Introduzione agli enzimi (un po’ di storia…)

1850: Pasteur• fermentazione dello zucchero in alcol è catalizzata da “fermenti” • li chiama enzimi e postula che siano inseparabili dalla struttura della cellula vivente

1897: Buchnergli enzimi coinvolti nella fermentazione possono funzionare anche una volta rimossi dalla struttura della cellula vivente

1926: Sumner • isola e cristallizza l’enzima ureasi• postula che gli enzimi siano proteine

fine anni ’30: Northrop verifica che gli enzimi sono proteine

Haldane scrive un trattato intitolato “Enzimi”

seconda metà XX sec: sono stati purificati migliaia di enzimi e di centinaiadi essi è stata determinata la struttura e il meccanismochimico

caratteristiche enzimi• sono proteine che svolgono un’attività catalitica nei sistemi biologici

• ogni cellula contiene alcune migliaia di enzimi diversi e tutti sono necessari per il suo normale funzionamento

sistema di nomenclatura e di classificazione basato sul tipo di reazione catalizzata e sul nomedi ciascun enzima (IUB, 1961)

sistema gerarchico, in cui gli enzimisono divisi in 6 classi principali

1. OSSIDOREDUTTASI2. TRANSFERASI3. IDROLASI 4. LIASI 5. ISOMERASI 6. LIGASI

• a volte è utile classificare un enzima così:

molecola proteica + molecola non proteica enzima biologicamente attivo

(APOENZIMA) (GR. PROSTETICO) (OLOENZIMA)

cofattore coenzima

enzimi: catalizzatori biologici

1. alla fine della reazione, le proteine enzimatiche devono conservare la loro struttura immodificata e pronta per riprendere l’attività catalitica

2. devono essere efficaci in piccole quantità

3. non devono influenzare l’equilibrio di una reazione chimica reversibile: la costante di equilibrio è una costante termodinamica caratteristica della reazione

4. devono mostrare specificità nella capacità di accelerare le reazioni chimiche

come lavorano gli enzimi

la velocità di una reazione, misurata come quantitàdi prodotto ottenuto in un tempo definito, dipende

dalla energia di attivazione

alzare la temperatura: si incrementail numero di molecole che hanno una

quantità sufficiente di energia per superare la barriera di energia

posso abbassare l’energiadi attivazione aggiungendo

un catalizzatore

diagramma delle variazionidi energia in una reazione

S Pgli enzimi modificano solo la velocità della reazione e non

gli equilibri

interazioni deboli non covalenti tra S ed E,

provocano un rilasciodi energia libera

abbassamento energiadi attivazione

rende enzimi specifici

SITO ATTIVOregione specifica delle molecole enzimatiche

dove il substrato si lega e reagisce per formareil prodotto. Esistono due modelli per interpretare

l’interazione sito attivo-substrato

modello chiave-serratura(Fischer 1894)

modello adattamento induttivo(Koshland 1954)

(modello eccessivamente semplificato) l’enzima è una serratura in cui può girare solo

la chiave specifica; infatti, solo una determinatamolecola di substrato ha la forma che le permettedi entrare nella fessura del sito attivovdell’enzima

in modo che la reazione possa avvenire

la forma assunta dall’enzima è adatta a far avvenirela reazione solo dopo che questo si è legato al

substrato: tale fenomeno serve a portare i gruppi funzionali specifici dell’enzima nell’orientamento

corretto necessario per la catalisi della reazione

cinetica enzimatica relazione tra la concentrazione del substrato

e la velocità della reazione

• in generale [S] non rimane costante durante la reazione

1. si valuta Vo iniziale, quando [S] >>[E] 2. tempo di analisi sufficientemente breve

[S] = cost

1. a [S] basse, Vo ha un dipendenza lineare da [S]

2. a [S] alte, Vo tende asintoticamente a Vmax

1913: teoria generale dell’azione degli enzimi (Michaelis – Menten)

il complesso enzima-substrato (ES) è la chiave per la comprensione del

comportamento cinetico degli enzimi

la velocità della reazione è proporzionale a [ES]

si definisce uno stato stazionarioquando [ES] rimane costante

la relazione tra [S] e la velocità della reazioneenzimatica può essere espressa in modo quantitativo

Equazione di Michaelis - Menten S K

S V V

m

max0

max0 V V

S K

V V

m

max0

1. Km = (K2 + K-1) / K1

2. un solo substrato

• definizione pratica di Km:

S K V 2

1 V mmax0

• in genere Km è una funzione complessa; se però K2 << K1 essa può essere considerata la misura dell’affinità di un enzima per il substrato: più è alta Km, minore è l’affinità

interpretazione dei termini Vmax e Km

maxmax

m

0 V

1

S

1

V

K

V

1

(equazione di Lineweaver – Burk)

grafico dei doppi reciproci:retta con pendenza Km/Vmax

intercetta asse x

intercetta asse y

-1/Km 1/Vmax Vmax = K2 [Et]

si definisce una costante di velocità per descrivere la tappa che limita la velocità

di una reazione catalizzata

numero di turnovernumero di molecole di substratoche viene convertito in prodotto

nell’unità di tempo da una singolamolecola enziamatica, quando è

saturata con il substrato

funzioni dell’enzima

accelerare le reazioni

controllare e regolarei processi metabolici

INIBIZIONE ENZIMATICAun inibitore enzimatico è una

molecola che impedisce all’enzima di funzionare correttamente

REVERSIBILI

agiscono con modalità che consentono all’enzima di recuperare la propria

funzionalità biologica

1. competitivi2. non competitivi3. incompetitivi

IRREVERSIBILI• si legano con un legame covalente ad un residuo di un amminoacido presente nel sito attivo

• si modifica in modo irreversibile la forma del sito attivo e la conformazione della molecola enzimatica

• attività dell’enzima si annulla

inibizione competitiva

• numero di turnover può scendere rapidamente a zero

• l’inibitore ha una forma simile a quella del substrato• l’inibitore si lega reversibilmente al sito attivo dell’enzima• competizione per conquistare il sito attivo dipende dalla concentrazione dei due contendenti

la Km tende ad aumentare apparentementequando sono presenti concentrazioni

crescenti di [I]

inibizione non competitiva

• si ha inibizione non competitiva quando l’inibitore si lega reversibilmente ad un radicale amminoacido dell’enzima in un sito diverso dal sito attivo

• deformazione del sito attivo: esso può ancora ricevere il substrato, ma non è più in grado di trasformarlo in prodotto

• numero di turnover è solo abbassato, poiché ciò che diminuisce è Vmax

inibizione incompetitivasi ha inibizione incompetitiva quando l’inibitore

si lega reversibilmente al complesso enzima – substrato durante il processo catalitico

(diagramma dei doppi reciproci in presenza di

un inibitore non competitivoed uno incompetitivo)

• l’inibitore non competitivo si lega al’enzima in un sito diverso da quello per il substrato: non si hanno variazioni della Km ma solo la diminuzione di Vmax

• l’inibitore incompetitivo si lega al complesso enzima – substrato già formato e ciò riduce significativamente le possibilità, per l’enzima, di disfarsi del prodotto: diminuzione di Km e Vmax

effetto della temperatura sullereazioni catalizzate da enzimi

un eccessivo aumento della temperaturaprovoca la denaturazione degli enzimi con una modificazione irreversibile del

sito attivo e una drastica riduzionedell’attività catalitica

T > 40, 50°Ceffetto di denaturazione

degli enzimi

T < 40, 50°Cle molecole non possiedono, anchese catalizzate, l’energia sufficienteper superare la barriera del’energia

di attivazione

effetto del pH sulle reazionicatalizzate da enzimi

il cambiamento del pH altera il grado di ionizzazionedei diversi gruppi ionizzabili presenti in una molecola

enzimatica; se anche il substrato è un compostoionico, la sua ionizzazione varierà con il pH

sia la natura ionica del substrato chequella dell’enzima modificano il modo

di combinarsi dell’uno con l’altro

(andamento della velocità di reazioneenzimatica in funzione del pH) si può individuare un pH ottimale

e un range di valori di pH entro cuil’enzima mostra la massima efficienza

regolazione dell’attività enzimatica

• un enzima regolatore è quello che controlla le quantità di sostanze che devono essere trasformate in una via metabolica (catalizza la reazione più lenta)

• tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis – Menten e sono responsabili della modulazione della velocità con cui decorre l’intero processo metabolico

ENZIMIALLOSTERICI

• struttura quaternaria (due o più subunità proteiche)

• in essi esistono più siti chimicamente attivi

• effettore: molecola che interagendo in siti lontani dal sito attivo di un enzima, esercita un qualche effetto sulla sua attività (positivo o negativo)

l’enzima allosterico, costituitoda due subunità proteiche, esistein due forme oscillanti fra uno

stato attivo ed uno inattivo

effettore positivoinduce modificazioni che

trasformano lo stato inattivodell’enzima nella sua forma

attiva: essa può legarsi alsubstrato

effettore negativoinduce una modificazione

del sito attivo tale da impedire all’enzima di

funzionare

andamento della velocità di trasformazione del substrato

sigmoide

(enzima allosterico di classe K:gli effettori modificano la Km

ma non la Vmax)

cooperatività essa si presenta, a livello enzimatico, quando il legamedi un effettore su una subunità migliora la possibilità,

per altri effettori, di formare legami successivi su subunitàadiacenti alla prima