gelas arloji steril

h. Sendok steril

Cara Kerja

a. Persiapan dan Homogenasi Sampel Makanan (lihat lampiran 2)

b. Pembuatan media PCA (Plate Count Agar) (hitung dan lihat cara

pembuatan media pada kemasan)

c. Penyiapan Sampel Uji

Disiapkan sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yang tidak dalam kemasan, yang bisa dihancurkan dengan menggunakan

mortir steril

↓

Ditimbang @ 5 gram menggunakan gelas arloji steril secara aseptis

↓

Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanan dibersihkan dicuci/dilap

dengan alkohol 70 %, bagian tutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dan kemudian dibuka secara aseptis

d. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel

Ditimbang 5 gram atau 10 gram masing-masing sampel makanan

yang telah dihaluskan dengan mortir secara aseptik, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW

↓

Dikocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan pengenceran 10-1(Berat sampel/bahan bisa disesuaikan dengan

kebutuhan)

↓

Disiapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 ml BPW

↓

Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I, dikocok sampai homogen

↓

Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, dikocok sampai homogen

↓

Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan dimasukkan ke dalam tabung III, dikocok sampai homogen. Dengan demikian pengenceran yang

diperoleh adalah 10-2, 10-3, 10-4

e. Uji ALT

Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut, dipipet 1 ml dan dituangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah dicairkan (suhu 45-

55°C)

↓

Dituangkan ke dalam cawan petri steril, digoyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate). Percobaan dibuat duplo

↓

Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol.Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatan kontrol

kontaminasi media.Caranya : ke dalam satu cawan petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW ke dalam media PCA, biarkan

memadat

↓

Dibiarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam

↓

Diamati hasil dan dihitung jumlah koloni kuman yang tumbuh.Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang

menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni.Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor

pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram contoh bahan(jumlah bakteri per ml

sampel : CFU/ml sampel).

↓

Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir dalam lampiran 3

↓

Dibandingkan hasil angka ALT yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan ALT pada makanan yang ditetapkan

berdasarkan SNI

↓

Contoh perhitungan ALT:Pengenceran Jumlah Koloni Bakteri

Pengenceran Petri I Petri II Rata-rata

10-1 147 149 148

10-2 17 19 18

↓

Dari data di atas maka dapat disimpulkan bahwa Angka Lempeng Total (ALT) : 1,48 x 103 (menggunakan aturan jumlah koloni 30-

300 koloni)

2. UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

Alat dan Bahan

a. Media Malt Extract Agar (MEA)

b. Buffered Pepton Water (BPW)

c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik)

d. Kloramfenikol 100 mg/ l media

Pembuatan larutan kloramfenikol: 1 gram kloramfenikol dalam 100 ml

air suling steril

e. Pipet volume

f. Colony Counter (alat hitung koloni)

g. Cawan mortir steril

h. Cawan arloji steril

i. Sendok steril

Cara Kerja

a. Penyiapan Sampel Uji

Sama dengan uji ALT

b. Pembuatan media MEA (Malt Extract Agar) (dihitung dan dilihat

cara pembuatan media pada kemasan)

c. Homogenisasi dan Pegenceran Sampel

Sama dengan uji ALT, media pertumbuhan yang digunakan adalah

MEA.

d. Uji AKK

Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA ditambah dengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml ditambah 0,5 ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram antibiotik dalam 100 ml

air suling steril)

↓

Metode pour plate : diambil 15 ml MEA suhu 45-50°C dalam tabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol) dan

ditambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceran sampel makanan

↓

Dituangkan ke dalam cawan petri steril, digoyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga

suspensi tersebar merata

(metodepour plate)

↓

Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-

25oC dan diinkubasi 24-48 jam

↓

Saat pengamatan, dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh.Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri.Koloni kapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir berwarna putih dan

licin (berbau asam). Lempeng agar yang diamati adalah lempeng di mana terdapat 10-150 koloni kapang/khamir

↓

Jumlah total koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang Khamir (AKK) dalam tiap gram atau ml contoh bahan

↓

Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir dalam lampiran 3.

↓

Dibandingkan hasil angka AKK yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan AKK pada makanan yang ditetapkan

berdasarkan SNI

Lampiran 3 (Anonim, 1992; Anonim, 2000)

PERSIAPAN DAN HOMOGENISASI SAMPEL MAKANAN

(SNI 01-2897-1992); (PPOMN : 94/MIK/00; 96/MIK/00)

Definisi :

Homogenisasi sampel adalah cara persiapan sampel makanan untuk memperoleh distribusi bakteri secara merata di dalam sampel makanan yang diuji.

Dasar Persiapan :

Membebaskan sel-sel bakteri yang masih terlindung oleh partikel makanan dan untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan di dalam makanan.

Alat dan Bahan :

1. Alat cincang yang sesuai

2. Alat homogenasi (blender, cawan mortir)

3. Wadah pencampur dari gelas atau logam yang tahan suhu autoklaf

4. Timbangan

5. Pisau, garpu, sendok, gunting, spatula, pembuka kaleng dll

6. Beker, erlenmeyer, tabung reaksi dan botol pengencer steril

7. Larutan pengencer : Alkaline Peptone Water (APW), Buffered Peptone Water (BPW), Peptone Dillution Fluid (PDF), Peptone Water (PW), Buffered Distilled Water (BDW), Phosphate Buffered Distilled Water (PBDW)

A. Persiapan Sampel :

1. Penanganan Wadah atau Kemasan :

Disiapkan peralatan untuk penyiapan sampel yang sudah steril atau dapat disterilkan

menggunakan api bunsen

↓

Dibersihkan dengan alkohol 70% sesaat sebelum

pengujian berlangsung.

Wadah terbuat dari kertas atau plastik :

Pada bagian wadah yang akan dibuka dibersihkan dengan alkohol 70%

↓

Dibuka secara aseptik.

Wadah botol

Sumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70%

↓

Dibuka secara aseptik di dekat nyala api bunsen.

Wadah kaleng

Permukaan kaleng dicuci dan dibersihkan dengan alkohol 70%

↓

Dibuka secara aseptik di dekat nyala api bunsen.

2. Homogenisasi Sampel

Makanan bentuk cairan

Sampel dikocok sebanyak 25 kali

↓

Dengan cara aseptik dipipet 25 ml cuplikan sampel ke dalam wadah steril yang sesuai

↓

Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer dikocok homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1)

Makanan bentuk serbuk

Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain steril yang sesuai

↓

Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer dikocok homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1)

Makanan bentuk kental

Dengan cara aseptik dipipet 25 ml atau ditimbang 25 g cuplikan ke dalam

erlenmeyer atau wadah lain steril yang sesuai

↓

Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer, dikocok homogen hingga

diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1).

Makanan bentuk padat

Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam blender

↓

Ditambahkan 225 ml larutan pengencer

↓

Kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1).

Catatan :

Sampel keju, cuplikan dihomogenkan dalam blender yang dihangatkan dan larutan pengencer yang dihangatkan

Sampel mentega/margarin, sampel dipanaskan dalam penangas air suhu 40oC selama tidak lebih dari 15 menit hingga bisa dipipet. Cuplikan dipipet 25 ml secara aseptik dengan pipet yang dihangatkan, ke dalam wadah yang berisi 225 ml larutan pengencer hangat dan kemudian dikocok homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1).

Makanan beku

Sampel yang masih beku harus dipecah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil dengan menggunakan peralatan tumpul. Bila sampel dalam bentuk blok besar, misal ikan atau daging, cuplikan dapat diambil dengan bantuan gergaji, pisau atau bor. Cara lain sampel beku dapat disimpan terlebih dahulu pada suhu refrigerator selama tidak lebih dari 12 jam untuk memudahkan pengambilan cuplikan. Untuk sampel yang tidak terlalu beku seperti es krim, dapat dibiarkan terlebih dahulu pada suhu ruangan selama tidak lebih dari 15 menit. Setelah cukup leleh sampel dalam kemasan diaduk homogen dengan hati-hati, kemudian secara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai atau blender, selanjutnya dihomogenkan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1)

Makanan yang dikalengkan

Keadaan wadah diamati.Dilihat adanya kebocoran dan kerusakan kaleng.Terhadap kaleng yang utuh dilanjutkan pengujian.Setelah wadah dibuka, diambil sejumlah 25 g cuplikan dan dimasukkan ke dalam blender. Ditambahkan 225 ml larutan pengencer hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10-1)

B. Cara Perhitungan dan Menyatakan Hasil ALT (Anonim, 1992;

Anonim, 2000)

1. Pilih cawan petri (simplo atau duplo) dari suatu pengenceran yang

menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 setiap cawan. Hitung

semua koloni dalam cawan petri dengan menggunakan colony

counter. Hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor

pengenceran. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam

tiap gram atau ml sampel.

2. Jika salah satu dari 2 cawan petri terdapat jumlah koloni lebih kecil

dari 25 atau lebih besar dari 250, hitung rata-rata jumlah koloni,

kalikan dengan faktor pengenceran. Hasil dinyatakan sebagai ALT

dalam tiap gram atau ml sampel.

3. Jika hasil dari 2 tingkat pegenceran yang berurutan menunjukkan

jumah koloni berturut-turut antara 25-250 koloni, hitung jumah

koloni dari masing-masing pengenceran seperti yang disebut pada

butir a dan butir b di atas, dan hitung rata-rata jumah koloni dari

kedua pengenceran tersebut. Apabila hasil perhitungan pada tingkat

yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata > 2 kali jumlah

koloni rata-rata pengenceran di bawahnya, maka ALT dipilih dari

tingkat pengenceran yang lebih rendah (missal: pada pengenceran 10-2

jumlah koloni rata-rata140, padapengenceran 10-3 jumlah koloni rata-

rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140x10-2).

4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi

diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah rata-rata

pada pengenceran di bawahnya maka ALT dihitung dari rata-rata

jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut (missal: pada 10-2

jumlah koloni rata-rata 240, pada pengenceran 103jumlah koloni rata-

rata 41), maka ALT adalah:

240+4102

×102=325× 102

5. Jika rata-rata jumlah koloni masing-masing cawan petri tidak terletak

antara 25 dan 250 koloni, hitung jumlah koloni seperti pada butir a

dan b di atas, dan nyatakan sebagai jumlah bakteri perkiraan per

milliliter atau gram.

6. Jika jumlah koloni dari semua pengenceran lebih dari 250 koloni,

maka setiap 2 cawan petri dengan pengenceran tertinggi dibagi ke

dalam 2, 4 atau 8 sektor. Hitung jumlah koloni dalam 1 bagian atau

lebih. Untuk mendapatkan jumlah koloni dalam satu cawan petri,

hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor pembagi dan

pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri perkiraan per

milliliter atau gram.

7. Jika dalam 1/8 bagian cawan petri terdapat lebih dari 200 koloni,

maka jumlah koloni yang didapat sama dengan 8x200 (1600),

dikalikan dengan faktor pengenceran dan nyatakan hasilnya sebagai

jumlah bakteri perkiraan per milliliter atau gram lebih besar dari

jumlah yang didapat (> 1600 x faktor pengenceran).

8. Jika tidak ada koloni yang tumbuh dalam cawan petri, nyatakan

jumlah bakteri perkiraan < 1 dikalikan pengenceran yang terendah

(<10).

9. Menghitung koloni perambat (spreader):

Ada 3 macam perambatan pada koloni, yaitu:

(1).Merupakan rantai yang tidak terpisah-pisah

(2).Perambatan yang terjadi di antara dasar cawan petri dan

perbenihan

(3).Perambatan yang terjadi pada pinggir atau permukaan

perbenihan

Kalau terjadi hanya 1 perambatan (seperti rantai), maka koloni dianggap 1.Tetapi jika 1 atau lebih rantai terbentuk dan yang berasal dari sumber yang berpisah-pisah, maka tiap sumber dihitung sebagai 1 koloni.

Bila (2) dan (3) terjadi maka sebaiknya pemeriksaan diulangi karena koloni dalam keadaan semacam ini agak sukar dihitung.

C. Cara Perhitungan dan Menyatakan Hasil AKK (Anonim, 2000)

Dipilih cawan petri dari suatu pengenceran yang menunjukkan

jumlah koloni antara 10-150.Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung

lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya.Bila pada cawan petri dari

dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 10-

150, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran,

kemudian diambil angka rata-rata.Hasil dinyatakan sebagai Angka

Kapang/ Khamir (AKK) dalam tiap gram atau milliliter sampel.

Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di

atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut:

1. Bila hanya salah satu di antara kedua cawan petri dari pengenceran

yang sama menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni, dihitung

jumlah koloni dari ke dua cawan dan dikalikan dengan faktor

pengenceran.

2. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah

koloni lebih besar dari 2x jumlah koloni pada pengenceran di

bawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah (misal: pada

pengenceran 10-2 diperoleh 60 koloni dan pada pengenceran 10-3

diperoleh 30 koloni, maka dipilih jumlah koloni pada pengenceran 10-

2 yaitu 60 koloni).

3. Bila pada pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni

kurang dari 2x jumlah koloni pengenceran di bawahnya, maka

diambil angka rata-rata dari jumlah koloni dari kedua pengenceran

tersebut. Hasil dinyatakan sebagai AKK dalam tiap gram sampel

(missal pada pengenceran 10-2 diperoleh 60 koloni dan pada

pengenceran 10-3 diperoleh 10 koloni, maka AKK adalah:

6+102

× 103=8 × 103

4. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan

jumlah antara 10-150 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari

tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai AKK perkiraan.

5. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan

karena faktor inhibitor, maka AKK dilaporkan sebagai kurang dari

satu dikalikan faktor pengenceran terendah (<1x faktor pengenceran

terendah).

D. Cara Menghitung dan Membulatkan Angka

1. Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya

2 angka penting yang digunakan, yaitu angka yang pertama dan

kedua (dimulai dari kiri), sedangkan anka yang ketiga diganti denga 0

apabila kurang dari 5 dan apabila atau lebih dijadikan 1 yang

ditambahkan pada angka yang kedua.

2. Contoh: 523.000 dilaporkan sebagai 520.000 (5,2x105), 83.600

dilaporkan sebagai 84.000 (8,4x104).

DAFTAR PUSTAKA

Brooks, G.F., 2004, Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology, 23rd

edition, The McGraw-Hill, USA, pp. 170, 173.

Pelczar, M. J., dkk., 2008, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta, pp. 198.

Radji, M., 2010, Buku Ajar Mikrobiologi, EGC, Jakarta, pp. 56, 68.

Soediono, 2007, Prinsip-prinsip Mikrobiologi, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, pp. 43-45.

Tortora, G., 2010, Microbiology an Introduction, edisi 10, Benjamin Cummings,

USA, pp. 144.