influencia de bacterias lacticas sobre la secrecion de

TRABAJO DE POSGRADO TITULADO

INFLUENCIA DE BACTERIAS LACTICAS SOBRE LA SECRECION DE ADIPOQUINAS EN

DIFERENTES ESTADOS DE MALNUTRICON

TESISTA

Lic. Mario Emanuel Fabersani Marrades

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA

Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN – San Miguel de Tucumán – República Argentina

HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO

Dra. Patricia Eugenia Álvarez Dra. Gabriela Perdigón

Bioq. Farm. Ana María del Valle González Dra. María Eugenia Mónaco

Dra. Carolina Serra Barcellona Dra. María José Rodríguez Vaquero

Farm. Verónica Pastoriza Sr. Walter Ricardo Gómez Sr. Francisco Andrés Díaz Srta. Ivana Micaela Núñez

Sr. Gonzalo Andrés Lascano

DECANA

Dra. Silvia Nelina González

VICE-DECANO

Dr. Edgardo Hugo Cutin

SECRETARIA DE ASUNTOS ACADEMICOS

Dra. Marta Elena Cecilia

JEFA DEL DEPARTAMENTO POSGRADO

Lic. Marta Quinteros



DEPARTAMENTO DE POSGRADO

AUTORIDADES

DIRECTOR:

Dr. Sergio Enrique Pasteris

CONSEJO TITULAR:

Dra. Inés del Carmen Ramos Dra. María Carolina Navarro Dra. Maria Cristina Gaudioso

Dra. Paula Andrea Vincent Dra. Maria Cristina Rubio

Suplentes

Dra. Maria Graciela Benzal Dra. Clara del Valle Silvia de Ruiz

Dra. María Inés Nieva Moreno

REPRESENTANTE DE POSGRADO ANTE LA SECRETARÍA DE POSGRADO DE LA UNT

Dra. Paula Andrea Vincent



TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTOR EN BIOQUIMICA

CARRERA DE DOCTORADO EN BIOQUIMICA

Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)

Resolución nº: 732/00

Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)

Resolución nº: 489-CONEAU-12

Director:

Dr. Manuel Javier Aybar

Comité Académico:

Dra. Gladis Susana Álvarez Dr. Mario Domingo Baigorí Dra. Sara Serafina Sánchez Dra. Inés del Carmen Ramos Dra. Roxana Beatriz Medina Dr. Raúl Armando Salomón





TRABAJO DE POSGRADO TITULADO

INFLUENCIA DE BACTERIAS LACTICAS SOBRE LA SECRECION DE ADIPOQUINAS EN

DIFERENTES ESTADOS DE MALNUTRICON

TESISTA

Lic. Mario Emanuel Fabersani Marrades

DIRECTORA

Dra. Maria Paola Gauffin Cano

DIRECTOR ASOCIADO

Dra. Silvia Nelina González

COMISION DE SUPERVISION

Dra. Susana Beatriz de Fátima Genta Dr. Julio César Villena



Este trabajo fue realizado en el Centro de Referencia para Lactobacilos

(CERELA), dependiente del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y

Técnicas (CONICET), de la Fundación Miguel Lillo y de la Fundación para la

Educación, la Ciencia y la Cultura (FECIC)

Con el apoyo financiero del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y

Técnicas (CONICET), PIP Nº 0343 y PIP Nº 0010.

Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica a través del Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT)

(ANPCYT) BID PICT-2011 Nº 0804.

Subvenciones de la Universidad del Norte Santo Tomás de Aquino (UNSTA)

Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán

(CIUNT) 26/D429-1

Publicaciones y comunicaciones científicas a las que dio lugar esta Tesis Doctoral

ARTÍCULOS EN REVISTAS CIENTÍFICAS CON REFERATO

2014. - FERMENTED MILKS FROM SMALL RUMINANT: EFFECT ON METABOLISM AND IMMUNE STATUS OF MICE FED MILD CALORIC RESTRICTED DIET. Fabersani E, Torres S, Valdez C, González S and Gauffin Cano P. Journal of Immune Research. ISSN 2471-0261, Recibido: 14 de agosto de 2014; Aceptado: 16 de septiembre, 2014; Publicado: 18 de septiembre de 2014.

2015- LACTOBACILLUS FERMENTUM CRL1446 AMELIORATES OXIDATIVE AND METABOLIC PARAMETERS BY INCREASING INTESTINAL FERULOYL ESTERASE ACTIVITY AND MODULATING MICROBIOTA IN CALORIC-RESTRICTED MICE. Matias Russo, Emanuel Fabersani, María C. Abeijón-Mukdsi, Romina Ross, Cecilia Fontana, Alfonso Benítez-Páez, Paola Gauffin-Cano and Roxana B. Medina. Nutrients 2016, 8(7), 415; doi:10.3390/nu8070415.

2016- SPECIFIC STRAINS OF LACTIC ACID BACTERIA DIFFERENTIALLY MODULATE THE PROFILE OF ADIPOKINES IN VITRO. Emanuel Fabersani1, Romina Ross, Claudia Abeijon-Mudski, Roxana Medina, Yolanda Sanz, Silvia González and Paola Gauffin-Cano (aceptado con correcciones menores).

COMUNICACIONES CIENTÍFICAS

2012 - SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS POR SUS PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS IN VITRO. Gonzalez S, Fabersani E, y Gauffin Cano P. XI Congreso Latinoamericano de Microbiología e Higiene de Alimentos (MICROAL), Buenos Aires, Argentina.

2013 - EVALUACIÓN IN VITRO DE BACTERIAS LÁCTICAS SOBRE SU CAPACIDAD DE INDUCIR LA SECRECIÓN DE LEPTINA EN ADIPOCITOS. Fabersani, E., Gonzalez, S. y Gauffin Cano, P. IV simposio internacional de bacterias lácticas (SIBAL). Tucumán, Argentina.

- INFLUENCIA DE LA ADMINISTRACIÓN ORAL DE LACTOBACILOS SOBRE LA ACTIVIDAD ESTERASA INTESTINAL EN UN MODELO MURINO DE RESTRICCIÓN CALÓRICA. Russo, M.; Fabersani, E., Abeijón Mukdsi, c.; Gonzalez, s.; Gauffin Cano, P. y Medina, R. IV simposio internacional de bacterias lácticas (SIBAL). Tucumán, Argentina.

- EFECTO DE Lactobacillus casei CRL 431 SOBRE LOS NIVELES DE LEPTINA EN UN MODELO MURINO DE RESTRICCIÓN CALÓRICA LEVE.Fabersani, E; Abeijon Mukdsi, MC; Gonzalez, S y Gauffin Cano, P. XIX Congreso Argentino de Nutrición. Mar del Plata, Argentina.

2015 - INFLUENCIA DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS SOBRE PARÁMETROS METABÓLICOS, ENDÓCRINOS E INMUNOLÓGICOS EN UN MODELO ANIMAL DE RESTRICCIÓN CALÓRICA LEVE. Fabersani E, Russo M, Ross R, Saavedra, L, Gonzalez S, y Gauffin Cano P. XI congreso argentino de microbiología general (SAMIGE). Córdoba, Argentina.

- EFFECT OF PROBIOTIC ADMINISTRATION ON BIOCHEMICAL PARAMETERS AND INTESTINAL MICROBIOTA IN CALORIC RESTRICTION MICE. Fabersani, E; Russo, M; Ross, R; Medina, R; Gauffin Cano, P. LI Reunión SAIB. Mar del Plata, Argentina.

2016 - EFFECT OF LACTIC ACID BACTERIA ON IMMUNE-METABOLIC PARAMETERS AND INTESTINAL MICROBIOTA COMPOSITION IN AN OBESITY MURINE MODEL. E. Fabersani1; R. Ross and P. Gauffin Cano. V simposio internacional de bacterias lácticas (SIBAL). Tucumán, Argentina.

- EFFECT OF CACTUS PEAR JUICE (Opuntia ficus-indica) FERMENTED WITH Lactobacillus plantarum S-811 ON METABOLIC PARAMETERS IN NORMAL AND OBESE MICE. P. Gauffin Cano; E. Fabersani; H. Verón; Y. Sanz; M. T. Fernández Espinar, J.V. Gil Ponce, M.I. Isla, S. Torres. V simposio internacional de bacterias lácticas (SIBAL). Tucumán, Argentina.

Dedicado a

Mi familia, mi núcleo, mi sustento, mi motivación, la base de mi crecimiento y los responsables de todos mis logros, Mamá, Papá, Naty, Giuli y Lujy, Gracias.

Agradecimientos

Agradecimientos

A mi directora la Dra. Paola Gauffin Cano, por la clase de persona que es, por haberme tratado como su hijo mayor más que como su becario, cualidades que no se encuentran con facilidad. Gracias por abrirme las puertas y guiarme en el mundo de la ciencia, esto me permitió llegar a donde hoy estoy, fue un viaje fabuloso y vos fuiste la principal responsable de eso. Gracias por tanto Paolita.

A mi co-directora, la Dra. Silvia Nelina González, por su calidez humana, por el apoyo incondicional en los momentos precisos, por el aporte de su amplia experiencia en el área de investigación, y sobre todo por su gran capacidad de gestión que le permitió ayudarme con más de lo que estuvo a su alcance, muchas gracias Silvita.

A la Dra. Yolanda Sanz, por aceptarme en su prestigioso laboratorio y haberme permitirme ampliar en gran medida mis conocimientos y capacidades profesionales, además de poder viajar y enriquecerme profundamente de su cultura, esto me permitió crecer en lo humano y profesional. Muchísimas gracias Yolanda.

A mi comisión de supervisión, Integrada por los Dres. Susana Beatriz de Fátima Genta y Julio César Villena, ellos cubrieron las fallas de esta tesis, siempre mostrando la mejor predisposición para entablar las reuniones de comisión, en un ambiente cálido y de gran nivel académico.

A la Dra. Graciela Font de Valdez, directora del CERELA, por haberme abierto las puertas de tan prestigiosa institución, y permitirme de esa manera desarrollar mi trabajo de tesis.

A la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán, por la excelencia, por mi formación académica gratuita que me permitio estar al nivel de estudiantes de universidades de prestigio internacional y optar por el máximo título académico al que una persona puede aspirar, el de Doctor.

A la Lic. Marta Quinteros y todo su equipo de trabajo del Departamento de Posgrado de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán, por su paciencia, disposición y asesoramiento en todos los trámites administrativos.

Al instituto de Biotecnología de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán, dirigido por el Dr. Antonio Roberto Navarro, y constituido por, M. cristina Rubio, M. Cristina Maldonado, Sonia Lopez, María Ester, Antonieta Gordillo, Soledad Suarez, Pedro Aredes, Martin, Nacho, Gustavo, Carlitos, Anto,

Agradecimientos

Pilar, Romy, Vicky y Naty, donde di mis primeros pasos en la docencia y compartí momentos muy amenos en su compañía, con lo cual les guardo mucha estima.

A mi Laboratorio, el 111, Ecofisiología Tecnológica, donde inicie este camino y gracias a la presencia de grandes personas a las cuales quiero nombrar, estos momentos se hicieron realmente fácil de transitar, Milagros Griet, Jaime Babot, Guillermo Juarez y Monica Mechoud. Ademas de algunos infiltrados como Lucia Mendoza, Marina Scrocchi, Miguelito Ullivarri, entre otros.

A laboratorio 128 (Ecofisiología Tecnológica PA), cuando se agotaban los recursos en el 111 había que recurrir al 128, por eso quiero agradecer la amabilidad, la disposición y la buena onda de todos los integrantes de este laboratorio, que me ayudaron en más de una oportunidad. Roxana Medina, Adriana Perez Chaia, Cristina Apella, Carina Van Nieuwenhove, Patrica Castellano, Gabriela zarate, Claudita Abeijon, Romina Ross, Conty, Majo, Matias, Gabi, Ale, Anto, Mariana, Ruben, Vicky, etc.

Al laboratorio de inmunología, dirigido por la Dra. Gabriela Perdigón e integrado por Alejandra de moreno, Carolina Maldonado, Martin, Eva, Nabil, Ivanna, Flor, Emi, que siempre me brindaron apoyo en todo lo solicitado.

Al grupo Inmunobiotic, Liderado por la Dra. Susana Alvares y conformado por Julio Villena, Susana Salva, Yany, Pato, Andres, Hortencia, Gabi.

A la gente de la vidriera, otro laboratorio de CERELA, al cual fui a molestar en reiteradas oportunidades, Gracias por la paciencia y la calidez humana con la que siempre me recibieron. Faty Nader, Claudia Otero, Silvina, Naty, Poly, Esteban, Priscila, Cande, Caro y los nuevos integrantes.

A la gente del Fondo, Guille, Silvina, Lore, Lu Ruiz, Anto, Nadia, Lucia, Juli Bleck, Juli Bo, Lucrecia, Alejandra, Carito, Euge, Mica, Andrea, Jonathan, y todos los chicos que forman parte de cerela CERELA por su ayuda y paciencia durante todos estos años de tesis, con quienes he compartido tantos años y buenos momentos, Me me llevo los mejores recuerdos y una gran amistad.

A todo el personal de CERELA, desde la dirección hasta el personal de limpieza, por haberme recibido tan bien y haberme hecho parte de esa gran familia. Por su disposición, amabilidad y paciencia. Esta institución fue mi segundo hogar donde pasé muchas horas y compartí grandes vivencias con cada uno de ustedes.

Al Laboratorio 114 del Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC), Valencia, España. Por haberse transformado en mi hogar estando tan lejos de casa, haberme recibido con los brazos abiertos y brindarme toda su hospitalidad para poder desarrollar

Agradecimientos

parte de mi tesis en ese prestigioso instituto. Gracias a Isabel, Jesús, Zoran, Kevin, Víctor, Marta, Inma, Mamen, Lore, Carmen, María, Irene, Walter, Alba, Javi, Jimmy, Cristine, Edel, Anto, Adri, Fanny, que se convirtieron en mi familia y eso cuando la tienes muy lejos se agradece enormemente. Gracias a ustedes mi estancia en España fue inolvidable, y en nombre de ustedes agradezco a todas las personas que integran el IATA.

A todo el personal de apoyo de CERELA y del IATA, Que me brindo su conocimiento y asesoramiento de calidad en el desarrollo y puesta a punto de las técnicas utilizadas en esta tesis. Especialmente me gustaría hacer mención a algunos de ellos, por la dedicación y predisposición con la que siempre me trataron y en su nombre agradecerle a todo el personal de apoyo que me permitió desarrollar mi tesis. José Luis Alvarado, Azul Zorzoli, Marianito Obregozo, Yolanda Borgia, Vicky Martos, Carito Paz, Carmen Laosa, Lorena Perales, Rocio, Oscar, Luis, Seba, Gaston, Jorgito, Moni, Marta, Vero, etc.

Al proyecto µ-Andes liderado por la Dra. Graciela Vignolo, que me permitió hacer una estancia en el instituto del Prof. Pier Sandro Cocconcelli, de la Università Cattolica del Sacro Cuore, Milán, Cremona, Italia. Bajo la tutoría de la Dra. Cecilia Fontana quien no solo me recibió con los brazos abiertos, sino que también me abrió las puertas de su casa y de su hermosa familia. Gracias.

A mi Madre, Magdalena Cristina Marrades, mi mayor símbolo de admiración, sinónimo de transparencia, bondad, trabajo y superación. Que sería de mi sin tu ejemplo, eternamente Gracias.

A mis hermanos, Gracias por aguantarme y estar siempre a mi lado en todo momento, son incondicionales, un pilar fundamental de mi vida.

Al resto de mi familia y amigos que constituyen otro pilar de mi vida y permiten que esta estructura se mantenga en pie, me alientan a una superación constante, y me dan animo en los momentos difíciles, Gracias por todo.

Finalmente me gustaría agradecer a la Sociedad Argentina que mediante el pago de sus impuestos permiten que muchos jóvenes como yo puedan desarrollar sus trabajos de tesis Doctoral. Ese dinero se transformó en apoyo financiero otorgado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), la Agencia Nacional de Promoción Científica, el Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), la Universidad del Norte Santo Tomás de Aquino (UNSTA) y el Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán (CIUNT)

Sin ese aporte esto sería imposible, Muchas Gracias.

ÍNDICE

Indice

Indice RESUMEN ............................................................................................................... 2

INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 6 Nutrición ....................................................................................................................................................... 7

Malnutrición .................................................................................................................................................. 7

Desequilibrio ................................................................................................................................................. 8

Responsables ............................................................................................................................................... 11

Inmunidad y malnutrición, in medio stat virtus. ...................................................................................... 12

Tejido adiposo: Inmunidad y Metabolismo ............................................................................................. 13

Remodelación del TA en la malnutrición ................................................................................................. 14

El vínculo entre la inmunidad y la nutrición: El concepto de “Adipoquina” ....................................... 20

Leptina, la adipoquina modelo .................................................................................................................. 22

Ob-R, El receptor de leptina ..................................................................................................................... 23

La leptina un vínculo clave entre la nutrición y la respuesta inmune ..................................................... 24

Dieta y Microbiota: Inmunidad y Metabolismo ....................................................................................... 25

La microbiota intestinal, el superorganismo (una alternativa viable) ..................................................... 27

Microbiota, Malnutrición y disbiosis ........................................................................................................ 28

Microorganismos y su Hospedador: el control de la homeostasis energética y metabólica ................. 30

Bacterias Lácticas (BL), Probióticos y Alimentos funcionales ............................................................... 34

Ciencia de traslación y el futuro de los probióticos ................................................................................. 36

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................................................... 39

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 42 Microorganismos y condiciones de cultivo .............................................................................................. 42

Microorganismos ................................................................................................................................... 42

Condiciones de cultivo .......................................................................................................................... 42

Capítulo I: Selección de BL con capacidad adipomoduladora ............................................................... 44

Estimulación de Macrófagos murinos RAW 264.7 ............................................................................. 44

Aislamiento de adipocitos murinos ...................................................................................................... 44

Estimulación de un cultivo primario de adipocitos murinos con BL ................................................ 45

Estimulación de un Co-cultivo de macrófagos y adipocitos con BL ................................................ 45

Detección de citoquinas y adipoquinas ................................................................................................ 46

Cuantificación de la expresión del receptor de leptina (Ob-R) en RAW264.7 ................................. 46

Detección cualitativa de la expresión del receptor de leptina (Ob-R) ............................................... 47

Indice

Capitulo II: Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de obesidad inducida por la dieta ................................................................................................................................... 48

Modelo experimental de dieta alta en grasa (DAG) ............................................................................ 48

Capítulo III: Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de restricción calórica......................................................................................................................................................... 49

Modelo experimental de restricción calórica ....................................................................................... 49

Stock y administración de Bacterias lácticas adipomoduladoras ........................................................ 50

Recolección de muestras biológicas ..................................................................................................... 50

Ensayos bioquímicos ............................................................................................................................. 51

Extracción de órganos ........................................................................................................................... 51

Determinación del área y número de adipocitos ................................................................................. 51

Extracción de macrófagos y adipocitos para evaluar su funcionalidad ex vivo .................................. 52

Extracción de ADN de muestras fecales ............................................................................................. 53

Secuenciación masiva de alto rendimiento de amplicones del gen 16S rRNA ................................. 53

Análisis estadístico ................................................................................................................................. 54

RESULTADOS ....................................................................................................... 56 Capítulo I ...................................................................................................................................................... 56

Introducción ........................................................................................................................................... 57

Objetivo .................................................................................................................................................. 59

Resultados ............................................................................................................................................... 60

Discusión ................................................................................................................................................ 76

Conclusiones ............................................................................................................................................... 88

Capítulo II ..................................................................................................................................................... 89

Introducción ........................................................................................................................................... 90

Objetivo .................................................................................................................................................. 92

Resultados ............................................................................................................................................... 93

Discusión .............................................................................................................................................. 112

Conclusiones ............................................................................................................................................. 121

Capítulo III ................................................................................................................................................. 122

Introducción ......................................................................................................................................... 123

Objetivo ................................................................................................................................................ 125

Resultados ............................................................................................................................................. 126

Discusión .............................................................................................................................................. 146

Conclusiones ............................................................................................................................................. 156

CONCLUSIONES FINALES ................................................................................. 157

Indice

PROYECCIONES ................................................................................................. 163

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 165

Resumen

Resumen

2

RESUMEN

Estrategias dietéticas, en particular el uso de probióticos como agentes terapéuticos que manipulen la microbiota intestinal y/o modulen la funcionalidad del tejido adiposo, serían adecuadas para la prevención y/o tratamiento de diferentes condiciones de malnutrición. Bajo este contexto nos planteamos el siguiente objetivo: “Evaluar la influencia de bacterias lácticas (BL) sobre la secreción de adipoquinas en modelos experimentales de malnutrición y estudiar su implicancia en la respuesta inmune y la microbiota intestinal (MI)”.

Realizamos una selección de cepas de BL adipomoduladoras mediante ensayos in vitro, en macrófagos (RAW264.7), adipocitos (cultivo primario) o co-cultivo de ambos tipos célulares.

Los estudios in vitro nos permitieron concluir que, la capacidad adipomoduladora de las BL estudiadas fue cepa dependiente. De acuerdo al perfil de producción de TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-10, leptina y a la expresión de su receptor (Ob-Rb) se seleccionaron, Lactobacillus fermentum CRL1446, Lactobacillus casei CRL431 y Lactococcus lactis CRL1434 como las BL con mayor probabilidad de ejercer efectos beneficiosos en condiciones de malnutrición. De este modo fue posible desarrollar un método de selección in vitro de BL adipomoduladoras potencialmente probióticas.

En dos modelos experimentales de malnutrición, restricción calórica (RC) y sobrepeso, se evaluó la capacidad de las las cepas seleccionadas, para modular beneficiosamente la MI y la respuesta inmune.

En el modelo RC se demostró que: CRL1446 favorece la disminución del peso corporal, el tamaño de adipocitos,

leptina y, colesterol plasmático. Los estudios ex vivo post-estímulo con LPS demostraron una menor producción de leptina por adipocitos, menor nivel de MCP-1 y aumentos de IL-10 por macrófagos. Detectamos un efecto bifidogénico sobre la MI.

CRL1434 induce un descenso del peso corporal y de leptina además de aumentos en TNF-α, IL-17 e IL-10. Los estudios ex vivo demostraron una menor secreción de leptina en adipocitos, y aumentos en niveles de IL-10 y TNF-α en macrófagos. No hay cambios significativos en la MI.

CRL431 induce incremento del peso corporal y del tejido adiposo, leptina, glucosa, TNF-α e IL-17. En los estudios ex vivo observamos incremento de leptina por adipocitos y aumentos de IL-10, TNF-α e IL-6 por macrófagos. Se observa un aumento del género lactobacilos.

Resumen

3

En el modelo de sobrepeso se demostró que: CRL1446 induce un descenso del peso corporal, del tejido adiposo y del tamaño de

adipocitos. Se observa disminución en plasma de glucosa, colesterol, triglicéridos, leptina, TNF-α e IL-6 y aumentos de IL-10. Los estudios ex vivo en adipocitos demostraron menor secreción de leptina, y en macrófagos menor concentración de MCP-1, TNF-α e IL-6 y mayores niveles de IL-10. Se observa un aumento de lactobacilos y una disminución del índice Firmicutes/bacteroidetes F/B.

CRL1434 induce un descenso del peso corporal, del tejido adiposo y del tamaño de adipocitos. Se observa disminución en glucosa, colesterol, triglicéridos y leptina además de aumentos de IL-10 y disminución de TNF-α e IL-6. Los estudios ex vivono demostraron cambios en la producción de leptina, y en macrófagos se observa menor concentración de MCP-1 y mayores niveles de IL-10. Se observa disminución del índice (F/B).

CRL431 no modifica el peso corporal ni el tejido adiposo. Se observa disminución ligera de glucosa y colesterol plasmático. Demostramos incrementos de leptina, IL-6 e IL-10. En los estudios ex vivo observamos incremento de leptina por adipocitos y aumentos de IL-10, TNF-α e IL-6 por macrófagos. Se observa disminución del índice F/B.

Estos resultados sugieren que CRL1446 y CRL1434 podrían ser potenciales probióticos para el tratamiento de la obesidad y sobrepeso mientras que la administración oral de CRL431 resultaría beneficiosa en las alteraciones producidas por la desnutrición.

Palabras claves: Malnutrición – Probioticos - Adipoquinas

Introducción

Introducción

5

Ludwig Feuerbach 1850.

"Somos lo que comemos" "Si se

quiere mejorar al pueblo, en vez de discursos denles

mejores alimentos.

Introducción

6

Prefacio

Introducción

¿Cómo enfermedades que parecen meramente metabólicas como la obesidad o la diabetes tipo 2 se relacionan con alteraciones del sistema inmune?

¿Qué vínculo hay entre la dieta, la microbiota, el sistema inmune, la producción de adipoquinas y el metabolismo? ¿Por qué la dieta se vuelve decisiva en el desarrollo de enfermedades inmuno-metabólicas?

La comprensión de los mecanismos por los cuales los nutrientes de la dieta influyen sobre la inmunidad, el metabolismo y la microbiota intestinal puede allanar el camino para desarrollar nuevas estrategias dietarías con pre o probióticos, que impacten en la inmunidad y mejoren la salud de la sociedad (Petschow et al., 2013).

Introducción

7

Nutrición

Malnutrición

"Que tu alimento sea tu medicina, y que tu medicina sea tu alimento"

(Hipócrates - año 460 A.C.)

“La nutrición es la ingesta de alimentos en relación con las necesidades dietéticas del organismo. Una buena nutrición, una dieta suficiente y equilibrada combinada con el ejercicio físico regular es un elemento fundamental de la buena salud”.

“Una mala nutrición puede reducir la inmunidad, aumentar la vulnerabilidad a las enfermedades, alterar el desarrollo físico y mental, y reducir la productividad”.

(WHO | Nutrition)

Así es como se definió nutrición a lo largo del tiempo, donde se manifiesta la importancia de la dieta en el estado de salud general y las alteraciones que puede acarrear la malnutrición. Resaltando que el desequilibrio dietario representa uno de los principales desencadenantes de enfermedades, lo cual se ve reflejado en los casos de desnutrición y en la creciente epidemia de obesidad mundial, sin solución hasta el momento.

Este trabajo de Tesis Doctoral aborda los desequilibrios nutricionales como desencadenantes primarios de enfermedades y causa del problema.

Hablar de malnutrición puede ser muy complejo teniendo en cuenta todos los factores que la afectan y los diferentes estados de malnutrición que existen, pero podríamos simplificarla a nivel de cantidad de calorías ingeridas con los alimentos. En este sentido la malnutrición se refiere a la deficiencia, el exceso o el desequilibrio en la ingesta de energía y/o nutrientes de una persona. El término malnutrición abarca 2 grandes grupos de condiciones, una de ellas es “Desnutrición” que incluye el retraso del crecimiento (baja talla para la edad), emaciación (bajo peso para la talla), la insuficiencia ponderal (bajo peso para la edad) y la carencia o insuficiencias de micronutrientes (falta de vitaminas y minerales). El otro grupo es el Sobrepeso, la Obesidad y las enfermedades no transmisibles relacionadas con la dieta (tales como enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, diabetes y cáncer) (WHO | What is malnutrition?). De esta manera podríamos decir que un tercio de la población mundial esta malnutrida, llegando en algunos casos a desarrollar enfermedades como la obesidad, la cual ha crecido de forma exponencial e incluso en algunos países como

Introducción

8

Desequilibrio

los Estados unidos, el 70% de la población padece sobrepeso y el 35 % obesidad. (Ng et al. 2014).

De esta manera hablamos de malnutrición en su forma más simple teniendo en cuenta la carga nutricional de un alimento, esto podría parecer sencillo, y en muchos casos se utiliza para explicar de forma simple enfermedades complejas como la obesidad (desequilibrio en la ingesta de alimentos donde se consumen más calorías de las que se gastan) sin embargo al profundizar en el tema nos damos cuenta que se trata de un fenómeno más complejo que pone cada vez más factores en juego.

Partiendo de este punto de vista, podríamos decir que no existe una dieta ideal que nos garantice el estado nutricional perfecto, más bien cada individuo atraviesa por diferentes estados de malnutrición a lo largo de su vida intentando siempre restablecer el equilibrio y coexistir con un estado nutricional saludable. Cuando nos alejamos de ese estado de equilibrio nutricional saludable y nos mantenemos en un estado de malnutrición crónico es cuando se desencadenan enfermedades que comprometen nuestra salud y aumentan nuestro riesgo de muerte.

Individuos occidentales consumen preferentemente alimentos procesados, con alta carga energética y enriquecidos en azúcares, grasas y sal, debido principalmente a la sensación de placer que estos causan en nuestro cerebro (respuesta hedónica), y pequeñas cantidades de alimentos ricos en vitaminas, minerales y fibras. Paradójicamente estos tres principales metabolitos son los que se encuentran aumentados en la población mundial reflejados en enfermedades tales como diabetes tipo II, obesidad e hipertensión (Cordain et al., 2005).

Esta involución de las dietas occidentales tiene un origen multifactorial, fundamentalmente los cambios en la producción y la tecnología de alimentos, sumado al ritmo de vida vertiginoso, ha permitido un aumento en la cantidad de alimentos procesados, una mayor durabilidad en estante y su excesiva palatabilidad, priorizando la cantidad de alimento producido sin importar el cómo. Esto sin duda ha atentado contra su calidad nutricional, obteniéndose cada vez más alimentos hipercalóricos, ricos en sal, y compuestos químicos como conservantes, emulsionantes, edulcorantes, nutricionalmente pobres que contribuyen a la malnutrición mundial.

Introducción

9

Estadísticas Mundiales (WHO|Obesity and overweight)

Datos y Cifras

Desde 1980, la obesidad se ha duplicado en todo el mundo. En 2013, más de 42 millones de niños menores de cinco años tenían sobrepeso. En 2014, casi 2000 millones de adultos (39%) tenían sobrepeso, de los cuales, más de 600

millones (13%) eran obesos en todo el mundo. Cada año mueren, al menos 2.8 millones de personas a causa de la obesidad o sobrepeso. Incrementos notables en las tasas de prevalencia evidencian que el sobrepeso y la obesidad se

han convertido en la epidemia del siglo XXI.

Por otro lado Alrededor de 795 millones de personas en el mundo no tienen suficientes alimentos para llevar

una vida saludable y activa. La gran mayoría de personas que padecen hambre en el mundo viven en países en desarrollo,

donde el 13% de la población presenta desnutrición.

Evaluando estas cifras de la OMS rápidamente se puede ver la tendencia actual de la malnutrición mundial, donde si bien se han reducido las tasas de desnutrición no se ha solucionado completamente el problema y además este convive con una creciente epidemia de sobrepeso y obesidad mundial mostrando el nuevo curso que preocupa a las autoridades de salud pública de todo el mundo.

En Argentina, hasta el año 2005, no se disponía de estadísticas confiables acerca de la prevalencia del sobrepeso y la obesidad a nivel nacional. A partir del 2005 se tomó conciencia y se realizaron censos (WebINDEC - Sociedad / Salud / Factores de riesgo) que arrojaron datos y preocupación en este sentido, ya que nos encontrábamos dentro de los países con mayor tasa de sobrepeso y obesidad mundial por debajo de EEUU y muy similares a México.

Introducción

10

Estadísticas nacionales (WebINDEC - Sociedad / Salud / Factores de riesgo)

Año 2005 El 34.5% de la población presentaba sobrepeso y un 14.6% obesidad. Por lo

tanto, en su conjunto, el 49.1% de la población argentina presentaba sobrepeso. Se halló una prevalencia más elevada de obesidad en hombres que en mujeres

(15.4% vs. 13.9%) Los sujetos con menores ingresos (16.3%) y menor nivel educativo (21.4%), eran

los más afectados.

Año 2009 La prevalencia nacional de obesidad fue del 18% y la de sobrepeso del 35.4%

(53% de sobrepeso en total). Las provincias con menor prevalencia de obesidad resultaron ser la Ciudad

Autónoma de Buenos Aires (13.5%) y Misiones (13.9%). Los hombres nuevamente tuvieron mayor prevalencia de obesidad que las

mujeres (19.1% vs. 17.1%). Se halló un aumento de la prevalencia de obesidad directamente proporcional al

aumento de la edad, registrándose entre los 50 y 64 años el valor más elevado (27.3%) a partir del cual la tasa comenzó a disminuir.

Nuevamente hubo mayor prevalencia de obesidad en los grupos más vulnerables, es decir con menor nivel educativo (26.6%) y menores ingresos (20.1%).

Año 2013

El estudio mostró que el 37.1% de la población presentaba sobrepeso y el 20.8% obesidad (60% de la población argentina presentaba sobrepeso).

De manera similar a lo hallado en años anteriores, la prevalencia de obesidad resultó mayor entre grupos de menor nivel socioeconómico.

Con esto se puede evidenciar un ininterrumpido crecimiento de las tasas de sobrepeso y obesidad en Argentina (Custodio et al., 2015) lo cual acompaña a la tendencia mundial. Si esto no nos parece demasiado ahora viene el dato curioso, y es que posiblemente somos pioneros en obesidad infantil, siendo uno de los países con mayor tasa a nivel mundial. Según datos de 2010 de la Base de Datos Global sobre Crecimiento Infantil y Malnutrición de la OMS, Argentina presenta el mayor porcentaje de obesidad infantil en niños y niñas menores de cinco años en la región de América Latina con un 7,3% de prevalencia. Destacando además que nuestro país todavía no dispone de datos estadísticos propios acerca de esta preocupante noticia.

Introducción

11

Responsables

Hasta principios del siglo XX, se consideraba a la obesidad una problemática individual, producto del descontrol con las comidas, y por lo tanto de total responsabilidad de cada individuo. Esta situación se fue modificando a lo largo del tiempo y en la actualidad la obesidad es declarada una epidemia de carácter global, multifactorial que involucra y responsabiliza a varios sectores importantes de la sociedad “el consumidor”, “el estado”, “la industria alimentaria” y “las ciencias de la salud”, por lo que es considerada una gran problemática para la salud pública y la economía mundial.

Otro concepto erróneo que se ha modificado con el tiempo, es considerar el sobrepeso y la obesidad un problema propio de los países desarrollados con altos ingresos, cuando en realidad estos trastornos están aumentando en los países subdesarrollados con ingresos bajos y medios, en particular en los entornos urbanos. En los países en desarrollo con economías emergentes el incremento porcentual del sobrepeso y la obesidad en los niños ha sido un 30% superior al de los países desarrollados, y Argentina encabeza esa lista (WHO | Obesity and Overweight 2016).

Muchos países de ingresos bajos y medianos actualmente están afrontando una doble carga de morbilidad, mientras continúan lidiando con los problemas de las enfermedades infecciosas asociadas a la desnutrición, están experimentando un aumento brusco en los factores de riesgo de contraer enfermedades metabólicas como la diabetes y la obesidad. No es raro encontrar la desnutrición y la obesidad coexistiendo en un mismo país, una misma comunidad y dentro de un mismo hogar. En los países de ingresos bajos y medianos, los niños son más propensos a recibir una malnutrición prenatal, lactante y del niño pequeño insuficiente. Al mismo tiempo, están expuestos a alimentos hipercalóricos ricos en grasas, azúcares, sal y pobres en micronutrientes, que suelen ser económicos. Estos malos hábitos alimentarios, juntamente con una escasa actividad física, y una falta de políticas de salud pública tienen como resultado un crecimiento brusco de la obesidad en esta época en que los problemas de desnutrición continúan sin resolverse.

Teniendo en cuenta los datos epidemiológicos, que muestran un ininterrumpido crecimiento de las tasas de obesidad en Argentina, es fundamental que las políticas públicas continúen llevando a cabo acciones encaminadas a disminuir la prevalencia e incidencia, a través del relevamiento, la prevención y un diagnóstico oportuno. En relación con la prevención, es importante intensificar los esfuerzos en la implementación de estrategias efectivas orientadas a reducir esta enfermedad. Es en este punto donde intentamos contribuir con el análisis de cepas bacterianas que puedan ser implementadas como potenciales probióticos para ser aplicados en casos de malnutrición. Remarcando que la obesidad es una problemática compleja, imposible de resolverse a partir de medidas

Introducción

12

Inmunidad y malnutrición, in medio stat virtus.

aisladas y simples, por lo cual es esencial su abordaje desde un enfoque interdisciplinario y multisectorial.

Priorizar la obesidad como problema sanitario e implementar acciones desde las políticas públicas, es fundamental para poder revertir esta tendencia (WHO | Obesity and Overweight 2016).

El sistema inmune requiere un apropiado suministro de energía de los alimentos para sostener su función biológica normal. El riesgo de infección aumenta cuando la energía es insuficiente (desnutrición), o bien el otro extremo, donde se observa una inflamación crónica de bajo grado cuando los nutrientes están en exceso (obesidad). La comprensión de cómo las diferentes vías metabólicas de señalización intracelulares pueden afectar la función inmune y cómo la desregulación nutricional, observada en la desnutrición y la obesidad, es capaz de alterar la respuesta inmune está emergiendo como un nuevo campo de investigación. De hecho, hay una gran cantidad de evidencia que indica que la deficiencia en uno o más nutrientes disminuye tanto la respuesta inmune innata como adaptativa y proporciona una ventana de oportunidades para las enfermedades infecciosas. Por ejemplo, la deficiencia de proteína causa atrofia de los órganos linfoides primarios y secundarios y afecta a varias funciones inmunes, tales como la proliferación de linfocitos, las respuestas de anticuerpos, y la producción de IFN-γ (Calder, 2013; Herrera et al., 2014). Mientras que la deficiencia de nutrientes se asocia con una mayor susceptibilidad a la infección y la muerte, la sobrecarga metabólica, secundaria a un aumento del consumo de alimentos de alta densidad energética, se correlaciona con una alta incidencia de trastornos inflamatorios y autoinmunes. De hecho, los cambios en los hábitos alimenticios, en particular la promoción de una dieta con alto contenido en grasas, azúcares, sal y exceso de calorías, representa el principal factor subyacente de la "explosión" de la obesidad en las últimas dos décadas (Ng et al. 2014; Mraz and Haluzik 2014).

Introducción

13

Tejido adiposo: Inmunidad y Metabolismo

¿Porque la acumulación excesiva de grasa o la falta de ella, se encuentra en el núcleo de todos estos problemas?

El tejido adiposo (TA) no es más considerado un mero depósito de energía o un medio de aislamiento térmico y mecánico como lo fue hace unos 20 años, en la actualidad y debido a intensas investigaciones se considera un órgano muy activo involucrado en numerosos procesos metabólicos, endócrinos e inmunológicos, superando ampliamente incluso a órganos como el hígado en la producción de citoquinas (de 100 a 1000 veces mayor) (Gerner et al., 2013). La característica pleiotrópica del TA se debe a su capacidad para secretar una gran cantidad de hormonas, citoquinas y metabolitos denominados “Adipoquinas”, estos productos son capaces de actuar no sólo a nivel local sino también a nivel sistémico afectando a otros órganos donde desempeñan un papel crucial para mantener la homeostasis del organismo.

Teniendo en cuenta que el tejido adiposo es el blanco principal donde impactan los cambios nutricionales, está sometido a una remodelación dinámica y plástica, donde se observan diferentes modificaciones anatómicas, celulares y moleculares que se alteran y conducen al desarrollo de trastornos inmuno-metabólicos durante la malnutrición. Algunos de estos mecanismos incluyen la disfunción endócrina (Blüher, 2009), hipoxia del TA (Trayhurn, 2013) y la disminución de la capacidad de almacenamiento de lípidos con su posterior acumulación ectópica (Ravussin and Smith, 2002). Sin embargo, uno de los conceptos, en cuanto a mecanismos, que vincula el exceso de adiposidad con diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y complicaciones cardiovasculares, incluye el desarrollo de la inflamación crónica de bajo grado, caracterizada por la infiltración de células inmunes en el TA, aumento de la producción y secreción de factores pro-inflamatorios a la circulación y resistencia a la insulina (Weisberg et al., 2003; Neels and Olefsky, 2006; Mraz and Haluzik, 2014a; Choe et al., 2016).

Este enfoque coloca al tejido adiposo en la intersección entre la nutrición, el metabolismo y la inmunidad y propone que su alteración es uno de los mecanismos centrales que relaciona el estado de malnutrición con desórdenes inmuno-metabólicos.

Introducción

14

Remodelación del TA en la malnutrición

¿Cuáles son los principales cambios estructurales que sufre el TA durante lamalnutrición?

La composición del tejido adiposo tiene una gran plasticidad y está regulada por el peso corporal, así como la alimentación y el ayuno, y puede responder rápidamente a las alteraciones en el exceso o la falta de nutrientes.

Estas alteraciones se pueden resumir como cambios en (Blüher, 2013):

La acumulación de grasa visceral (ectópica), La composición de la matriz extracelular e intracelular del TA, El número de células inmunes dentro del TA, La hipertrofia y la hiperplasia de los adipocitos, La autofagia y la apoptosis, El perfil de ARNm y la expresión de adipoquinas

En ratones delgados, la composición de células inmunes en el tejido adiposo está representada principalmente por células con un fenotipo anti-inflamatorio, incluyendo macrófagos activados alternativamente (M2), células T reguladoras (Treg), eosinófilos y células linfoides innatas tipo II (ILC2), mientras que en animales con obesidad hay un cambio en la polarización hacia un perfil inflamatorio, reinado principalmente por macrófagos M1, células Th1, Th17 y neutrófilos que favorecen un estado pro-inflamatorio (Mraz and Haluzik, 2014). Tomados en conjunto, estos datos indican que el tejido adiposo en individuos delgados se encuentra principalmente constituido por células que favorecen una respuesta de tipo Th2 (macrófagos M2, eosinófilos, ILC2 y Treg, principalmente) (Molofsky et al., 2013; Bouchery et al., 2015), estas células mantienen una comunicación óptima con los adipocitos que asegura un perfil adecuado de adipoquinas, la homeostasis metabólica y la tolerancia inmune. En la obesidad un cambio de fenotipo hacia un perfil Th1/Th17 establece la base de una respuesta inflamatoria exacerbada que contribuye a una inflamación crónica, desregulación metabólica y autoinmunidad en individuos genéticamente susceptibles (De Rosa et al., 2015a; Galgani et al., 2015).

Los fenómenos de expansión que sufre el TA de un individuo obeso se podrían describir de forma general de la siguiente manera: cuando los adipocitos crecen en número (hiperplasia) y en tamaño (hipertrofia) de forma desmedida, se induce la hipoxia del TA por la obstrucción de vasos sanguíneos y reducción en el suministro de sangre, lo que lleva principalmente a la necrosis de adipocitos, con liberación de ácidos grasos y proteínas quimioatrayentes de monocitos como MCP-1, favoreciendo la infiltración de macrófagos en el tejido, la posterior formación de estructuras en forma de coronas (adipocitos necróticos

Introducción

15

rodeados por macrófagos) y la sobreproducción de moléculas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6, IL-1β, etc.) lo que perpetua el circulo vicioso de la meta-inflamación (inflamación de órganos metabólicos) (Xu et al. 2003; Kosteli et al. 2010). Por otro lado esto no sucede en el TA de individuos delgados donde, como explicamos anteriormente, el fenotipo del tejido adiposo está dominado por adipocitos de menor tamaño y un perfil de macrófagos M2 o “activados alternativamente” que protegen contra la resistencia a la insulina y la inflamación crónica a diferencia de los macrófagos M1 o “activados clásicamente”, pro-inflamatorios (Mraz and Haluzik 2014).

Los macrófagos representan la mayor subpoblación de células inmunes del TA, abarcando desde un 5%, en individuos delgados, hasta un 50% en obesos como se mencionó anteriormente (Weisberg et al., 2003; Xu et al. 2003), esta infiltración masiva de macrófagos en el TA, sumado a una polarización M1 (pro-inflamatoria) es considerado hoy en día uno de los responsables de la inflamación crónica desarrollada en la obesidad. Además de los macrófagos, otras células inmunes, tales como los neutrófilos, las células dendríticas, células NK y células Th1, se acumulan en el tejido adiposo durante la obesidad y contribuyen a la amplificación de la inflamación. Los datos de la literatura muestran que las células que se infiltran en el tejido adiposo producen gran cantidad de citoquinas Th1, tales como TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-6 además de leptina, que son responsables de la inflamación crónica y la resistencia a la insulina que acompaña a la obesidad (Cipolletta et al. 2012, Procaccini et al. 2013).

La obesidad se acompaña de una inflamación crónica de bajo grado que se caracteriza por elevaciones crónicas de citoquinas y adipoquinas inflamatorias en la circulación, como se mencionó anteriormente, y que en algunos casos ha llegado a ser considerado una causalidad más que una casualidad del desarrollo de esta enfermedad (Sanz et al., 2010; Glass and Olefsky, 2012). A nivel del TA, las vías inflamatorias son inducidas debido en parte a los cambios cuantitativos y fenotípicos dinámicos en los leucocitos del tejido, principalmente macrófagos (Glass and Olefsky, 2012; Cho et al., 2014; Cho, Morris, and Lumeng 2014; Mraz and Haluzik 2014). Según Weisberg et al., en modelos murinos de obesidad, el contenido de macrófagos podría aumentar hasta aproximadamente 50% del total de células no-adiposas (Weisberg et al., 2003). Los macrófagos infiltrados en el tejido adiposo blanco son la principal fuente de citoquinas como TNF-α o IL-6 (Antuna-Puente et al. 2008).

Introducción

16

Figura 1| Modulación fenotípica del tejido adiposo. El tejido adiposo puede ser descrito por al menos tres Clasificaciones funcionales: magra con función metabólica normal, obeso con disfunción metabólica leve y obeso con Disfunción metabólica. Los cambios cualitativos en el tejido adiposo en expansión pueden promover el Fenotipo metabólicamente disfuncional. Los macrófagos en tejido adiposo magro expresan marcadores de un Macrófago M2 o activados alternativamente, mientras que la obesidad conduce al reclutamiento y acumulación de Macrófagos M1 o activados clásicamente, así como células T, En el tejido adiposo. Las adipoquinas anti-inflamatorias, incluyendo la adiponectina y la proteına 5 relacionada con frizzled secretada (SFRP5), son preferentemente producidas por el tejido adiposo magro. En los estados de obesidad, el tejido adiposo genera grandes cantidades de adipoquina pro-inflamatorias, Incluyendo leptina, resistina, proteína 4 de unión al retinol (RBP4), lipocalina 2, proteína similar a la angiopoyetina 2 (ANGPTL2), Factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina-6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18), proteína quimiotrayente de monocitos (MCP-1), quimioquina con motivo CXC 5 (CXCL5) y Nicotinamida

Introducción

17

Las principales Adipocitoquinas involucradas en la meta-inflamación se describen a continuación:

TNF-α:

El factor de necrosis tumoral es una glicoproteína de 185-aminoácidos que fue descrito inicialmente por su capacidad para inducir la necrosis en ciertos tumores (Carswell et al., 1975). Estimula la fase aguda de la respuesta inmune. Esta citoquina es un pirógeno potente, uno de los primeros en ser liberados en respuesta a un patógeno, y es capaz de ejercer sus efectos en muchos órganos (Beutler, 1999). Como tal, el TNF-α es una de las principales citocinas responsables de shock séptico. En el hipotálamo, el TNF-α estimula la liberación de hormona liberadora de corticotropina, suprime el apetito, e induce fiebre. En el hígado, estimula la respuesta inflamatoria aguda mediante la elevación de la síntesis de la proteína C reactiva y de otros mediadores. El TNF-α induce la vasodilatación y la pérdida de la permeabilidad vascular, que es propicio para la infiltración de linfocitos, neutrófilos, y monocitos. Esto ayuda a reclutar estas células al sitio de la inflamación mediante la regulación de la liberación de quimioquinas. TNF-α, en concierto con IL-17, desencadena la expresión de quimioquinas que atraen neutrófilos, como CXCL1, CXCL2, y CXCL5 (Griffin et al., 2012) y también puede aumentar la expresión de moléculas de adhesión celular que facilitan la diapédesis (Vieira et al., 2009). Al ser un inductor de la respuesta inflamatoria, se han encontrado que cantidades en exceso de TNF-α desempeñan papeles patológicos en enfermedades tales como, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, asma, cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades inmuno-metabólicas como la obesidad. En este sentido, el TNF-α es el principal responsable de la resistencia a la insulina asociada a la obesidad, debido a que bloquea la señalización del receptor de insulina (RI), induce un aumento de MCP-1 y posterior reclutamiento de macrófagos al tejido adiposo y favorece la polarización de Macrófagos M2 a M1 característico de la obesidad (Tzanavari et al., 2010).

IL-6:

La interleuquina 6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica que tiene funciones tanto pro- como anti-inflamatorias y afecta a los procesos que van desde la inmunidad a la reparación de tejidos y el metabolismo. Promueve la diferenciación de las células B en células plasmáticas, activa las células T citotóxicas, y regula la homeostasis ósea. Al igual que otras citoquinas pro-inflamatorias, la IL-6 se ha implicado en la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide (Nishimoto and Kishimoto 2004). Similar a TNF-α e IL-1β, IL-6 es un pirógeno endógeno que promueve la fiebre y la producción de proteínas de fase aguda del hígado. Propiedades pro-inflamatorias son provocados cuando IL-6 actúa mediante señales-trans a través del receptor soluble de IL-6 que se une a la proteína gp130, que es

Introducción

18

ubicua en casi todas las células. La inhibición de la señalización trans-gp130 en modelos de sepsis murinos rescata a los ratones de la inflamación generalizada y la muerte (Barkhausen et al., 2011). La señalización trans está asociada con efectos pro-inflamatorios, mediante esta señalización IL-6 recluta monocitos al sitio de inflamación (Hurst et al., 2001), promueve el mantenimiento de las células Th17, e inhibe la apoptosis de las células T y el desarrollo de células T reguladoras (Scheller et al., 2011). En contraste, las propiedades anti-inflamatorias son provocadas cuando las señales son a través de la vía clásica, que se produce a través del receptor de IL-6 que sólo pocas células expresan. Las propiedades anti-inflamatorias de IL-6 se ilustran bien en ratones knockout para IL-6 (IL-6 - / -), que presentan hepatoesteatosis, resistencia a la insulina, e inflamación del hígado (Matthews et al., 2010). La IL-6 es principalmente producida por el tejido adiposo visceral y sus niveles están aumentada en individuos obesos, el tejido adiposo es una fuente importante de IL-6 y la expansión de este tejido en la obesidad puede contribuir con altos niveles de IL-6 en la circulación. Se informó por dos estudios diferentes que niveles de IL-6 en plasma (Kern et al., 2001) y el tejido adiposo (Bastard et al., 2000) se correlacionaba mejor que con niveles de TNF-α, en obesidad y resistencia a la insulina. En general, el papel de la IL-6 en la sensibilidad a la insulina y la homeostasis de la glucosa sigue siendo controvertida, y se especula que las perturbaciones asociadas a la obesidad de la IL-6 y su receptor probablemente tienen diversos efectos según la vía de señalización y los diferentes tejidos y órganos sobre los cuales actúa (Bastard et al., 2007).

IL-10:

La inflamación está estrechamente regulada por varios inhibidores y antagonistas. IL-10 es una citoquina de 35 kD identificada en 1989, y es producido por macrófagos activados, células B y células T (Mosser and Zhang, 2008). Sus actividades principales se refieren a la supresión de la activación de macrófagos y la producción de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 y GM-CSF (Fiorentino et al., 1991). IL-10 suprime la expresión de MHC-II en macrófagos activados y por tanto es un potente inhibidor de la presentación de antígenos (Chadban et al., 1998). De particular interés, se conoce que la IL-10 inhibe la producción de IFN-γ por las células Th1 y NK, e induce el crecimiento, la diferenciación, y la secreción de IgG por células B (Defrance et al., 1992; Rousset et al., 1992). Los macrófagos también se ven afectados por la IL-10 en que la exposición a esta citoquina disminuye su actividad microbicida y disminuye su capacidad de respuesta a IFN-γ (Cunha et al., 1992; Oswald et al., 1992). Los experimentos en modelos murinos han demostrado que el bloqueo o neutralización de IL-10 conduce a mayores niveles de TNF-α e IL-6; por el contrario, la IL-10 exógena mejora la supervivencia y reduce los niveles de citoquinas inflamatorias (Varzaneh et al., 2014). Se ha observado que la reducción de los niveles de IL-10 favorecen el desarrollo de patologías tales como enfermedad inflamatoria del intestino (Varzaneh et

Introducción

19

al., 2014), síndrome metabólico y diabetes tipo 2. La IL-10 se asocia positivamente con la sensibilidad a la insulina, auqnue el mecanismo de acción es desconocido, y negativamente al índice de masa corporal (IMC) y el porcentaje de masa grasa (PMG) (Blüher et al., 2005). IL-10 Recombinante ha sido realmente eficaz en el tratamiento de algunas de estas enfermedades (Nakata et al., 2016).

MCP-1:

1989 fue testigo del nacimiento de MCP-1 (MCP-1) a la luz de la investigación científica en el Instituto Nacional del Cáncer, Maryland, EE.UU (Matsushima et al., 1989). y se encontró que consta de 76 aminoácidos y cuatro residuos de cisteína (Robinson et al., 1989). Debido a su alta abundancia y producción ubicua, MCP-1 es la primera quemoquina descubierta y la más ampliamente estudiada, se caracteriza por la posición conservada de cuatro residuos de cisteína (con la primera de dos adyacentes entre sí) que forman un puente disulfuro intra-molecular para estabilizar el péptido (Van Coillie et al., 1999). Por lo tanto, esta proteína también se conoce como quimiocina (CC motivo) ligando 2 (CCL2). El receptor principal utilizado por MCP-1 es CCR2, que consiste en dos isoformas, CRR2A y CCR2B, derivadas de un único gen, mediante corte y empalme alternativo, y difieren en sus colas carboxilo terminal (Charo et al., 1994). La señalización de MCP-1 tiene un papel directo en el desarrollo de la obesidad. Por ejemplo, Younce et al. reportaron que la proteína inducida por MCP-1 (MCPIP, una proteína de dedos de cinc) induce adipogénesis en células 3T3-L1 (Younce et al., 2009). Además, ratones con deficiencia de CCR2 habían atenuado la deposición de grasa visceral y la resistencia a la insulina cuando fueron estimulados con una dieta alta en grasas (Weisberg et al., 2006). Por otro lado, MCP-1 tiene efecto angiogénico en las células endoteliales (Salcedo et al., 2000), y por lo tanto puede contribuir a la expansión y remodelación del tejido adiposo. Finalmente, se encontró que la expresión de MCP-1 es mayor en la grasa omental que en la grasa subcutánea en pacientes con obesidad severa, lo que fue acompañado por una infiltración elevada de macrófagos en el tejido adiposo (Harman-Boehm et al., 2007).

Introducción

20

El vínculo entre la inmunidad y la nutrición: El concepto de

Desde el descubrimiento de la adipsina en 1987 (Cook et al., 1987), la leptina en 1994 (Zhang et al., 1994), y la adiponectina en 1995 (Scherer et al., 1995) se han descubierto más de 600 adipoquinas, lo que cambio el concepto del TA, pasando de un mero depósito de grasa al de un potente órgano endócrino (Lehr et al., 2012). En la actualidad, representa un tema candente de investigación la búsqueda de nuevas adipoquinas (Blüher, 2014; Fasshauer and Blüher, 2015). Algunas de las adipoquinas más estudiadas incluyen leptina, adiponectina, resistina, visfatina, activador de plasminógeno inhibidor-1 (PAI-1), factor tisular (TF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), proteína quimioatrayente de monocitos -1 (MCP-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) e interleuquina 10 (Blüher, 2012a), involucradas en la regulación de procesos que incluyen el metabolismo, la inflamación y la respuesta inmune. Los niveles de estas moléculas están alterados en individuos malnutridos (obesidad y desnutrición) en comparación con individuos normopeso, esto inclina la balanza y predispone a una mayor susceptibilidad a infecciones, y una inflamación sistémica global asociada con el desarrollo de obesidad y sus comorbilidades (Fantuzzi 2005; Hajer, Haeften, and Visseren 2008; Wolowczuk et al. 2008).

El tejido adiposo se encuentra distribuido en todo el cuerpo y en asociación con múltiples órganos vitales, incluyendo el corazón, los riñones, la médula ósea, los pulmones y la adventicia de los vasos sanguíneos. De esta manera las adipoquinas impactan en el funcionamiento de estos órganos y son relevantes en el estado de salud general de un individuo. Se ha demostrado que cambios en las dietas alteran el perfil de adipoquinas, por ejemplo, dietas con alto contenido calórico pueden promover el desarrollo de un estado pro-inflamatorio local del tejido adiposo (Chatterjee et al. 2009) con aumento de triglicéridos, colesterol y leptina, que luego repercute a nivel sistémico (Takaoka et al. 2009). A su vez, la secreción de adiponectina, leptina y ácidos grasos, está regulada por el ayuno, éste aumenta la lipólisis del tejido adiposo y la liberación de ácidos grasos no esterificados (NEFA), disminuye de forma aguda la leptina circulante (Boden et al. 1996), mientras que tiende a aumentar la adiponectina (Halberg et al. 2005). Es por esto que se le atribuye al TA un papel clave en la integración de la homeostasis sistémica, mediada por su capacidad de secretar adipoquinas en respuesta a diferentes estímulos presentes en la dieta. (Ouchi et al. 2011). Con la aparición de la obesidad se observan cambios en la composición celular, fenotípica y localización de este tejido, que involucra a células inmunes, vasculares y estructurales (Samaras et al. 2010; Esteve Ràfols 2014). Esto lleva a un perfil de adipoquinas desregulado (Blüher, 2009) lo que contribuye a la desregulación del apetito, la saciedad, la distribución de grasa, la secreción y sensibilidad a la insulina, el gasto energético, la respuesta inmune,

Introducción

21

el metabolismo de azúcares y grasas, la sensibilidad a la insulina y la adipogénesis entre otros procesos biológicos (Catalán et al. 2009; Roth et al., 2011; Matthias Blüher 2012; Matthias Blüher 2014). Por todo lo mencionado anteriormente, consideramos que la regulación correcta del perfil de adipoquinas podría ofrecer nuevas alternativas para el futuro tratamiento de enfermedades relacionadas con la dieta como la obesidad y sus trastornos asociados.

Figura 2| El tejido adiposo a través de las adipoquinas regula importantes procesos fisiológicos. Los factores secretados por el tejido adiposo impactan en diferentes órganos y desempeñan un papel importante en la regulación del apetito y la saciedad, el gasto energético, la sensibilidad a la insulina y la secreción de insulina, la inflamación, la presión arterial, Hemostasia, función endotelial entre otros.

Introducción

22

El camino de la leptina desde su descubrimiento a la aplicación clínica en pacientes con deficiencia congénita (Farooqi et al., 1999) puede servir como el primer ejemplo de éxito de la investigación traslacional de adipoquinas, donde la regulación del perfil de adipoquinas puede representar una nueva estrategia prometedora en casos de malnutrición.

La leptina es una proteína multifuncional de 16 kDa secretada principalmente por los adipocitos y fundamental en la regulación del balance energético. Aunque el papel más importante de la leptina es el de regular el peso corporal a través de la inhibición de la ingesta de alimentos y la estimulación del gasto energético en el hipotálamo, la bibliografía indica que es mucho más que un simple sensor de grasa corporal. La secreción de leptina es proporcional a la cantidad de TA, al índice de masa corporal (IMC) y a algunos marcadores inflamatorios como el TNFα (Mantzoros et al. 1997; van Dielen et al. 2001). Los niveles de leptina aumentan con la ingesta de energía y disminuyen rápidamente con el ayuno, no obstante, en la secreción de leptina influyen toda una serie de factores como la insulina, los glucocorticoides, los estrógenos, andrógenos, ácidos grasos, los agonistas del receptor activador de la proliferación de peroxisomas (PPAR-γ), entre otros. Esta hormona se ha considerado como el prototipo de adipoquina (Sahin-Efe et al., 2012) y afecta a varios procesos fisiológicos como la saciedad, el apetito, la ingesta de alimentos, la función reproductiva, la regulación de la actividad y el gasto de energía, principalmente . Originalmente, la leptina fue vista como un agente terapéutico potencial “anti-obesidad” y fue desarrollado principalmente con el objetivo de reducir la masa de grasa corporal en la obesidad (Farooqi et al., 1999). En ratones (Halaas et al., 1995)y en seres humanos (Farooqi et al., 2002) con deficiencia de leptina heredada genéticamente, la leptina se ha demostrado como un fármaco eficaz para la pérdida de peso, pero en pacientes o roedores con obesidad inducida por dietas hipercalóricas, que representan la mayoría de los casos de obesidad hoy en día, la leptina casi no tiene efectos sobre la pérdida de peso debido a la resistencia a la leptina que desarrollan estos individuos (Mantzoros et al. 2011; Dardeno et al. 2010). La falta de eficacia de la leptina en la obesidad inducida por la dieta es debido al desarrollo de resistencia central a la misma (hipotálamo) o tolerancia en paralelo con el aumento de los niveles circulantes de leptina sobre durante y antes del desarrollo de la obesidad conocido como estado de hiperleptinemia (Vasselli et al. 2013; Zhou and Rui 2013). En la actualidad no existen fármacos eficientes en la regulación de los niveles de leptina sin efectos adversos, con lo cual las nuevas estrategias orientadas a regular el perfil de adipoquinas sin impacto negativo sobre la salud son muy atractivos.

Leptina, la adipoquina modelo

Introducción

23

Una vez que la leptina es secretada por el tejido adiposo al torrente sanguíneo, debe llegar a sus órganos blanco y ser reconocida por los receptores de la superficie celular. Los receptores encargados de reconocer la leptina fueron caracterizados por primera vez por Tartaglia y colaboradores (Tartaglia et al., 1995), y descriptos como receptores pertenecientes a la familia de citoquinas de clase I con un sólo dominio transmembrana. A la fecha, se han detectado receptores para leptina (Ob-R) en casi todos los tejidos y se han descripto seis isoformas que provienen del mismo gen, pero sufren un corte y empalme alternativo para dar origen a cada una de ellas (Hoggard et al. 1997). Estas isoformas se pueden agrupar según su longitud en tres grupos: la forma larga (OB-Rb), las formas cortas (OB-Ra, c, d, f) y la soluble (OB-Re). La forma larga, con dominio extracelular, transmembrana e intracelular, tiene la capacidad de traducir señales y se expresa principalmente en el hipotálamo, en donde la leptina ejerce su acción central como inductora de saciedad y reguladora del peso corporal. Las formas cortas del receptor, son de menor talla ya que carecen del dominio intracelular, estas se localizan en el hipotálamo y en tejidos como pulmones, riñones y cerebro, entre otros y si bien son capaces de activar cascadas de señalización, su función primordial es la internalización y degradación de la leptina (Uotani et al., 1999). Por último, La forma soluble del receptor que carece de dominios intracelular y transmembrana, tiene una gran afinidad por la leptina y se piensa que regula las concentraciones plasmáticas de la misma (Chan et al., 2002). Sin embargo, los receptores cortos y solubles al ser expresados en distintos tejidos al hipotálamo pueden estar relacionados con eventos independientes del consumo de alimento, pues la leptina se ha visto también involucrada en el control del ritmo circadiano (ciclo de aproximadamente 24 horas que regula el proceso del hambre y del sueño), maduración sexual, función renal y cardiovascular, formación de hueso, estimulación hematopoyética y actividad fagocítica de macrófagos, entre otras (Wauters et al., 2000).

Además de la posible terapia farmacológica, es también importante estudiar la influencia de la dieta sobre la acción de la leptina y su receptor como posible prevención a la resistencia a la leptina. Así, las dietas crónicas, altas en lípidos pueden tener consecuencias como el desarrollo de obesidad, hiperleptinemia y resistencia a la leptina. Esto se explica por una menor concentración de la expresión de receptores de leptina en el hipotálamo de animales consumiendo dietas con alto contenido de grasa (Cheng et al., 2015).

Ob-R, El receptor de leptina

Introducción

24

El descubrimiento de la leptina ha establecido un enlace entre el estado nutricional, el metabolismo y la respuesta inmune (Matarese et al., 2005; Matarese et al., 2012). A pesar de su principal función (regular el peso corporal), la leptina tiene un importante efecto sobre la inmunidad innata y adaptativa (Matarese et al., 2005). La leptina tiene un papel directo y específico en el sistema inmunológico, el control del equilibrio entre la activación inmune y auto -tolerancia. En la inmunidad innata, modula la actividad y la función de los neutrófilos, la fagocitosis por los monocitos/macrófagos y la actividad citotóxica de las células NK (Mancuso et al., 2002; Tian et al., 2002). Además, la leptina mejora la secreción de moléculas pro-inflamatorias de fase aguda, la expresión de moléculas de adhesión, así como la secreción de perforina y de IL-2 (Zhao et al., 2003). En la inmunidad adaptativa, la leptina afecta el desarrollo de las células T del timo; donde aumenta la proliferación de células T naïve y la secreción de IL-2 y promueve, en las células T de memoria, el interruptor hacia una respuesta inmune Th1/Th17 (Howard et al., 1999; Martín-Romero et al., 2000; Reis et al., 2015). Ratones deficientes en leptina (ob/ob) o su receptor (db/db) tienen varias alteraciones inmunes, tales como atrofia del timo, órganos linfoides más pequeños y disminución de la producción de IL-2 e IFN-γ. Por otra parte, ratones ob/ob han reducido la secreción de citocinas Th1 y aumentado la producción de citoquinas de tipo Th2, incluyendo IL-4 e IL-10; como resultado, son resistentes a la inducción de varias enfermedades autoinmunes, como la artritis inducida por antígeno (AIA), encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la hepatitis inducida experimentalmente (EIH) (Matarese et al. 2001; Busso et al., 2002; Siegmund et al. 2002). En los seres humanos mutaciones ob/ob se caracterizan por hiperfagia, obesidad, defectos inmunes y una mayor susceptibilidad a las infecciones (Farooqi et al., 2002). Por el contrario, varias condiciones inflamatorias crónicas, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), diabetes tipo I (DT1) y artritis reumatoide (AR) se asocian con aumento de la secreción de leptina (Alastair, Emma, and Emma 2011; Sera et al. 2000; Bokarewa et al. 2003). La leptina circulante también es capaz de modular la función de las células Treg, a través de la participación de las vías metabólicas específicas. De hecho, De Rosa et al. han demostrado que células Treg secretan leptina y expresan altas cantidades de su receptor (Ob-R); mostrando un impacto negativo de la leptina en la proliferación de este subconjunto de células (De Rosa et al., 2007). Los estudios publicados muestran que la obesidad inducida por la dieta está asociado con un aumento de tejido adiposo asociado a una infiltración de células inmunes (como se describió anteriormente) y una reducción progresiva de células Treg en el TA (Feuerer et al., 2009).

La leptina un vínculo clave entre la nutrición y la respuesta inmune

Introducción

25

Entre los factores relacionados con la dieta, los ácidos grasos, proteínas y carbohidratos han demostrado que influyen en la concentración de leptina (Cha and Jones 1998, Kratz et al. 2002, Weigle et al. 2005).

En conjunto, estas líneas de evidencia apoyan la hipótesis de que el tejido adiposo, utilizando las adipoquinas como mediadores, afecta a la capacidad de las células inmunitarias para responder a estímulos propios o extraños, lo que refleja una función regulatoria sobre el metabolismo y la tolerancia inmune.

La relación entre la dieta, la microbiota y la inmunidad es compleja y existe considerable evidencia en la literatura sobre los efectos de la malnutrición sobre la microbiota y las alteraciones inmunológicas durante toda la vida. Para entender la importancia de la microbiota intestinal en la malnutricion, es crucial entender cómo los microorganismos del intestino interactúan con el huésped y participan en la respuesta metabólica a la dieta (Delzenne and Cani, 2011).

La maduración del sistema inmune requiere factores específicos como la exposición a moléculas derivadas de alimentos y microbios. La malnutrición afecta estos procesos, lo que hace que un individuo sea más susceptible a enfermedades infecciosas; o bien el otro extremo, donde el exceso de nutrientes y el consumo excesivo de alimentos densos en energía lleva a respuestas inmunes desequilibradas y un estado inflamatorio crónico que se asocia con la obesidad (Ojeda et al., 2015).

Tomados en conjunto, estos datos revelan la importancia de mantener un equilibrio nutricional para una respuesta inmune óptima. Además, por otro lado, apoyan la utilización de estrategias nutricionales con la suplementación de probióticos y prebióticos, los cuales pueden impactar sobre la microbiota intestinal, el sistema inmune y proporcionar una nueva herramienta para reestablecer las alteraciones metabólicas inducidas por la malnutrición.

Dieta y Microbiota: Inmunidad y Metabolismo

Introducción

26

Figura 3| Cambios inducidos por una dieta alta en grasas, que van desde, La alteración de la microbiota intestinal (aumento de Proteobacterias, Firmicutes y reducción de Bacteroidetes), la alteración de la barrera intestinal con translocación de metabolitos microbianos y activación del sistema inmune, infiltración de macrófagos en diferentes órganos (inflamación local), con producción de mediadores inflamatorios que son liberados y contribuyen con la activación de más células inmunes, inflamación sistémica, resistencia a la insulina, resistencia a leptina, expansión del tejido adiposo y finalmente el desarrollo de enfermedades metabólicas como la obesidad o el síndrome metabólico.

Introducción

27

La comunidad microbiana intestinal, conocida comúnmente como microbiota intestinal (MI), y los genes comprendidos por la misma, conocido como microbioma, son complejos y se componen de diferentes tipos de microorganismos, desde virus hasta células eucariotas, donde encontramos a más de 1.000 especies bacterianas diferentes entre diferentes individuos (Qin et al., 2010). Esta microbiota es diversa e impacta sobre la fisiología y la salud humana (Palm, de Zoete, and Flavell 2015). Algunas de las funciones de la MI comprenden: la eficiencia digestiva, la extracción de energía, el tránsito intestinal, la síntesis de péptidos endócrinos y la madurez del sistema inmune del hospedador (Koppel and Balskus, 2016; Rooks and Garrett, 2016).

Los microorganismos comensales que constituyen la MI, están adaptados de forma única para la extracción de nutrientes luminales (Damms-Machado et al., 2015), con la presencia de enzimas que degradan carbohidratos y conducen a la producción de nutrientes importantes, tales como ácidos grasos de cadena corta (AGCC), (acetato, propionato y butirato), (Ganapathy et al., 2013), biohidrogenación con producción de ácido linoleico conjugado (CLA) (Devillard et al., 2007), vitaminas (vitamina K, vitamina B12 y ácido fólico) (LeBlanc et al., 2013), ácidos y aminoácidos que los seres humanos no pueden producir por ellos mismos y que impactan sobre la salud del huésped. Además, la MI contribuye en el desarrollo, maduración y mantenimiento de las funciones motoras, la barrera intestinal y el sistema inmune de la mucosa (Sekirov et al. 2010; Aziz et al. 2013).

En cuanto al efecto protector de la MI, dos factores distintos contribuyen al mismo. En primer lugar, muchos patógenos bacterianos intestinales están mal adaptados para competir con microorganismos comensales por nutrientes de la dieta, lo que restringe su colonización luminal (Stecher et al., 2005). En segundo lugar, los microorganismos simbióticos estimulan la respuesta inmune contra los patógenos. Por ejemplo, la invasión y diseminación de Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium están limitadas por las respuestas inmunes inducidas por la estimulación de microorganismos comensales sobre los receptores epiteliales Toll-like (TLRs) (Vaishnava et al., 2008). Cuando esta relación simbiótica entre las bacterias comensales y el hospedador se rompe, se pasa a un estado donde algunos miembros específicos de la microbiota pasan del mutualismo a la patogenicidad (disbiosis) lo que puede contribuir al desarrollo o mantenimiento de enfermedades como la obesidad o diabetes tipo II (Delzenne et al. 2015). Este fenómeno es el que se ha reportado en estas enfermedades, donde se observa un aumento de los filos Firmicutes y Proteobacterias y una reducción de Bacteroidetes, demostrando la causalidad del aumento de la adiposidad y las alteraciones metabólicas (Carding et al. 2015).

Está bien establecido que la microbiota intestinal juega un papel crítico en el desarrollo y la función gastrointestinal, la regulación de las respuestas inflamatorias y la

La microbiota intestinal, el superorganismo (una alternativa viable)

Introducción

28

homeostasis inmune (Cebra 1999; Bäckhed et al. 2005). Numerosa evidencia indica que la microbiota actúa como un órgano metabólicamente activo, capaz de interactuar con varios sistemas del hospedador más allá del tracto gastrointestinal, incluyendo el cerebro, el tracto genitourinario y las vías respiratorias (Bravo et al., 2012). La investigación actual sugiere que la microbiota intestinal es capaz de influir en la acumulación de grasa y el metabolismo (Hooper, Midtvedt, and Gordon 2002; Velagapudi et al. 2010), lo cual la posiciona como un objetivo clave en la lucha contra la obesidad junto con la dieta, el ejercicio y otras intervenciones. Las interrupciones en la programación inicial de la microbiota intestinal o alteraciones de la microbiota en sujetos adultos pueden contribuir al desarrollo de la obesidad y la diabetes tipo 2. Los mecanismos propuestos incluyen efectos sobre la saciedad a base de hormonas, la extracción de energía, la regulación del apetito y la endotoxemia metabólica inducida por LPS (Cani et al., 2007a).

La microbiota es moldeada por varios factores como la edad, el tipo de parto, el estrés, el uso de antibióticos, la genética del hospedador, la dieta y el sistema inmune (Rodríguez et al., 2015). Dentro de estos factores podríamos decir que los más relevantes son los de exposición directa y continua, como la dieta, el sistema inmune y la genética. Si tenemos en cuenta que los dos últimos (sistema inmune y genética) están definidos en un individuo, la dieta es el más fácil de modificar y representa la ruta más sencilla para la modificación de nuestra MI (Moschen et al., 2012). Por otro lado, una MI anormal y deteriorada ha sido identificada recientemente en muchas enfermedades diversas como, enfermedades inflamatorias del intestino, cáncer colorrectal, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, obesidad, muchas de ellas inducidas por la dieta (DuPont and DuPont, 2011; Ojeda et al., 2015a; Ussar et al., 2015; Wu et al., 2015).

De esta manera, la dieta representa un factor clave en la modulación de la MI, no solo impacta sobre la estructura de la MI, sino que también afecta su comportamiento y metabolismo, modulando su capacidad para asimilar nutrientes, o producir ciertos metabolitos (Moschen et al., 2012). Debido a la evolución de las técnicas de secuenciación, se ha evidenciado cómo ciertos factores dietéticos afectan el microbioma. Una de las preguntas clave y central es cómo la dieta puede afectar la composición de la MI. En este sentido varios autores han contribuido a clarificar estos temas. Hildebrandt et al. (Hildebrandt et al., 2009) presentaron datos de cómo una dieta alta en grasas podría afectar la composición de la MI murina, incluso independientemente de la obesidad. Los autores encontraron cambios sustanciales en el microbioma intestinal cuando se cambia a una dieta alta en grasas, observando una disminución de Bacteroidetes y un aumento de Firmicutes yProteobacteria. Turnbaugh et al. (Turnbaugh et al., 2009a) presentaron un estudio más en esta

Microbiota, Malnutrición y disbiosis

Introducción

29

dirección. Trasplantaron comunidades microbianas fecales humanas frescas o congeladas en ratones C57BL/6J libres de gérmenes. Curiosamente, estos ratones “humanizados” estaban establemente colonizados y reproducían gran parte de la diversidad bacteriana del donante. Un cambio en la dieta (es decir, a partir de una dieta con bajo contenido de grasa y polisacáridos vegetales hacia una dieta con alto contenido de grasas y azúcares) cambió la estructura de la microbiota incluso en un solo día, altero vías metabólicas y afectó la expresión génica del microbioma. Estos ratones “humanizados” mostraron un aumento de la adiposidad y este rasgo también fue transmisible a través del trasplante de la microbiota. Por lo tanto, ambos estudios muestran claramente que la dieta afecta críticamente el microbioma intestinal y la estructura de la MI, que los cambios se producen rápidamente, incluso dentro de un mismo día y que la adiposidad es transmisible por el trasplante de heces.

Probablemente el estudio clínico más importante en la investigación de la interacción entre la dieta y la MI vino de Wu et al. (Wu et al., 2011). En este estudio, se evaluó la microbiota por pirosecuenciación de segmentos del gen 16S rDNA en 98 sujetos sometidos a diferentes dietas. Las dietas a largo plazo fueron capaces de influir y afectar la estructura de la MI. Filos asociados positivamente con la fibra eran Bacteroidetes y Actinobacteria, mientras que Firmicutes y Proteobacteria mostraron la asociación opuesta. Es importante mencionar, sin embargo, que una dieta a corto plazo más de 24 horas, ya sea con alto contenido de grasa/baja en fibra o baja en grasa/alto contenido de fibra afecta la microbiota, aunque de manera moderada. Finalmente, Las comparaciones de la microbiota intestinal distal de ratones genéticamente obesos y sus compañeros de camada magras, así como los de voluntarios humanos obesos y delgados han revelado que la obesidad se asocia con cambios en la abundancia relativa de las dos divisiones bacterianas dominantes, Bacteroidetes y Firmicutes. Se ha demostrado a través de metagenómica y análisis bioquímicos que estos cambios afectan el potencial metabólico de la microbiota intestinal del ratón (Turnbaugh et al., 2006). Estos resultados indican que el “microbioma obeso” tiene una mayor capacidad para captar energía de la dieta. Por otra parte, este rasgo es transmisible: la colonización de ratones libres de gérmenes con “microbiota obesa” dio como resultado un aumento significativamente mayor de grasa corporal total que la colonización con una “microbiota magra”. Estos resultados identifican la microbiota intestinal como un factor adicional que contribuye a la fisiopatología de la obesidad.

Con respecto a la RC, Machado et al. (Damms-Machado et al., 2015) presentaron un estudio de dos intervenciones restrictivas como la gastrectomía en manga (GM) y una RC con muy bajas calorías (800 Kcal/día, 60% de RC), demostrando el impacto de la RC sobre la MI. Ambas intervenciones produjeron cambios en la relación Firmicutes:Bacteroidetes, pero con una relación inversa entre los filos. Mientras la GM resultó en un incremento de

Introducción

30

Bacteroidetes y una disminución de la abundancia de Firmicutes, la intervención de la dieta resultó en reducción de Bacteroidetes en favor de Firmicutes. En el grupo GM, el número de Bacteroidetes mostró una correlación negativa con el peso corporal, mientras que los Firmicutes se correlacionaron positivamente. Por el contrario, en el grupo de la dieta RC, el peso corporal se correlacionó significativamente positiva con Bacteroidetes e inversamente con Firmicutes. La reducción postoperatoria en Firmicutes, seguido de la GM fue causada por una disminución de los subgrupos de bacterias pertenecientes a grupos clostridiales IV y XIV, que incluyen especies de Clostridium, Eubacterium, Faecalibacterium, Dorea, y Coprococcus. En particular, bacterias productoras de butirato, Coprococcus sp. Eubacterium rectale, Ruminococcus obeum y Lachnospiraceae, experimentaron un descenso en el período postoperatorio. En contraste, se observó un aumento en las especies de Firmicutes específicos en el curso del programa de RC. Estos cambios también se referían a cepas bacterianas productoras de butirato de, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium saccharolyticum, Eubacterium limosum, y hydrogenotrophica Blautia, pero aquí resulto en un aumento de los microbios. Este estudio refleja claramente el impacto de la RC o métodos restrictivos sobre la estructura de la MI.

El impacto de la dieta sobre la composición de la MI y su microbioma abren un nuevo campo de investigación, donde las terapias nutricionales que buscan contrarestar las aletarciones de la MI inducidas por la dieta cobran una gran relevancia, en este sentido debemos acercarnos a la búsqueda de intervenciones nutricionales para manipular especies microbianas específicas del intestino. La utilización de probióticos y prebióticos podría representar una alternativa viable para combatir las alteraciones inducidas por la malnutrición. Con esto se inicia una nueva área de la ciencia clínica con más conocimientos que puedan mejorar nuestra comprensión de la biología del intestino, además de redefinir nuestra visión actual de muchas enfermedades asociadas al tracto gastrointestinal.

La MI es un factor ambiental que influye en el metabolismo de todo el cuerpo al afectar el balance de energía, la función de barrera intestinal, la inflamación, la integración de las señales de regulación de consumo de alimentos periférico y central y por lo tanto el peso corporal. Los probióticos tienen funciones fisiológicas que contribuyen a la salud de la MI y pueden modificarla, con lo cual afectan la ingesta de alimentos, el apetito, el peso corporal, la composición y las funciones metabólicas a través de vías gastrointestinales (Kobyliak et al., 2016). Las diferencias en la composición de la MI entre los seres humanos parecen representar un factor clave que afecta a la homeostasis energética (Ley et al., 2005). Tanto en ratones como en seres humanos, dos Filos bacterianos son dominantes en el

Microorganismos y su Hospedador: el control de la homeostasis energética y metabólica

Introducción

31

intestino, Bacteroidetes Gram-negativas y Firmicutes Gram-positivas (Eckburg et al., 2005). Aunque existen pocos datos a nivel de género y especie, los estudios en ratones y en humanos han demostrado que la obesidad está asociada con una reducción de la abundancia relativa de Bacteroidetes (Armougom et al., 2009; Turnbaugh et al., 2009b), y que la “microbiota” obesa tiene diversidad bacteriana más baja que la “microbiota magra” (Turnbaugh et al., 2008a; Armougom et al., 2009). En los seres humanos con sobrepeso u obesidad, una baja riqueza de genes bacterianos fecales se asocia con mayor adiposidad general, dislipidemia, alteración de la homeostasis de la glucosa y una mayor inflamación de bajo grado (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013).

Se han propuesto varios mecanismos por los que la MI puede afectar el peso corporal. La MI de los sujetos obesos puede ser más eficiente en la extracción de energía de una misma dieta que la MI de personas delgadas lo que puede conducir a un mayor almacenamiento de energía y adiposidad (Turnbaugh et al., 2006). Bäckhed et al. compararon ratones convencionales (con MI) con ratones libres de gérmenes (LG) (sin MI) y observaron que ratones LG consumen más energía, pero son significativamente más delgados que sus homólogos convencionales que albergan MI normal. Tambien vieron que dentro de los 14 días de “convencionalizar” los ratones LG con la MI de ratones convencionales y alimentarlos con una dieta baja en grasas y rica en polisacáridos, los ratones LG convencionalizados acumulaban un 60% más de adiposidad y se volvían resistentes a la insulina, a pesar de una ingesta de alimentos reducida (Bäckhed et al., 2004).Por otra parte, en contraste con los ratones convencionales, los ratones LG alimentados con una dieta rica en grasas y rica en azúcar, “dieta occidental” no pudieron desarrollar obesidad o resistencia a la insulina (Bäckhed et al., 2007), apoyando así un papel esencial para la MI en el desarrollo de la obesidad inducida por la dieta. Finalmente, Jumpertz et al. reportaron que un aumento del 20% en Firmicutes intestinales y una disminución del 20% en Bacteroidetes se asoció con un aumento de ~ 150 kcal en la obtención de energía por el anfitrión, lo que representa otro aporte al posible impacto de la MI en la obtención de energía del hospedador (Jumpertz et al., 2011).

Otro mecanismo por el que la MI puede modular la ingesta de energía y el metabolismo es la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) a partir de polisacáridos no digeribles, pero si fermentables, de la dieta. AGCC tales como el acetato, butirato y propionato producidos por la función de fermentación bacteriana sirven como sustratos de energía, reguladores de la saciedad y la ingesta de alimentos (Shen et al., 2013). Mediante la activación de los receptores G acoplados a la proteína GPR41 y GPR43 en las células epiteliales intestinales, AGCC estimulan la secreción del péptido YY (PYY) y del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1). A su vez, estas hormonas pueden suprimir la motilidad intestinal y retardar el tránsito intestinal, permitiendo una mayor absorción de

Introducción

32

nutrientes (Wichmann et al., 2013; Erejuwa et al., 2014). Por otro lado, el butirato y el propionato se han reportado por reducir la ingesta de alimentos y proteger contra la obesidad y resistencia a la insulina inducida por la dieta en ratones (Lin et al., 2012), una mayor riqueza de genes bacterianos se ha asociado con una mayor producción de AGCC (Le Chatelier et al., 2013) y bacterias productoras de propionato como Akkermansia muciniphila pueden mejorar el perfil metabólico en ratones (Everard et al., 2013), sin embargo, el papel de AGCC en la regulación del metabolismo del huésped todavía no se ha aclarado por completo.

Everard et al. demostraron que Akkermansia muciniphila, una bacteria degradante de mucina que reside en la capa de mucus y se correlaciona inversamente con el peso corporal en roedores y seres humanos, redujo su abundancia en ratones obesos y diabéticos. También observaron que la alimentación prebiótica (oligofructosa, 0,3 g por día/ratón) normalizó la abundancia de A. muciniphila, lo que se correlaciono con un perfil metabólico mejorado. Además, demostraron que el tratamiento con A. muciniphila invierte los trastornos metabólicos inducidos por la dieta alta en grasa (DAG), incluyendo el aumento de la masa grasa, la endotoxemia metabólica, la inflamación del tejido adiposo, y la resistencia a la insulina. La administración de A. muciniphila aumentó los niveles de endocannabinoides intestinales que controlan la inflamación, la barrera intestinal y la secreción del péptido intestinal GLP-1. Por último, demostraron que todos estos efectos requieren la viabilidad de A. muciniphila, ya que el tratamiento con células muertas por calor no mejoró el perfil metabólico o el espesor de la capa de mucus (Everard et al., 2013).

Uno de los vínculos que conecta la MI con las células del hospedador son los receptores tipo toll (TLRs). Los TLRs son receptores extracelulares de reconocimiento de patrones (PRRs) del sistema inmune innato que reconocen motivos microbianos constantes (patrones moleculares asociados a patógenos o PAMPs) en las bacterias, virus y hongos (Kumar et al., 2011). El reconocimiento de PAMPs por PRRs desencadena rápidamente múltiples respuestas inmunes antimicrobianas a través de la inducción de vías de señalización inflamatorias y la transcripción aguas abajo de citoquinas y otros mediadores inflamatorios. Dada la magnitud de la MI, no es de extrañar que la detección PAMPs por los TLRs en la interface del epitelio luminal es vital para mantener la tolerancia inmune de mucosa y la homeostasis intestinal (Cerf-Bensussan and Gaboriau-Routhiau, 2010). En este sentido, TLR5 detecta específicamente la flagelina bacteriana y es altamente expresado en la mucosa del intestino de ratones (Rhee, 2011). El reconocimiento de flagelina por TLR5 extracelular induce el factor nuclear de transcripción mediado por -κB (NFκB) de los genes de defensa del huésped. Sorprendentemente, ratones deficientes de TLR5 -/- (T5KO) se convierten en hiperfágicos y desarrollan obesidad y patologías relacionados al síndrome metabólico, incluyendo la hiperlipidemia, la hipertensión y la resistencia a la insulina (Vijay-

Introducción

33

Kumar et al., 2010). La restricción de alimentos impidió la obesidad, pero no la resistencia a la insulina en estos ratones, lo que indica que la deficiencia de TLR5 es suficiente para provocar resistencia a la insulina en ausencia de obesidad. Cabe destacar que el fenotipo T5KO de ratones hiperfágicos/obesos se correlaciona con alteraciones en la composición bacteriana del intestino. El análisis UniFrac reveló que la microbiota intestinal de los ratones T5KO y de la misma camada de tipo salvaje fueron significativamente diferentes a nivel de especie, con 116 filotipos bacterianos de diversos Filos enriquecidos o reducidas en los ratones T5KO en relación con los ratones de tipo salvaje. Críticamente, el trasplante de la microbiota intestinal de ratones T5KO hacia ratones LG recapitula la hiperfagia, obesidad y la desregulación metabólica en los receptores, lo que indica que estas alteraciones promueven el fenotipo hiperfágico/obeso y no son más que un epifenómeno. Además, el tratamiento antibiótico normalizo la ingesta de alimentos en ratones T5KO a niveles de tipo salvaje y mejoro el síndrome metabólico significativamente (Vijay-Kumar et al., 2010). Estas observaciones sugieren que la microbiota intestinal regula el comportamiento de ingestión de alimentos del hospedador y el desarrollo de la resistencia a la insulina y que a su vez esta regulación depende de TLR5, quizás a través de su impacto en la composición de la MI.

Por último, otros mecanismos que vinculan la MI y el desarrollo de obesidad incluyen factores como, el aumento del uso de tratamientos con antibióticos, (Thuny et al., 2010), la regulación metabólica por la supresión de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), la regulación de la absorción de ácidos grasos mediante la supresión del factor adiposo inducido por ayuno (FIAF/Angptl4), la regulación transcripcional de la lipogénesis hepática, endotoxemia metabólica, bacteriemia metabólica, receptores para dominios de oligomerización para la unión a nucleótidos (NODs), translocación bacteriana, señalización de Endocannabinoide (BCE), inflamación estéril, entre otros (Shen et al., 2013). Esto refleja la complejidad en la interacción entre la MI y su hospedador.

Aunque estos estudios son alentadores, numerosos trabajos adicionales son necesarios para delinear los mecanismos específicos que contribuyen a este fenotipo. Por ejemplo, ¿cuáles son las bacterias y/o los metabolitos que aumentan el gasto energético? ¿Están los metabolitos del hospedador implicados en este efecto? ¿Cómo los componentes de la dieta afectan la expresión de TLRs, y esto a su vez altera la composición de la microbiota intestinal y el desarrollo de enfermedades inducidas por la dieta?

Introducción

34

Las BL, conocidas por formar parte de alimentos funcionales como el Yogurt, Queso, Manteca, kéfir, etc, son bacterias gran positivas, no formadoras de esporas, catalasa negativas y estrictamente fermentativas de carbohidratos con el ácido láctico como principal producto de fermentación, del cual deriva su nombre. Están relacionadas con hábitats ricos en nutrientes, tales como varios productos alimenticios (leche, carne, bebidas, vegetales, etc.), pero también forman parte de nuestro intestino (MI), boca, y vagina, entre otros, y están asociadas con efectos beneficiosos sobre la salud del hospedador (Salminen and Wright, 2004).

Los probióticos, como se conocen por su definición unánime, son microorganismos vivos que al ser administrados en concentraciones adecuadas confieren algún beneficio sobre la salud del hospedador. Estos han ido evolucionando y en la actualidad son una estrategia nutricional interesante para el tratamiento de enfermedades inmuno-metabólicas asociadas con la malnutrición. Las propiedades de los probióticos van desde un efecto beneficioso general derivado de su consumo, como el mantenimiento de un sistema digestivo y un sistema inmune óptimo, a la utilización de cepas especificas con características fisiológicas o bioquímicas únicas para tratar una problemática en particular. A los múltiples efectos reportados por varios autores sobre el sistema inmune y la permeabilidad de membrana intestinal, hay que sumarle la capacidad de regular el peso corporal y controlar las alteraciones metabólicas inducidas por la dieta. En particular los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium han demostrado mejorar la obesidad, la inflamación y las complicaciones metabólicas asociadas a través de varios mecanismos, incluyendo la inhibición de la adhesión de patógenos a la mucosa intestinal, la "estabilización" de la MI, mejoras en la integridad de la mucosa y la función de barrera comprometidas por enfermedad, lesión o estrés, producción de AGCC, vitaminas, CLA, actividad enzimática, actividad antioxidante, entre otras (Cani et al., 2007b; Ewaschuk et al., 2007; Amar et al., 2011; Lakhan and Kirchgessner, 2011; Abeijón Mukdsi et al., 2012a; Moya-Pérez et al., 2015).

Recientemente, el foco de las investigaciones científicas se ha trasladado de la función primordial de los alimentos como fuente de energía y sustancias formadoras del cuerpo hacia el placer que generan los alimentos al ingerirlos y a la acción más sutil de los componentes de los alimentos biológicamente activos sobre la salud humana (Roberfroid, 2000; Lillford, 2016). Un alimento funcional es un alimento dado con una función adicional, a menudo relacionada con la salud, la promoción o la prevención de enfermedades, mediante la adición de nuevos ingredientes o aumento de los ingredientes existentes. La mayor parte de los estudios de investigación en el campo de los probioticos son utilizadas para la obtención de alimentos funcionales (Minervini and De Angelis, 2016). Ha habido una explosión de interés de los consumidores en el papel activo de los alimentos en el

Bacterias Lácticas (BL), Probióticos y Alimentos funcionales

Introducción

35

bienestar y la prolongación de la vida, así como en la prevención de la iniciación, promoción y desarrollo de las enfermedades crónicas (Roberfroid, 2000). Como resultado, un término funcional fue propuesto para la nueva comida y entre estos alimentos, los probióticos pueden ejercer efectos positivos sobre la composición de la microbiota intestinal y la salud en general, con lo cual el consumidor comenzó a elegir estos productos y el mercado está aumentando su interés ellos (Siegrist et al., 2008). Un aumento de la demanda de productos no lácteos probióticos proviene de vegetarianismo, el contenido de colesterol de la leche, y la intolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el desarrollo de estos productos es una prioridad clave de la investigación para el diseño de alimentos y un desafío para los sectores industrial y científica. En este artículo se presenta una visión general del desarrollo de alimentos funcionales, con énfasis en alimentos no lácteos que contienen cepas de bacterias probióticas. Los factores determinantes clave para la madurez de alimentos funcionales incluyen: Un nivel de apoyo del gobierno y la compatibilidad de la legislación con el crecimiento del mercado, la presencia de un mercado maduro para alimentos procesados, el nivel de demanda de los consumidores para la nutrición suplementaria, la confianza del consumidor en los productos, conciencia de la salud, y las amenazas a los alimentos funcionales (Granato et al., 2010).

Por otro lado, no ha habido un acompañamiento de interés en el diseño de matrices alimentarias para desarrollar alimentos funcionales a base de probióticos/prebióticos en el cual se mejore la biodisponibilidad de los compuestos activos y no se atente contra los efectos beneficiosos reportados. En particular, ha habido un mayor enfoque en la identificación, aislamiento y caracterización de probióticos a partir de diversas fuentes, con lo cual existen numerosos desafíos asociados con la incorporación de muchos de estos probioticos en productos alimenticios comerciales.

El uso de probióticos orientados a prevenir o mejorar cambios específicos en la MI y de esta manera interactuar con el hospedador para mejorar las alteraciones inmuno-metabólicas relacionados con la obesidad son opciones prometedoras para mejorar la gestión de uno de los problemas más importantes de salud pública del siglo XXI.

Introducción

36

Una gran brecha existe actualmente en la comprensión de los profesionales sanitarios de primera línea sobre los probióticos, prebióticos y el microbioma humano, y sin duda sobre cómo interpretar los grandes conjuntos de datos procedentes de estudios ómicos. Los beneficios de los avances en la investigación de probióticos y microbioma solamente se harán realidad cuando las nuevas tecnologías de ómicas se integren en el diagnóstico médico, y cuando los médicos, enfermeros y administradores de la salud, sean educados sobre los beneficios de ahorro de costos potenciales del uso de probióticos. Mensajes claros necesitan ser diseñados y dirigidos a sectores claves de la sociedad, como los consumidores, políticos, médicos, farmacéuticos y otros. Iniciativas donde se evalúen el efecto de los probióticos en casos de malnutrición ayudan a proporcionar una prueba de concepto del potencial de reducción de riesgo de enfermedades en las intervenciones dietéticas con nuevos productos alimenticios e ingredientes que se dirigen al microbioma intestinal, ampliar el conocimiento de la contribución del microbioma al metabolismo de los nutrientes y el balance energético e identificar las características del microbioma que contribuyen o predicen la obesidad y los trastornos asociados. Entender cómo el microbioma intestinal, bajo la influencia de los factores ambientales, desempeña un papel en el cerebro, el metabolismo y el desarrollo del sistema inmune en la vida temprana y como esto repercute sobre la salud a largo plazo (Petschow et al., 2013).

Se espera que investigaciones adicionales aclaren cómo las combinaciones de probióticos específicos pueden modular la función del intestino y las respuestas inflamatorias o retrasar la aparición de diabetes y obesidad. Para tener éxito en el desarrollo de productos probióticos y prebióticos ampliamente distribuidos, el aumento de la investigación científica en la estructura y función del microbioma debe ir acompañado de un esfuerzo enfocado y transparente del sector industrial, las autoridades de salud y el público en general. La extensión de este tipo de productos a las personas necesitadas en las economías emergentes presentará un nuevo conjunto de desafíos. La mayoría de los 7 mil millones de habitantes del mundo pasan por alteraciones significativas en las cargas de morbilidad, los patrones dietéticos y el estilo de vida. Esto ha sido documentado de manera espectacular en países como India y Sudáfrica, donde es común encontrar altos niveles de retraso en el crecimiento inducido por desnutrición y obesidad en la misma población, algo similar a lo que ocurre en nuestro país.

Los productos derivados de los avances en nuestra comprensión del microbioma son parte de un campo totalmente nuevo en la unión de la nutrición y la medicina, y sus aplicaciones son un reto del futuro en los alimentos funcionales y la nutrición. El éxito de la

Futuro de los probióticos

Introducción

37

transferencia en los avances de la investigación del microbioma a productos probióticos requerirá lo siguiente: (1) una comunidad de investigación abierta, comprometida y realista con objetivos claros, incluyendo distribución de los beneficios potenciales a través del compromiso con el acceso mundial; (2) el reconocimiento de que un amplio número de estructuras del microbioma, alimentos e ingredientes, puede afectar a la salud de los consumidores; (3) la regulación basada en marcadores biológicos significativos y resultados definidos; (4) Productos de confianza con un beneficio para la salud clara de los consumidores y (5) Una legislación acorde que permita avanzar en estas cuestiones.

A medida que nos acercamos a la comprensión de los mecanismos potenciales por los cuales determinados organismos probióticos interactúan con la microbiota, será una oportunidad perdida si la calidad de los estudios de investigación de probióticos no mejora para satisfacer las necesidades de la medicina o la nutrición basada en la evidencia. Se necesitan con urgencia estandarización de los métodos de estudio de probióticos y protocolos de clara comprensión de las características, la pureza y la estabilidad de los agentes de ensayo, sumada a una información precisa y equilibrada de los resultados del estudio. Al mismo tiempo, será importante para educar a los profesionales sanitarios, autoridades reguladoras, y al público en general a comprender la utilización apropiada y documentada de la seguridad y los beneficios de los productos probióticos. Las innovaciones de la microbiota/microbioma y la investigación de probióticos pasarán a formar parte de la vida cotidiana cuando la regulación y la obstinación de muchos médicos que se mueven desde una perspectiva de gestión de pacientes de base farmacéutica pasen a una perspectiva más integral que incluya recomendaciones de productos alimenticios. Mientras tanto, las cuestiones reglamentarias en pro y prebióticos siguen siendo un punto de preocupación, se requiere investigación humana de alta calidad realizada en la población en general para convencer a los reguladores de la legitimidad de los beneficios para la salud de los alimentos. Muchos estudios convincentes de probióticos se han realizado sobre las poblaciones que están fuera del alcance de los alimentos o suplementos. Sin embargo, la seguridad y la falta de efectos secundarios de estos productos es una fuerte ventaja. Por lo tanto, es responsabilidad de los que están en el campo ayudar a fortalecer el cuerpo de evidencia y fusionar el conocimiento de una manera que permita a los consumidores y los pacientes obtener los beneficios lo más pronto posible.

Hipótesis y

Objetivos específicos

Hipótesis y objetivos

39


Estrategias dietéticas, en particular el uso de probióticos como agentes terapéuticos que

manipulen la microbiota intestinal y/o modulen la funcionalidad del tejido adiposo, serían

adecuadas para la prevención y/o tratamiento de diferentes condiciones de malnutrición.

La hipótesis de este plan de trabajo es la siguiente:

“La suplementación de la dieta con BL adipomoduladoras, podría inducir cambios en la estructura del tejido adiposo y de la microbiota intestinal (MI), y de esta manera revertir las alteraciones inmuno-metabólicas asociadas a la malnutrición”

El objetivo general de este plan de trabajo es el siguiente:

“Evaluar la influencia de BL sobre la secreción de adipoquinas en modelos experimentales de malnutrición y estudiar su implicancia en la respuesta inmuno-metabólica y la composición de la MI”.


40

Selección de BL con propiedades inmunomoduladoras in vitro.

Selección de BL con propiedades adipomoduladoras in vitro.

Desarrollar modelos animales de malnutrición (restricción calórica leve y obesidad).

Evaluar la influencia de BL adipomoduladoras, seleccionadas in vitro, sobre:

- Los niveles plasmáticos de leptina, parámetros nutricionales e inmuno-

metabólicos.

- La funcionalidad de macrófagos y adipocitos ex vivo.

- La composición de la MI.

Establecer la relación existente entre los cambios de la MI, adipoquinas y la respuesta

inmune en la malnutrición.

Para poder llevar a cabo el objetivo general nos planteamos los siguientes objetivos

Materiales

y

Métodos

Materiales y métodos

42


Microorganismos y condiciones de cultivo

Microorganismos

Las bacterias lácticas (BL) utilizadas en este trabajo de tesis (Tabla 1) fueron

obtenidas de la Colección de Cultivos del Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA),

Tucumán, Argentina. Se seleccionaron 15 cepas de BL con algunas propiedades probióticas

estudiadas por diferentes laboratorios de CERELA. Entre las propiedades que se tuvieron

en cuenta para seleccionar las BL fueron: producción de IgA secretoria, fagocitosis,

producción de ácido linoleico conjugado (CLA) y actividad feruloil esterasa. (Medina et al.,

2011; (Abeijón Mukdsi et al., 2012b); Marranzino et al., 2012; Novotny Núñez et al., 2015).

Condiciones de cultivo

Las BL se cultivaron en Man-Rogosa-Sharpe (MRS) caldo (Man et al., 1960) (MRS; Britania,

Buenos Aires, Argentina) durante 16 horas a 37 ºC (fase exponencial tardía). Las células se

centrifugación (10.000 rpm durante 10 min), se lavaron dos veces en buffer fosfato salino

(PBS) (cloruro de sodio (NaCl) 135 mM, fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 8.1 mM, fosfato

monobásico de potasio (KH2PO4) 1.5 mM y cloruro de potasio (KCl) 3 mM, pH 7,4), y se re-

suspendieron en PBS con 20% de glicerol (v/v). Alícuotas de 1 mL se congelaron y se

almacenaron a -80 °C hasta su uso. El número de bacterias vivas después de la congelación

y descongelación se determinó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en

medio MRS agar después de 48 h de incubación en microaerofilia. Para cada cepa probada,

más del 90% de las células estaban vivas después de la descongelación y no se encontraron

diferencias significativas en el tiempo de almacenamiento (2 meses). Una alícuota fresca se

descongeló para cada nuevo experimento para evitar la variabilidad en la viabilidad de los

cultivos.


43

Tabla 1| Cepas de diferentes especies de BL.

Cepa Origen Propiedades Referencia

Lactobacillus casei CRL431

Heces de infantes Probiótico comercial Protección frente a infecciones Propiedades metabólicas

(Gauffin et al., 2002a; Gauffin Cano and Perdigon, 2003; de

LeBlanc Ade et al., 2010; Villena et al., 2005)

L. casei CRL143 Producto lácteo fermentado

Aumento de LB productores de IgA Aumento de fagocitosis.

Datos cepario CERELA

L. acidophilus CRL1063

Producto lácteo fermentado

Aumento de LB productores de IgA Aumento de fagocitosis. Actividad antifúngica

Datos cepario CERELA (Gerez et al., 2013)

L. casei CRL66 Producto lácteo fermentado

Aumento de LB productores de IgA Aumento de fagocitosis.


L. casei CRL72 Queso regional de

leche de vaca*

Aumento de LB productores de IgA

Aumento de fagocitosis. Datos cepario CERELA

L. casei CRL117 Queso regional de

vaca*

Aumento de LB productores de IgA

Aumento de fagocitosis.

Cepa productora de CLA


(Terán et al., 2015)

L. fermentum CRL1446 Queso regional de leche de cabra*

Incrementa la actividad feruloil esterasa intestinal in vivo. Propiedades antioxidantes

(Abeijón Mukdsi et al., 2012b, 2013a)

Lactococcus lactis CRL1434

Queso regional de leche de oveja*

Cepas productoras de CLA (Terán et al., 2015)

L. plantarum CRL350 Pastura de alta

montaña



montaña



montaña


L. plantarum CRL355 Pasturas de alta montaña

Cepas productoras de CLA y CLNA (Terán et al., 2015)

L. paracasei CRL575 Heces de infantes Cepas productoras de CLA (Terán et al., 2015)

L. casei ssp rhamnosus

CRL576

Heces de infantes Cepas productoras de CLA (Terán et al., 2015)

* Quesos artesanales de la región del noroeste argentino (NOA). CLA: ácido linoleico conjugado; CLNA: ácido linolénico conjugado.


44

Capítulo I: Selección de BL con capacidad adipomoduladora

Estimulación de Macrófagos murinos RAW 264.7

La línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 se utilizó para evaluar la

capacidad inmunomoduladora de diferentes BL. Las células fueron incubadas durante 24

horas en placas de 24 pocillos (Costar® 24 pocillos, estériles # 3524, NY, USA) a una

concentración de 1 x 105 células/pocillo en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

(Gibco, # 41965-039, CA, USA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Gibco,

#10082139, CA, USA) y 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina, SIGMA-ALDRICH, #

P4333-20ML, MO, USA) (DMEM completo) a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad.

Transcurridas las 24 horas se cambió el medio y se realizó la estimulación con las diferentes

bacterias. Para lo cual se añadió 100 µl de cada suspensión bacteriana conteniendo 1 x 107

UFC/mL y se incubó durante 24 h en las condiciones ya mencionadas. Lipopolisacárido

(LPS) purificado a partir de E. coli serotipo O26:B6 (SIGMA-ALDRICH, # L2654, MO, USA)

a una concentración final de 1 µg/mL y células Raw 264.7 no estimuladas se utilizaron como

controles positivos y negativos de la producción de citoquinas, respectivamente. La

viabilidad celular se evaluó con Trypan-blue (SIGMA-ALDRICH, #T6146, MO, USA). A las

24 h se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular, se centrifugaron (10.000 rpm

durante 10 min) y se almacenaron a -80ºC hasta su posterior uso.

Aislamiento de adipocitos murinos

Adipocitos de ratones BALB/c machos de 6 semanas de edad se aislaron por

digestión del tejido adiposo epididimal (TAE) con colagenasa de Clostridium histolyticum

tipo II (SIGMA-ALDRICH, # C6885, MO, USA), como se ha descrito previamente por

Bernstein et al. (Bernstein et al., 1989). El tejido adiposo epididimal de 4 a 6 ratones se agrupó

para el aislamiento de los adipocitos. El tejido fue digerido en agitación durante 45 minutos

a 37 ºC en DMEM, conteniendo 1,5 mg/mL de colagenasa tipo II. La suspensión celular se


45

centrifugó a 400 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. Los adipocitos maduros

flotan en la superficie, y las células de la fracción vascular del estroma (resto de células que

componen el tejido adiposo además de los adipocitos) se depositaron en la base del tubo

(pellet). Las células adiposas de la superficie fueron retiradas por aspiración, y se lavaron

con 10 ml de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Gibco, #10082139,

CA, USA) y 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina, SIGMA-ALDRICH, # P4333-

20ML, MO, USA) (DMEM completo), se centrifugó a 400 g durante 4 min a temperatura

ambiente. La concentración de células adiposas se determinó en un hemocitómetro con

coloración de Trypan-blue (SIGMA-ALDRICH, #T6146, MO, USA).

Estimulación de un cultivo primario de adipocitos murinos con BL

Para estudiar la capacidad de las diferentes BL para inducir secreción de leptina y

citoquinas, los adipocitos se incubaron con 0.5 mL de DMEM completo en placas de 24

pocillos en una concentración de 5 x 105 células/pocillo. Las células se incubaron en una

atmósfera de 5% CO2, 95% de humedad y 37 ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo

se cambió el medio, por medio fresco, antes de la estimulación de los adipocitos, los cuales

se incubaron en presencia de 100 µl de las distintas suspensiones bacterianas (1 x 107

UFC/mL) durante 24 h. LPS purificado a partir de E. coli serotipo O26:B6 se utilizó como

control positivo en una concentración de 1 µg/mL. Adipocitos no estimulados se utilizaron

como controles basales de producción de leptina y citoquinas. La viabilidad celular se

evaluó con Trypan-blue (SIGMA-ALDRICH, #T6146, MO, USA).

Estimulación de un Co-cultivo de macrófagos y adipocitos con BL

Células adiposas (cultivo primario) y macrófagos (RAW 264,7) en co-cultivos se

utilizaron para evaluar el efecto de las diferentes bacterias en estudio (producción de leptina

y citoquinas). Adipocitos y macrófagos se sembraron cada uno a una concentración de 5 x

104 células/pocillo en placas de 24 pocillos como se describió anteriormente (5% de CO2,

95% de humedad y 37 ºC, durante 24 horas), para llegar a una concentración total de 1 x 105

células/pocillo. Los medios se cambiaron antes de la estimulación y, a continuación, las


46

células se incubaron en presencia de 100 µl de cada suspensión bacteriana (1x107 UFC/mL)

durante 24h en las mismas condiciones. LPS purificado a partir de E. coli serotipo O26: B6

(1 µg/mL) se utilizó como control positivo. Células en co-cultivo no estimuladas también se

utilizaron como controles basales de leptina y citoquinas. Los sobrenadantes de co-cultivo

se recolectaron y se almacenaron a -80ºC hasta su uso.

Detección de citoquinas y adipoquinas

IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-17A e IL-10 se cuantificaron en los sobrenadantes

celulares utilizando el kit de BD™ (CBA Ratón Th1 / Th2 / Th17, BD Bioscience, #560485,

CA, USA). El límite de detección para este kit fue de 0.1 pg/mL (IL-2), 0.03 pg/mL (IL-4), 1.4

pg/mL (IL-6), 0.5 pg/mL (IFN-γ), 0.9 pg/mL (TNF-α), 0.8 pg/mL (IL-17A) e 16.8 pg/mL (IL-

10). La concentración de MCP-1 (eBioscience, Inc, Mouse CCL2 (MCP-1) Ready-SET-Go!®,

CA, USA) y leptina (DuoSet, R & D Systems, MN, USA) se determinaron por ensayos de

inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) en los sobrenadantes de células estimuladas.

Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada parámetro se

determinó por triplicado en dos experimentos independientes.

Cuantificación de la expresión del receptor de leptina (Ob-R) en RAW264.7

Posterior a la estimulación de macrófagos descripta anteriormente, con las diferentes

BL, los macrófagos se recolectaron por medio de un pipeteo vigoroso, se lavaron dos veces

con PBS y se incubaron (106 células) con el anticuerpo primario anti-receptor de leptina (Ob-

R) de conejo contra ratón (Ob-R H300: sc 8325, Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA, USA), en

una dilución 1/250 (v/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavó dos veces

con PBS-BSA (5%, w/v) y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-IgG, conjugado

con FITC, de cabra contra conejo (IgG-FITC: sc-2012 Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA,

USA) durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. Las células se lavaron dos veces

y se resuspendieron en 500 µl del buffer PBS-BSA (1%, w/v). Células con y sin estímulo con

LPS se utilizaron como controles positivos y control basales de la expresión de Ob-R.

Macrófagos Ob-R (+) se cuantificaron utilizando citometría de flujo (BD/FACSCalibur). Los


47

gates se fijaron para excluir los desechos celulares y las uniones no específicas de

anticuerpos, los resultados fueron analizados utilizando el software de análisis de FACS

(CellQuest; BD Biosciences). Células controles no teñidas fueron utilizadas para establecer

el blanco y configurar los ejes de los gates. Los resultados se expresaron como porcentaje de

células Ob-R (+), con respecto al número total de células analizadas en cada muestra.

Detección cualitativa de la expresión del receptor de leptina (Ob-R)

Para una detección cualitativa del receptor Ob-R se utilizó la técnica de

inmunofluorescencia indirecta (anticuerpos primarios y secundarios) en macrófagos (RAW

264.7). Las células se cultivaron del mismo modo que el caso anterior durante 24 h en placas

de 24 pocillos, sólo que en este caso se colocó en la base de cada pocillo un cubreobjetos

estéril de vidrio de 12 mm de diámetro, sobre el cual se sembró los macrófagos como se

detalló anteriormente. A continuación, los cubreobjetos, conteniendo las células adheridas,

se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios

como se describió anteriormente. Luego las celulas fueron fijadas con paraformaldehído al

1% (SIGMA-ALDRICH, P6148-500G, CA, USA) en PBS durante 30 minutos, finalmente se

extrajo los cubreobjetos con los macrófagos adheridos y se colocaron sobre un portaobjetos

dejando una gota de líquido de montaje (SIGMA F4680, CA, USA) entre ambos vidrios.

Luego observamos en un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss - Axio Scope.A1) con

objetivo de 100X utilizando aceite de inmersión.


48

Capitulo II: Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de obesidad inducida por la dieta

Modelo experimental de dieta alta en grasa (DAG)

Ratones machos Balb/c de 21 días de edad (n = 80) se obtuvieron del bioterio de

CERELA. En el período de adaptación fueron alojados en jaulas individuales y aclimatados

a 22 ± 2 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales se separaron en los siguientes

grupos (n=16): DE: dieta estándar; DAG: dieta alta en grasas; DAG-CRL1446: dieta alta en

grasas suplementada con L. fermentum CRL1446; DAG-CRL1434: dieta alta en grasas

suplementada con L. lactis CRL1434 y DAG-CRL431: dieta alta en grasas suplementada con

L. casei CRL431. En el grupo DE se les administro una dieta estándar (61% de carbohidratos,

proteínas 23%, grasas 7,5%, 4% de fibra cruda, 3,5%, minerales totales, Asociación de

Cooperativas Argentinas, Buenos Aires, Argentina) y agua de bebida de forma ad libitum

durante 45 días. Esta dieta aporta 3,10 Kcal/g de dieta. En el grupo DAG se les administró

una dieta donde el 60% de las calorías es aportado por las grasas (dieta alta en grasas) (34%

de carbohidratos, proteínas 23%, grasas 35%, 4% de fibra cruda, 3,5%, minerales totales)

(Diets, inc., DYET# 103651, PA, USA) y agua de bebida de forma ad libitum durante 45 días.

Esta dieta aporta 5,10 Kcal/g de dieta.

Los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las

recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del bioterio

de CERELA y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético, numero de

aprobación CRL-BIOT- EF-2012/2A.


49

Capítulo III: Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de restricción calórica

Modelo experimental de restricción calórica

Ratones machos Balb/c de 21 días de edad (n = 80) se obtuvieron del bioterio de

CERELA. Ellos fueron alojados en jaulas individuales y aclimatados a 22 ± 2 °C, con un ciclo

de luz/oscuridad de 12 h. Los animales se separaron en los siguientes grupos (n=16): DE:

dieta estándar; RC: restricción calórica; RC-CRL1446: restricción calórica suplementada con

L. fermentum CRL1446; RC-CRL1434: restricción calórica suplementada con Lac. lactis

CRL1434 y RC-CRL431: restricción calórica suplementada con L. casei CRL431. En el grupo

DE se les administró una dieta estándar (61% de carbohidratos, proteínas 23%, grasas 7,5%,

4% de fibra cruda, 3,5%, minerales totales, Asociación de Cooperativas Argentinas, Buenos

Aires, Argentina) y agua de bebida de forma ad libitum durante 45 días. Esta dieta aporta

3,10 Kcal/g de dieta.

Los animales pertenecientes a los grupos RC con y sin la administración de BL se

aclimataron durante 5 días a la dieta estándar y después fueron sometidos diariamente a

una restricción calórica del 25% (25% menos que la ración diaria consumida por el grupo

DE) durante 45 días con el fin de alcanzar un 10-25% de pérdida de peso corporal en

comparación con los ratones DE. Los grupos RC-CRL recibieron las cepas CRL1446,

CRL1434 y CRL431 suspendidas en el agua de bebida en una concentración de 10⁸ UFC/mL.

En todos los grupos, se midió semanalmente el peso corporal y la ingesta de alimento. Ocho

animales de cada grupo fueron sacrificados a los 20 y 45 días, para evaluar diferentes

parámetros metabólicos e inmunológicos además de la composición de la microbiota

intestinal. Los animales se mantuvieron en ayunas (12 horas) antes del sacrificio. El

protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Protección Animal de CERELA

(CRL-BIOT-EF-2012 / 2A) y cumplió con las leyes argentinas vigentes.


50

La administración de las cepas y la determinación de las muestras se realizó de

la misma manera para ambos modelos experimentales, RC y DAG, y se describen a

continuación.

Stock y administración de Bacterias lácticas adipomoduladoras

Las tres cepas de BL seleccionadas en el primer capítulo de esta tesis, Lactobacillus

fermentum CRL1446, Lactobacillus casei CRL431 y Lactococcus lactis CRL1434 se conservaron

en MRS caldo con 20% (v/v) de glicerol a -80°C, luego fueron descongeladas y propagadas

en caldo MRS.

Se preparó un stock de BL; para lo cual las suspensiones bacterianas cultivadas en

caldo MRS durante 16 horas a 37 ºC, se recogieron por centrifugación (10.000 rpm, 10 min)

y se lavaron dos veces con PBS (pH 7,0). Finalmente, se re-suspendieron en PBS glicerol

(20%) y se congelaron a -80ºC hasta su utilización.

Para la administración de BL a los animales, las cepas fueron descongeladas,

centrifugadas y re-suspendidas en el agua de bebida estéril a una concentración de 1x108

UFC/mL. El agua de bebida se cambió cada 12 horas, utilizando siempre un nuevo stock

congelado para evitar la variabilidad en las UFC/mL. Para verificar la viabilidad de las cepas

se realizó el recuento tanto de la solución stock como del agua de bebida y se constató que

la viabilidad era superior al 90% durante el tiempo que duro el ensayo.

Recolección de muestras biológicas

A los animales luego de ser anestesiados con una mezcla de xilasina-ketamina,

(KETAMINA 100 (100 mg/mL), Richmond División Veterinaria S.A, Bs. As., Argentina)

(Xilacina 100 (100 mg/mL) Richmond División Veterinaria S.A, Bs. As., Argentina) se les

realizó una punción cardíaca para extraer sangre, la cual fue recibida en tubos de 2 mL con

ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Wiener Lab, Rosario, Argentina) como


51

anticoagulante. La sangre se mantuvo a temperatura ambiente hasta su centrifugación.

Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 2000 rpm 10 minutos para separar el

plasma, el cual fue fraccionado y congelado a -20ºC hasta su uso.

Ensayos bioquímicos

El plasma se utilizó para determinar los siguientes metabolitos: Triglicéridos,

Colesterol total y Glucosa. Se midieron por métodos enzimáticos utilizando kits comerciales

(Wiener Lab, Rosario, Argentina). Además se determinó los niveles de leptina mediante

ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (Mouse/Rat Leptin Quantikine ELISA Kit,

MN, USA), y citoquinas (IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ,TNF, IL-17A e IL-10) por citometría de flujo,

mediante el kit CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit, (BD CA, USA).

Extracción de órganos

Luego de realizar la punción cardíaca, se procedió a la extracción de diferentes

órganos incluyendo: bazo, intestino, hígado, tejido adiposo (mesentérico y epididimal,

tejido adiposo mesentérico y estómago. Los diferentes órganos fueron colocados en tubos

eppendorfs de 2 mL y almacenados a – 80ºC hasta su uso. Además, se recolectaron muestras

de heces para el análisis de la microbiota intestinal.

Determinación del área y número de adipocitos

El tejido adiposo epididimal fue extraído y colocado en paraformaldehido al 4% en

PBS para realizar la fijación del mismo, luego se realizó la inclusión en parafina y finalmente

el corte en láminas de 3-4 µm utilizando un micrótomo. Los cortes histológicos fueron

teñidos con una mezcla de hematoxilina-eosina y luego observados al microscopio (Carl

Zeiss - Axio Scope.A1) donde se determinó el número y el tamaño de los adipocitos de cada

grupo de acuerdo a la metodología descripta por (Gauffin Cano et al., 2013) utilizando el

shoftware Carl Zeiss – Axio Vision reléase 4.8. Se tomaron cuarenta fotografías de cada

grupo (5 de cada animal) con un objetivo de 40x y en cada fotografía se determinó el área

(µm2) de entre 20 y 50 adipocitos, (dependiendo de su tamaño). A continuación, los


52

adipocitos fueron agrupados por rangos de tamaño como sigue: áreas < 500; 500-1000; 1.000-

2.000; 2.000-4.000 y >4000 µm2) para poder comparar entre los diferentes grupos

Extracción de macrófagos y adipocitos para evaluar su funcionalidad ex vivo

Después de realizar la punción cardiaca y la dislocación cervical de los animales,

estos fueron inyectados intraperitonealmente con 5 ml de DMEM completo frio,

posteriormente mediante un pequeño corte se recogió el líquido con pipeta Pasteur estéril.

El DMEM conteniendo los macrófagos peritoneales se colocó en tubos falcon de 15 Ml en

frio. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y se realizó el recuento en cámara de

neubauer mediante tinción con Trypan-blue (SIGMA-ALDRICH, #T6146, MO, USA).

Finalmente, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos en las mismas condiciones

que se describió para Raw 264.7, en el capítulo I. Lipopolisacarido (LPS) purificado a partir

de E. coli serotipo O26:B6 (SIGMA-ALDRICH, # L2654, MO, USA) a una concentración final

de 1 µg/mL y macrófagos no estimulados se utilizaron como controles positivos y negativos

de la producción de citoquinas, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó con

Trypan-blue (SIGMA-ALDRICH, #T6146, MO, USA). A las 24 h se recolectaron los

sobrenadantes de cultivo celular, se centrifugaron (10.000 rpm durante 10 min) y se

almacenaron a -80ºC hasta su posterior uso.

Los adipocitos fueron obtenidos a partir del tejido adiposo epididimal de los

animales como se describió en el capítulo I, y sembrados en las mismas condiciones. LPS

purificado a partir de E. coli serotipo O26:B6 se utilizó como estímulo positivo en una

concentración de 1 µg/mL. Adipocitos no estimulados se utilizaron como controles basales

de producción de leptina. La viabilidad celular se evaluó con Trypan-blue (SIGMA-

ALDRICH, #T6146, MO, USA). A las 24 h se recolectaron los sobrenadantes de cultivo

celular, se centrifugaron (10.000 rpm durante 10 min) y se almacenaron a -80ºC hasta su

posterior uso.

La determinación de leptina en adipocitos y citoquinas en macrófagos (TNF-α, IL-6

e IL-10 se cuantificaron en los sobrenadantes celulares utilizando el kit de BD™ (CBA Ratón


53

Th1 / Th2 / Th17, BD Bioscience, #560485, CA, USA). El límite de detección para este kit fue

de 0.1 pg/mL (IL-2), 0.03 pg/mL (IL-4), 1.4 pg/mL (IL-6), 0.5 pg/mL (IFN-γ), 0.9 pg/mL (TNF-

α), 0.8 pg/mL (IL-17A) e 16.8 pg/mL (IL-10). La concentración de MCP-1 (eBioscience, Inc,

Mouse CCL2 (MCP-1) Ready-SET-Go!®, CA, USA) y leptina (DuoSet, R & D Systems, MN,

USA) se determinaron por ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) en los

sobrenadantes de células estimuladas. Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones

del fabricante. Cada parámetro se determinó por triplicado en dos experimentos

independientes.

Extracción de ADN de muestras fecales

Las muestras de heces de cada grupo experimental fueron sometidas a un

tratamiento con lisozima previo a la extracción de ADN total, para ello 50mg de heces fueron

re-suspendidas en 500 µL de buffer de lisis (lisozima 10 mg/mL, TRIS-Cl Ph 8 100 mM y

EDTA ph8 10 mM) y colocadas a 37ºC durante 2 horas, luego los 500 µL se cargaron en los

primeros pocillos del cartucho del kit (Maxwell® 16 DNA Purification Kits) y se realizó la

extracción utilizando el equipo Maxwell® 16 Instrument (Promega, Madison, WI, USA)

siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, las muestras de ADN se

centrifugaron a temperatura ambiente (10.000 rpm, 5 min) y se congelaron a -20ºC hasta su

uso.

Secuenciación masiva de alto rendimiento de amplicones del gen 16S rRNA

Las regiones bacterianas V3-V4 del rRNA 16S fueron amplificadas por PCR

utilizando pares de cebadores, 343F (5'-TACGGRAGGCAGCAG-3 ') y 802R (5'-

TACNVGGGTWTCTAATCC-3'), de acuerdo con Polka et al. (Połka et al., 2015). El conjunto

de productos de PCR fue enviado a Fasteris SA (Ginebra, Suiza) para ser secuenciados,

utilizando el kit de preparación de muestras de ADN TruSeq ™ (Illumina Inc., San Diego,

CA, EE.UU.). La secuenciación de alto rendimiento se llevó a cabo en un instrumento MiSeq

Illumina (Illumina Inc.) usando la química V2 en una configuración de 2 x 250 suficiente


54

para cubrir toda la longitud del amplicón, estimado en ~ 450 pb. El montaje de extremo

emparejado y filtrado de calidad se realizó mediante el uso de software Flash (Magoč and

Salzberg, 2011). La multiplexacion de la muestra se llevó a cabo utilizando la información

de los barcoding de ADN por muestra y la plataforma Mothur. La eliminación de quimeras

se realizó utilizando el algoritmo UCHIME (Edgar et al., 2011), a continuación las secuencias

obtenidas fueron agrupadas de acuerdo a su similitud en diferentes unidades taxonómicas

operacionales (operational taxonomic units, OTUs) y anotadas a niveles taxonómicos

comparándolas con la base de datos pública de referencia SILVA (Quast et al., 2013).

Índices de diversidad fueron calculados con la plataforma Mothur usando

parámetros por defecto y el método de la media en el paso de agrupamiento (Schloss et al.,

2009). Diferentes parámetros de alfa diversidad que miden riqueza, como Sobs o chao, así

como diversidad en términos de homogeneidad, como Shannon y Simpson, fueron

calculados a partir de unidades taxonómicas operacionales (OTUs) agrupados en 97%, y

utilizando un subconjunto normalizado de 23.000 secuencias seleccionadas al azar, después

de múltiples mezclas (10.000X) de la base de datos original. La asignación taxonómica, a

nivel de phylum y género, del subconjunto de lecturas de alta calidad se realizó con el

clasificador Bayesian RDP (Lozupone et al., 2011), utilizando un punto de corte asignación

de confianza de 0,8.

Análisis estadístico

Los resultados son medias de tres experimentos independientes ± error estándar

(ES). Los datos se analizaron con un modelo lineal con el programa SPSS versión 17.0 (SPSS

Inc., Chicago, IL, EE.UU.), se utilizó la prueba de Tukey para identificar diferencias

estadísticamente significativas (p <0,05). La relación entre las cepas, citoquinas, leptina,

receptor Ob-R fueron determinada por un análisis de componentes principales (ACP), y

correlación de Pearson usando el software XLSTAT (18.06).

Resultados

56

Capítulo I

Bacterias Lácticas Adipomoduladoras

Selección de bacterias lácticas con capacidad para modular la secreción de Adipoquinas

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Introducción

57

Introducción

Una de las principales hipótesis vinculadas al desarrollo fisiológico de la

obesidad es la desregulación del sistema inmune, con alteraciones en el perfil de

adipoquinas que conlleva a un estado de inflamación crónico, característico de esta

enfermedad. Esta meta-inflamación inducida por la dieta (inflamación de órganos

metabólicos) (Shapiro et al., 2011) se ha reportado en diferentes órganos vitales como el

cerebro, el hígado, el tejido adiposo y el intestino. Muchos autores se han referido a este

fenómeno como una causalidad más que una consecuencia del desarrollo de obesidad

(Harley and Karp, 2012), y a pesar de los avances y descubrimientos en el área no existe

todavía ningún tratamiento eficaz, además de la cirugía bariátrica, que ayude a combatir

esta enfermedad (Ng et al., 2014b). Se tornan, entonces, relevantes las estrategias que

buscan contrarrestar las alteraciones inmuno-metabólicas vinculadas con la obesidad

(Sanz et al., 2010).

La secreción alterada de adipoquinas, que está presente tanto en la obesidad

como en la desnutrición, compromete la salud del hospedador (Blüher, 2012; Sahin-Efe

et al., 2012; Fasshauer and Blüher, 2015; Blüher and Mantzoros, 2015). En este contexto,

la leptina tiene un especial interés debido a sus efectos pleiotrópicos ampliamente

descriptos y su potencial terapéutico en el tratamiento de la obesidad y sus

comorbilidades (Houde et al., 2015). La leptina plasmática se correlaciona positivamente

con el índice de masa corporal y el porcentaje de grasa total en humanos y animales

(Faggioni et al., 2001; Ayina et al., 2016). No se conoce exactamente el mecanismo por el

cual componentes de la dieta o de la MI pueden regular su producción, sin embargo

existe evidencia científica en animales y humanos que detalla una estrecha relación entre

la composición de la MI, las alteraciones inmunometabolicas y el perfil de adipoquinas

desregulado en la obesidad inducida por la dieta (Brown et al., 2012; Cox and Blaser,

2013; Cavalcante-Silva et al., 2015; Caesar et al., 2015; Ojeda et al., 2015; Rooks and

Garrett, 2016).

En consecuencia, es de creciente interés el diseño de estrategias dietéticas con

prebióticos y/o probióticos para la prevención de enfermedades metabólicas mediante

la regulación de los perfiles de adipoquinas asociados a cambios en la estructura de la

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Introducción

58

microbiota intestinal (Cani and Delzenne, 2009; Chang et al., 2011; Sanz et al., 2013;

Petschow et al., 2013). Muchos autores han demostrado tanto in vitro como in vivo la

influencia de lactobacilos y bifidobacterias sobre los niveles de adipoquinas (Bleau et al.,

2005; Sato et al., 2008; Cano et al., 2013), y como cambios en la composición de la

microbiota podrían afectarlos (Sahin-Efe et al., 2012). En este contexto, nuestro grupo ha

confirmado que la administración de una bacteria probiótica a ratones con obesidad

inducida por la dieta, aminora los niveles de leptina y citoquinas pro-inflamatorias, e

induce la restauración parcial de la disbiosis asociada a la obesidad (Cano et al., 2013).

Asociando el rol pleiotrópico de la leptina y el efecto de diferentes cepas de BL

sobre los niveles de adipoquinas, consideramos a la leptina como un eje central del

proceso de selección de cepas potencialmente probióticas para la prevención o el

tratamiento de individuos con diferentes estados nutricionales incluyendo la obesidad

inducida por la dieta (OID) así como la restricción calórica (RC).

El tejido adiposo está constituido por células endocrinas activas que secretan un

gran número de adipoquinas, principalmente: leptina, adiponectina y citoquinas

inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleuquina (IL) - 6, IL-

1, IL-10 y la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1). Estos factores juegan un

papel fundamental en la regulación de diversos procesos fisiológicos y patológicos en

los que el tejido adiposo está involucrado (Desruisseaux et al., 2007; Tsai et al., 2014).

Para este propósito, evaluamos la capacidad de BL para inducir cambios en la secreción

de adipoquinas, citoquinas y quimoquinas involucradas en la inflamación metabólica

(IL-6, IL-10, TNF-α, MCP-1 y leptina), en macrófagos y adipocitos, principales células

que componen el TA (Ferrante, 2013; Mraz and Haluzik, 2014). Además, con el fin de

adquirir un mayor conocimiento de la inmunobiología del TA y de estudiar la influencia

de BL en la producción de adipoquinas, analizamos comparativamente la secreción de

leptina y citoquinas en un co-cultivo de ambas células y la expresión del receptor de

leptina (Ob-R) en macrófagos, ya que el mismo se encuentra expresado

constitutivamente en estas células (Papathanassoglou et al., 2006).

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Objetivo

59

“Evaluar la capacidad inmunomoduladora y

adipomoduladora de diferentes cepas de BL, como una

posible estrategia de selección de cepas probióticas

para prevenir o mejorar las alteraciones inmuno-

metabólicas asociadas a la malnutrición”

Objetivo Selección de BL moduladoras de adipoquinas Capítulo I

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Resultados

60

Resultados

Perfil de citoquinas inducido por BL en macrófagos (RAW 264.7)

La Figura 4 muestra la capacidad de BL para inducir la producción de TNF-α, IL-

6, IL-10 y MCP-1 en la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7. Nuestros

resultados indican que existen diferencias en el perfil inmunomodulador entre las cepas

estudiadas, lo cual sugiere que la propiedad inmunomoduladora es específica de cada

cepa. La estimulación de los macrófagos con las diferentes bacterias en ningún caso

indujo mayores niveles de producción de citoquinas y de MCP-1 que el estímulo con

LPS o control (+) (Figura 4A, B, C y D).

Observamos que los valores de producción de TNF-α (citoquina pro-

inflamatoria), fue similar al control (-) para 8 de las 14 cepas en estudio (CRL66, CRL72,

CRL355, CRL350, CRL576, CRL353, CRL575 y CRL143). Por otro lado, 5 cepas indujeron

niveles significativamente mayores al control (-) (CRL1446, CRL117, CRL431, CRL1434

y CRL352), pero menores al control (+) (LPS). Finalmente, sólo la cepa CRL1063 mostró

valores similares a los inducidos por LPS (Figura 4A).

Cuando analizamos la producción de IL-6 (citoquina que puede actuar como

anti- o pro-inflamatoria) observamos que aumentó significativamente cuando se

estimularon los macrófagos con todas las cepas evaluadas en comparación con el control

(-). Las cepas CRL66, CRL431, CRL1063, CRL576, CRL575 y CRL352 mostraron niveles

significativamente más altos que el control (-), destacándose la cepa CRL1434 a pesar de

que todas estuvieron por debajo de los niveles inducidos por el LPS (Figura 4B).

La secreción de MCP-1 (pro-inflamatoria), encargada de reclutar monocitos, fue

favorecida significativamente con las cepas CRL431, CRL1063, CRL1434, CRL352 y

CRL143 de las cuales CRL1063 indujo los niveles más elevados (Figura 4C).

En relación a los niveles de IL-10 (citoquina anti-inflamatoria), las cepas CRL1434

y CRL575 fueron las que indujeron los mayores valores comparados con el control (-)

seguidos de CRL1063, CRL72, CRL350 y CRL143 (Figura 4D).


61

Figura 4| Niveles de producción de (A) TNF-α, (B) IL6, (C) MCP1 y (D) IL-10, por macrófagos (RAW 264.7) estimulados con las siguientes BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarumCRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576), en una concentración de 1 x 106 UFC/pocillo. Control (-): macrófagos sin estimular (DEMEN), Control (+): macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS). Los valores se expresan como la media ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinado en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05).

A B

C D


62

Expresión del receptor de leptina (Ob-R) en macrófagos murinos (RAW 264.7) estimulados con BL

Teniendo en cuenta que la leptina ejerce sus efectos inmunomoduladores a través

de su receptor (Ob-R) (Hoffmann et al., 2014), en este trabajo evaluamos la influencia de

BL sobre la expresión de dicho receptor en la línea de macrófagos murinos RAW 264.7.

Se pretende estudiar si la expresión de este receptor puede ser regulada positivamente

en respuesta a la activación de macrófagos por BL. Este estudio se realizó

cualitativamente, por microscopía de fluorescencia (Figura 5), y cuantitativamente por

citometría de flujo (Figura 6 y 7).

Figura 5| Microfotografía de la expresión del receptor de leptina Ob-R en macrófagos (RAW 264.7) (A) control (-), macrófagos no estimulados, y (B) control (+), macrófagos estimulados con LPS.

A B


63

La expresión basal del receptor Ob-R en macrófagos (sin estimulo) fue del 15%,

mientras que en presencia de los diferentes estímulos (BL o LPS) se observaron cambios

significativos en su expresión. Los niveles de Ob-R aumentaron hasta un valor máximo

de aproximadamente 45% después de la estimulación con LPS. L. lactis CRL1434, es la

bacteria con mayor efecto modulador sobre este receptor seguida de CRL66, CRL431,

CRL1063 y en menor medida CRL1446, CRL576 y CRL352. Para las otras cepas

estudiadas no hubo cambios significativos en la expresión de Ob-R en comparación con

la producción basal (control (-)) (Figura 6).

Figura 6| Niveles de expresión (%) del receptor de leptina Ob-R en la línea celular de macrófagos murinos (RAW 264.7), determinado por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti Ob-R conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Control (-): macrófagos sin estimular, Control (+): macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS), y diferentes BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilusCRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576). Los resultados se expresan como medias ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinados en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05).


64

Control (-) Control (-)

LPS LPS

CRL66 CRL66

CRL1446 CRL1446

CRL431 CRL431

CRL1063 CRL1063

CRL117 CRL117 CRL72 CRL72





Figura 7| Histogramas y dot plots de la expresión del receptor de leptina Ob-R en macrófagos murinos (RAW 264.7) obtenidos por citometría de flujo. Control (-): macrófagos sin estimular, Control (+): macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS), y diferentes BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilusCRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576).


65

Asociación de BL en función del perfil de citoquinas y la expresión del receptor de leptina en macrófagos (RAW264.7)

El Análisis de Componentes Principales (ACP) es una técnica de análisis

multivariante de reducción de datos, es decir, un método que permite reducir la

dimensión del número de variables que inicialmente se han considerado.

El ACP (Figura 8) mostró una asociación entre las cepas estudiadas

determinando 4 grupos de acuerdo a los mediadores inflamatorios inducidos. El grupo

I incluye las cepas CRL66, CRL575, CRL576, CRL353, CRL355, CRL117, CRL350 y

CRL143 que mostraron un perfil inmunomodulador bajo ya que las mismas se

encuentran ubicadas próximas al control (-) que posee los datos basales de producción

de estos mediadores. El grupo II, incluye las cepas CRL1446, CRL72, CRL431 y CRL352

las cuales mostraron un perfil inmunomodulador intermedio. La cepa CRL1063 se

encuentra en el grupo III y la cepa CRL1434 en el grupo IV, ambas con un perfil

inmunomodulador más próximo al control (+) que el resto de cepas.

Figura 8| Biplot del ACP obtenido de los niveles de TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 y la expresión de Ob-R producidos por la estimulación de macrófagos con BL. Los puntos están codificados para cada cepa y controles (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575, L. casei ssp rhamnosus CRL576, control (+) (LPS) y control (-) DEMEN). La posición de algunos puntos fue ligeramente modificada para evitar superposición.

Control (+)

Control (-)

CRL1446

CRL117CRL66

CRL431

CRL1063

CRL72 CRL1434

CRL350

CRL576CRL353CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

TNF-a

IL-6MCP-1

IL-10

OB-Rb

-2

-1

0

1

2

3

4

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

F2 (1

6,98

%)

F1 (69,42 %)

Biplot (ejes F1 y F2: 86,40 %)


66

De acuerdo a los resultados de la matriz de correlaciones (Pearson) obtenidas en

el ACP (Tabla 2) podemos decir que la producción de citoquinas se correlaciono

positivamente con la expresión del receptor de leptina (Ob-R), mostrando que las BL no

solo pueden activar estas células para la producción de citoquinas de forma cepa

dependiente, sino también pueden regular la respuesta a otras moléculas como leptina

mediante cambios en la expresión de su receptor. Por otro lado, todas las variables

analizadas (citoquinas, MCP-1 y Ob-R) se correlacionaron positivamente, salvo la

correlación entre TNF- α e IL-10 que no fue significativa, demostrando quizás el efecto

contra regulador entre estas dos citoquinas.

Tabla 2| Matriz de correlaciones (Pearson)

Correlación entre TNF-α, IL-6, IL-10 y MCP-1 producidos por macrófagos (RAW264.7) al ser estimulados por diferentes BL, los valores en negrita indican correlación positiva con un nivel de significación alfa <0,05.

Variables TNF-α IL-6 MCP-1 IL-10 OB-Rb TNF-a 1 0,519 0,588 0,226 0,619

IL-6 0,519 1 0,806 0,788 0,783 MCP-1 0,588 0,806 1 0,744 0,515 IL-10 0,226 0,788 0,744 1 0,504

OB-Rb 0,619 0,783 0,515 0,504 1


67

Perfil de adipoquinas inducido por BL en adipocitos murinos

Para evaluar la influencia de BL sobre la secreción de adipoquinas (leptina,

citoquinas y quimoquinas) adipocitos aislados de ratones Balb/C (cultivo primario), se

estimularon con las diferentes BL en estudio (Figura 9 y 10).

Los resultados obtenidos muestran un efecto adipomodulador cepa dependiente

sobre la producción de adipoquinas (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 y leptina) por parte de

las BL estudiadas. El efecto sobre la producción de TNF-α fue diferente al observado en

macrófagos (RAW 264.7) (Figura 4A). Las cepas CRL1446, CRL1434, CRL350, CRL353 y

CRL352 indujeron los valores más altos, sin embargo, sólo CRL1434 mostró

concentraciones significativamente superiores al estímulo con LPS (Figura 9A).

En relación a los resultados para IL-6 podemos decir que los niveles de esta

citoquina son superiores a los obtenidos cuando estimulamos un cultivo de macrófagos

(RAW 264.7), teniendo en cuenta el mismo número de células (Figura 4B). Observamos

que las cepas CRL1434, CRL350 y CRL355 indujeron los mayores valores,

significativamente superiores a los del control (-) pero sin alcanzar los inducidos por

LPS. El resto de estímulos indujeron valores ligeramente superiores al control (-) (Figura

9B).

Los valores para MCP-1 inducidos por adipocitos son menores que los secretados

por macrófagos (RAW 264.7) (mismo número de células) (Figura 4C). CRL 1434 indujo

nuevamente los valores más altos de esta quimoquina (Figura 9C).

Con respecto a la producción de IL-10 podemos observar que su producción es

significativamente inducida por las cepas CRL1446, CRL1063, CRL72, CRL1434,

CRL353, CRL355 y CRL143. Únicamente las cepas CRL1434 y CRL355 alcanzaron los

valores inducidos por LPS (Figura 6D).


68

Figura 9| Niveles de producción de TNF-α (A), IL-6 (B), MCP-1 (C) e IL-10 (D), por adipocitos (cultivo primario) estimulados con BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosusCRL576). Control (-): adipocitos sin estimular (DEMEN), Control (+): adipocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS). Los valores se expresan como la media ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinado en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05).

Control (+

)Contro

l (-)

CRL1446

CRL117

CRL66CRL43

1CRL10

63CRL72

CRL1434

CRL350

CRL576

CRL353

CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

A B

C D


69

Perfil de leptina inducido por BL en adipocitos murinos

La producción de leptina fue modulada por las bacterias de forma cepa-

dependiente (Figura 10). El estímulo con LPS fue capaz de inducir una producción de

leptina significativamente elevada en comparación con los niveles basales (control (-)).

La producción de leptina fue significativamente reducida por las cepas CRL431, CRL72,

CRL355 y CRL352. Mientras que las siguientes BL indujeron aumento de los niveles de

leptina sin alcanzar a los inducidos por el LPS: CRL1446, CRL117, CRL350, CRL576 y

CRL353. Los valores similares o superiores al inducido por LPS corresponden al

estímulo con las siguientes cepas: CRL66, CRL575, CRL1434 y CRL143

Figura 10| Niveles de producción de leptina por adipocitos (cultivo primario) estimulados con: BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarumCRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576). Control (-): adipocitos sin estimular (DEMEN), Control (+): adipocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS). Los valores se expresan como la media ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinado en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05)

Control (+

)

Control (-

)

CRL1446

CRL117

CRL66

CRL431

CRL1063

CRL72

CRL1434

CRL350

CRL576

CRL353

CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500a

a

b b b

cc cccc

dd

d d d


70

Perfil de adipoquinas inducido por BL en un co-cultivo de macrófagos y adipocitos murinos

Teniendo en cuenta la comunicación que existe entre las diferentes células que

componen el tejido adiposo, evaluamos como BL pueden influir sobre la producción de

adipoquinas (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 y leptina) en un co-cultivo de macrófagos y

adipocitos. Esto debido a que son las principales células que componen este tejido, lo

cual nos permitió realizar un estudio comparativo con el efecto observado en el mono-

cultivo.

Las células en co-cultivo fueron estimuladas con las diferentes BL al igual que en

mono-cultivo. Al igual que en los casos anteriores observamos un efecto cepa

dependiente para la producción de adipoquinas (Figura 11), que fue diferente al efecto

ejercido sobre los cultivos individuales de macrófagos y adipocitos. De esta manera,

demostramos la influencia que tienen entre si las moléculas producidas por ambas

células, y que su producción depende del perfil global de adipoquinas. Al igual que en

los cultivos individuales todas las cepas indujeron concentraciones de adipoquinas

inferiores a las inducidas por LPS. La cepa CRL1434 indujo los niveles más altos para las

citoquinas TNF-α e IL-10 (Figura 11, A y D), y de igual manera para IL-6 y MCP-1

(Figura 11, B y C) encontrándose dicha bacteria entre las cepas con mayor capacidad

adipomuladora. La cepa CRL431 fue el inductor más potente de la secreción de MCP-1

(Figura 11, C). Las cepas CRL1063, CRL72, CRL355 y CRL352 indujeron niveles medios

de producción tanto de TNF-α como de IL-6. Finalmente, las cepas CRL1446, CRL66,

CRL117, CRL353 y CRL143 estuvieron entre las cepas que indujeron los niveles más

bajos de adipoquinas (Figura 11, A y B).


71

Figura 11| Niveles de producción de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) MCP-1 y (D) IL-10, por el co-cultivo de adipocitos y macrófagos estimulados con, BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarumCRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576), en una concentración de 1 x 106 UFC/pocillo. Control (-): adipocitos sin estimular (DEMEN), Control (+): adipocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS). Los valores se expresan como la media ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinado en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05).

Control (+

)

Control (-

)

CRL1446

CRL117

CRL66

CRL431

CRL1063

CRL72

CRL1434

CRL350

CRL576

CRL353

CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

Control (+

)Contro

l (-)

CRL1446

CRL117

CRL66CRL43

1CRL10

63CRL72

CRL1434

CRL350

CRL576

CRL353

CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

Control (+

)Contro

l (-)

CRL1446

CRL117

CRL66CRL43

1CRL10

63CRL72

CRL1434

CRL350

CRL576

CRL353

CRL355

CRL575

CRL352

CRL143

A B

C D


72

Perfil de leptina inducido por BL en un co-cultivo de macrófagos y adipocitos murinos

La producción de leptina (Figura 12) fue modulada por las BL en forma cepa

dependiente y fue diferente a la observada en los adipocitos. La cepa CRL431 indujo los

niveles significativamente más altos de esta hormona mostrando un comportamiento

opuesto al observado solo en presencia de células adiposas. Las cepas CRL117, CRL1434,

CRL576, CRL355, CRL575, CRL352 y CRL143 indujeron niveles de leptina similares al

LPS. Por otro lado, hubo cepas (CRL1446, CRL1063) que no modificaron los niveles de

leptina con respecto al control (-), y dos cepas (CRL72 y CRL353) que redujeron

significativamente los niveles de la hormona por debajo del control (-).

Figura 12| Niveles de producción de leptina en co-cultivo (adipocitos y macrófagos) estimulados con BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarumCRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576). Control (-): adipocitos sin estimular (DEMEN), Control (+): adipocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS). Los valores se expresan como la media ± DS (desvío estándar) de cada grupo determinado en tres experimentos independientes (n=3). Letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05).


73

Asociación de BL en función del perfil adipomodulador y la expresión de Ob-R en un co-cultivo de macrófagos y adipocitos murinos

Mediante un análisis multivariante (AM), que permite agrupar objetos similares

y diferenciarlos de aquellos que no lo son, separamos las diferentes BL de acuerdo a su

perfil adipomodulador (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 y leptina) en co-cultivo y de la

expresión del receptor Ob-Rb determinado sólo en macrófagos. El dendograma de la

Figura13, nos permite observar siete (7) grupos que se diferenciaron entre si mostrando

un porcentaje de similitud por debajo del 68%. El grupo I contiene únicamente al

estímulo con LPS (pro-inflamatorio), que se diferenció completamente (similitud 0%) del

resto de grupos, con excepción del grupo II, que incluye la cepa CRL1434, con la que

mostró un 56% de similitud. Consideramos entonces a la cepa CRL1434 como la

principal inductora en este sistema. Por otro lado, analizando el grupo III, observamos

una fuerte correlación (similitud ≥83%) entre las cepas CRL353, CRL72 y el control (-),

lo que indica que estas cepas fueron las de menor capacidad inductora, inclusive

redujeron los niveles de leptina en este sistema. Los grupos IV y VII (similitud 42%),

incluyendo las cepas CRL1063 y CRL431 respectivamente, se caracterizaron por

incrementar adipoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6 y MCP-1 en co-cultivo) así

como el receptor de leptina (Ob-R en macrófagos), destacándose la cepa CRL431 que,

además, en este sistema, se encuentra dentro de las cepas que favorecen la secreción de

leptina. Finalmente, los grupos V (CRL1446, CRL66, CRL117, CRL143 y CRL575) y VI

(CRL350, CRL576, CRL352 y CRL355) compartieron un porcentaje de similitud cercano

al 70% y se caracterizaron por incluir cepas con perfiles adipomoduladores intermedios

entre ambos controles, positivo (LPS) y negativo (producción basal).


74

Figura 13| El análisis de clúster multivariante muestra el porcentaje de similitud entre los diferentes estímulos con BL (L. casei CRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. caseiCRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarumCRL352, L. plantarum CRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575 y L. casei ssp rhamnosus CRL576), teniendo en cuenta el perfil adipomodulador en co-cultivo (IL-6, IL-10, TNF-α, MCP-1 y leptina) y los niveles de expresión de Ob-R en macrófagos. Control (-): macrófagos sin estimular, Control (+): macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS). El análisis se realizó utilizando el método de asociación completo con el coeficiente de Pearson.

La asociación de BL en función del perfil adipomodulador y la expresión de Ob-

R fue también determinada por el análisis de componentes múltiples (ACP). El ACP se

muestra en la Figura 14. En este sistema asociamos las BL en tres grupos: I) Incluye a las

cepas CRL352, CRL576, CR355 y CRL431; II) Incluye a las cepas CRL75, CRL143,

CRL350, CRL117, CRL353, CRL72, CRL1063, CRL66 y CRL1446, de las cuales las 4

últimas están próximas al control (-) y, III) incluye a la cepa CRL1434 próxima al control

(+) o LPS.

De acuerdo a los resultados de la matriz de correlaciones (Pearson) obtenidas en

este ACP podemos decir que las variables estudiadas se correlacionan positivamente.

TNF-α se correlaciona significativamente con IL-6, MCP-1, IL-10 y Ob-R y no así con

leptina. Sin embargo, IL-6 se correlacionó con leptina y estas dos adipoquinas a su vez

CRL431

CRL355

CRL352

CRL576

CRL350

CRL575

CRL143

CRL117

CRL66

CRL1446

CRL106

3CRL72

CRL353

Control (-

)

CRL1434

Contro

l (+)

0,00

33,33

66,67

100,00

Sim

ilit

ud(%

)

I IIIII IV

V VI

VII


75

se correlacionaron significativamente con IL-10. Interesantemente, este análisis no

correlaciona significativamente la leptina con su receptor (Tabla 3).

Tabla 3| Matriz de correlaciones (Pearson):

Correlación entre TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 y leptina producidas en el co-cultivo de macrófagos y adipocitos, además de la expresión del receptor de leptina (OB-R), expresado por macrófagos (RAW264.7), al ser estimulados por diferentes BL. los valores en negrita indican correlación positiva con un nivel de significación alfa <0,05.

Figura 14| Biplot del ACP obtenido de los valores de TNF-α, IL-6, IL-10 y MCP-1 producidos por la estimulación de macrófagos con BL. Los puntos están codificados para cada cepa y controles (L. caseiCRL431, L. acidophilus CRL258, L. acidophilus CRL1063, L. casei CRL66, L. casei CRL72, L. casei CRL117, L. fermentum CRL1446, Lactococcus lactis CRL1434, L. plantarum CRL350, L. plantarum CRL352, L. plantarumCRL353, L. plantarum CRL355, L. paracasei CRL575, L. casei ssp rhamnosus CRL576, control (+) (LPS) y control (-) DEMEN). La posición de algunos puntos fue ligeramente modificada para evitar superposición.

Variables TNF-α IL-6 MCP-1 IL-10 Leptina OB-Rb

TNF-α 1 0,689 0,960 0,914 0,401 0,774

IL-6 0,689 1 0,766 0,590 0,654 0,448

MCP-1 0,960 0,766 1 0,829 0,529 0,690

IL-10 0,914 0,590 0,829 1 0,300 0,732

Leptina 0,401 0,654 0,529 0,300 1 0,328

OB-Rb 0,774 0,448 0,690 0,732 0,328 1

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Discusión

76

Discusión

Los microorganismos probióticos han sido investigados por su potencial uso en el

tratamiento o prevención de trastornos nutricionales asociados con la desregulación

inmune, como es el caso de la desnutrición (Gauffin et al., 2002) o de la obesidad (Yin et

al., 2010; Cano et al., 2013a), sin que se haya llegado a dilucidar completamente el

mecanismo de acción de estas bacterias. Por otro lado, se ha identificado recientemente a la

MI como un importante factor que influye sobre las reacciones inflamatorias sistémicas

actuando sobre tejidos distantes (Burcelin et al., 2013). Diferentes productos derivados de la

microbiota pueden ejercer efectos anti o pro-inflamatorios. En este sentido, se ha descripto

que la translocación desde el lumen intestinal a la circulación de LPS (componente de la

pared celular de bacterias Gram (-)) conduce a endotoxemia metabólica y podría además

estimular el tejido adiposo e inducir un estado inflamatorio crónico (Cani et al., 2007a;

Carvalho and Abdalla Saad, 2013; Burcelin et al., 2013; Caesar et al., 2015). Además, ha sido

sugerido que los productos microbianos asociados a inmunobióticos también pueden

atravesar la barrera intestinal, siendo capaces de modular tejidos distantes (como el tejido

adiposo) a través de la inducción de cambios en los perfiles de citoquinas (Suzuki et al.,

2015).

El tejido adiposo (TA) es un órgano endócrino activo, e histológicamente no es

homogéneo, ya que está conformado por varios componentes celulares tales como

adipocitos maduros, preadipocitos, fibroblastos, células endoteliales y macrófagos, entre

otras células inmunes (Sam and Mazzone, 2014). Cambios en la estructura del tejido adiposo

están asociados a cambios en sus funciones metabólicas y endócrinas, lo cual conduce a la

producción alterada de adipoquinas y las consecuentes complicaciones metabólicas

(Weisberg et al., 2003).

En este trabajo de tesis realizamos la selección de BL capaces de modular la respuesta

de las principales células que componen el tejido adiposo (adipocitos y macrófagos)

empleando un sistema in vitro (Macrófagos-Adipocitos-BL), de tal manera de abordar el

desarrollo de un método de screening de microorganismos con potencial terapéutico sobre


77

patologías nutricionales. En este sentido, demostramos que BL viables tienen un efecto

adipomodulador cepa dependiente, algo que no se había demostrado hasta el momento, ya

que en la mayoría de los casos reportados se utilizaron extractos o medios condicionados

por bacterias (Bleau et al., 2005). Además, observamos que la secreción de leptina y

citoquinas fue afectada de manera diferente cuando comparamos el estímulo de las BL sobre

un mono-cultivo de adipocitos y un co-cultivo de macrófagos y adipocitos. Con lo cual, este

capítulo de tesis revalida la interrelación que existe entre estas células en el TA y

proporciona evidencia adicional que demuestra la interconexión entre leptina, citoquinas y

quimoquinas en la regulación del sistema inmune.

Los macrófagos son células fagocíticas que participan en el sistema inmune innato y

adaptativo. Son, además, una de las principales células que están en contacto con los

microorganismos en el intestino (Cerovic et al., 2014). Este contacto puede realizarse

mediante la fagocitosis o por reconocimiento a través de diferentes receptores, como los que

reconocen patrones moleculares asociados a microorganismos (PMAMs) entre los que se

destacan los receptores Toll-Like (TLRs). Además del intestino, estas células se encuentran

en diversos tejidos, siendo una de las principales células inmunes del tejido adiposo visceral

(TAV), encontrándose tanto en sujetos delgados como obesos, donde pueden representar

entre el 5 y el 60 % de las células inmunes del TA (Morris et al., 2011; Michaud et al., 2012).

Esto destaca la importancia de los macrófagos en la respuesta inmune innata y su posterior

transición a la respuesta inmune adaptativa, en los trastornos metabólicos donde su número

y nivel de activación esta alterado (Lee and Lee, 2014). Al modificarse el número de

macrófagos y su nivel de activación, se afectan parámetros metabólicos como la resistencia

a la insulina asociados a la obesidad (Martí et al., 2001) o la respuesta a infecciones asociada

a la desnutrición (Keusch, 2003; Heilbronn and Campbell, 2008), esto principalmente debido

al nivel de polarización dinámico entre macrófagos activados clásicamente M1 (productores

de citoquinas pro-inflamatorias) y macrófagos activados alternativamente M2 (productores

de citoquinas anti-inflamatorias) presentes en el TA (Mraz and Haluzik, 2014). El nivel de

activación está asociado con un perfil de citoquinas determinado, y este se encuentra


78

desregulado en los trastornos metabólicos (Cildir et al., 2013). Los macrófagos son, por

tanto, esenciales no sólo para la inmunidad, sino también para mantener la homeostasis de

tejidos, como el TA (Sieweke and Allen, 2013).

Teniendo en cuenta el rol que juegan los macrófagos en la meta-inflamación es que

seleccionamos a estas células para evaluar el efecto de diferentes BL sobre la modulación

del perfil de citoquinas (capacidad inmunomoduladora), y de esta manera seleccionar, en

primer lugar, cepas inmunobióticas (capaces de modular la respuesta inmune). En este

contexto, evaluamos las principales citoquinas involucradas en la meta-inflamación: TNF-

α (citoquina pro-inflamatoria), IL-6, (citoquina pro o anti-inflamatoria), e IL-10 (citoquina

anti-inflamatoria), además de una quimoquina pro-inflamatoria, MCP-1, implicada en el

reclutamiento de macrófagos a los sitios de inflamación como ser el TA en casos de obesidad

(Arango Duque and Descoteaux, 2014). Nuestros resultados indican que existen diferencias

en el perfil inmunomodulador de las cepas estudiadas, sugiriendo que cada cepa induce

distintos niveles de activación en los macrófagos. Cabe mencionar que las propiedades de

una cepa no pueden ser extrapoladas a otras, incluso si pertenecen a la misma especie (Dogi

et al., 2008). La estimulación de células RAW264.7 con diferentes BL indujo cambios de

citoquinas tanto pro- como anti-inflamatorias y en la mayoría de los casos los niveles de

citoquinas y quimoquinas fueron menores que los niveles inducidos por el estímulo pro-

inflamatorio (LPS), lo cual coincide con lo reportado por otros autores (Cross et al., 2004;

Dong et al., 2010; Won et al., 2011). Dong et al. mostraron, que el LPS indujo mayor

producción de IL-6 e IL-10 y menor de IL-1β que Lactobacillus casei Shirota (LcS), cepa que

estimuló una elevada producción de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 y TNF-α, en PBMC (Dong et

al., 2010). Estos mismos autores, en un estudio in vitro usando la línea celular murina de

monocitos/macrófagos J774A.1, observaron que LcS fue capaz de estimular IL-12 y TNF-α

pero no IL-10 (Cross et al., 2004), lo cual demuestra al igual que nuestros resultados que el

efecto no solo es cepa dependiente sino también célula dependiente, ya que las BL utilizadas

en este trabajo mostraron un comportamiento diferente sobre la producción de citoquinas

según el tipo de célula estimulada (macrófago o adipocito). Juarez et al., en condiciones no-


79

inflamatorias, demostraron que L. reuteri CRL1101 (CRL1101) fue capaz de incrementar la

producción de TNF-α, IL-6 e IL-10 en RAW 264.7 (Juarez et al., 2013) y reducir la producción

de TNF-α cuando los macrófagos fueron primero desafiados con LPS y luego tratados con

CRL1101, demostrando que el efecto de BL también depende de los pre- o post-estímulos

que reciben las células. En este caso, Juarez et al. concluyeron que la selección de cepas que

regulen el perfil de citoquinas producidos por macrófagos puede ser valioso para la

selección de cepas inmunomoduladoras in vivo.

La interpretación de los efectos de BL sobre el perfil de citoquinas resulta bastante

complejo, aunque la literatura científica sostiene suficiente evidencia de que la influencia de

estos microorganismos sobre la inmunidad innata está vinculada a su capacidad para

regular la inflamación en determinadas condiciones y así ejercer sus efectos benéficos sobre

el hospedador (Marranzino et al., 2012; Villena et al., 2012; Juarez et al., 2013). En nuestro

caso, las cepas CRL1063 y CRL1434 indujeron niveles significativamente superiores de TNF-

α e IL-10 (respectivamente) que los otros microorganismos estudiados, destacándose como

las cepas con mayor efecto inmunomodulador en RAW264.7. Diferentes estudios indican

que un incremento en la expresión de TNF-α está estrechamente vinculado a una secreción

de IL-10 ya que es una citoquina reguladora de la inflamación (Juarez et al., 2013). En este

sentido, CRL1434 indujo niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias y de MCP-1, a

pesar que estos valores fueron inferiores a los inducidos por LPS, sin embargo, mostró

valores similares a LPS para IL-10, lo cual apoya lo reportado anteriormente. Finalmente, en

este sentido no establecimos una correlación positiva entre TNF-α e IL-10, para todas las

cepas evaluadas, demostrando que, a pesar de tener una estrecha relación, la producción de

estas dos citoquinas no sigue un comportamiento homogéneo, y dicho efecto es más bien

dependiente de cada cepa. Con lo cual sugerimos que la relación IL-10/TNF-α podría

representar un buen criterio de selección de cepas inmunobioticas.

Teniendo en cuenta la capacidad inmunomoduladora de CRL1434, esta cepa podría

inducir una activación en macrófagos, debido a los niveles elevados de IL-10 en relación a

TNF-α, y de esta manera inhibir, la respuesta TH1 exacerbada en la inflamación metabólica


80

asociada con la obesidad. Mientras que CRL1063 o CRL431 podrían favorecer la respuesta

TH1 y contribuir a la defensa contra infecciones en los casos de desnutrición, teniendo en

cuenta los elevados niveles de TNF-α en relación a IL-10, inducidos. Estas hipótesis

necesitan ser confirmadas con ensayos in vivo. La caracterización de cómo el sistema inmune

innato responde a estas bacterias in vitro puede sugerir sobre los eventos

inmunomoduladores que se activan después de la administración oral de un

microorganismo (in vivo).

Por otra parte, en cuanto a la expresión del receptor de leptina (Ob-R), estudiamos

la capacidad de las diferentes BL para modular su expresión en macrófagos (RAW264.7) y

de esta manera poder dilucidar mecanismos en donde participe la leptina y nos permitan

comprender mejor la inmunobiología del TA. Los niveles de OB-R son expresados

constitutivamente en macrófagos, linfocitos B y linfocito T (Papathanassoglou et al., 2006b).

Estos mismos autores demostraron que la resistencia a leptina inducida por dietas altas en

grasas está asociada a una alteración de la capacidad de señalización mediada por OB-

R/STAT-3, no sólo a nivel central (hipotálamo) sino también periférico. Además ha sido

demostrado que monocitos humanos activados por altas dosis de leptina inducen la

producción de citoquinas pro-inflamatorias lo que demuestra la expresión de Ob-R en estas

células (Zarkesh-Esfahani et al., 2001). Nuestros resultados demuestran que el efecto de las

BL sobre la expresión de Ob-R fue cepa dependiente y estuvo asociado a su capacidad

inmunomoduladora; es decir, las cepas con mayor efecto inmunomodulador (CRL1434,

CRL1063, CRL431) mostraron los porcentajes de expresión más altos para el receptor,

demostrando una correlación positiva entre la producción de citoquinas y la expresión del

receptor de leptina en macrófagos (RAW 264.7). Esto pone de relieve el efecto de las BL

sobre la respuesta inmune, ya que no solo son capaces de regular la producción de

citoquinas, sino también son capaces de afectar la sensibilidad de células del sistema inmune

(macrofagos) a las adipoquinas (leptina).

Por otro lado, evaluamos la producción de leptina como eje central de la producción de

adipoquinas. En este sentido, Papathanassoglou et al. sugirieron que el estado nutricional, a


81

través de mecanismos dependientes de leptina, podría alterar la naturaleza y el vigor de la

respuesta inmune (Papathanassoglou et al., 2006b). Nuestro trabajo muestra evidencia del

efecto de BL viables, tanto sobre leptina como sobre la expresión de su receptor. Utilizamos

los niveles de leptina como una característica o criterio de selección de cepas in vitro. Es

necesario clarificar si la leptina puede directamente o indirectamente contribuir a la

expresión de mediadores pro-inflamatorios. Ha sido demostrado por otros autores que

cepas de BL tienen diferentes capacidadades para inducir la secreción de leptina in vivo o in

vitro (utilizando extractos o medios condicionados) (Bleau et al., 2005c; McMullen et al.,

2006; Sousa et al., 2008). En nuestro caso, utilizamos cepas viables y observamos una

modulación cepa dependiente de la producción de leptina en adipocitos en mono y co-

cultivo con macrófagos. Sin embargo, al igual que otros autores, sugerimos que mediadores

producidos por otras células que componen el tejido adiposo, como los macrófagos,

influyen sobre la capacidad secretora de los adipocitos y viceversa, esto debido a que

observamos diferencia en la secreción de leptina, citoquinas y quimoquina, comparando el

mono y el co-cultivo (Ouchi et al., 2011; Huh et al., 2014). De Palma et al. también

demostraron, en otro sistema de co-cultivo (Células mononucleares de sangre periférica

PBMC y células Caco2), que algunos microorganismos tuvieron un comportamiento

diferente en cuanto a la producción de citoquinas cuando se utilizaron cultivos de células

individuales o co-cultivo (G De Palma, 2009).

Observamos que la cepa CRL431 mostró una reducción significativa de los niveles

de leptina, comparado con el control (-), cuando se estimulaban adipocitos, pero niveles

significativamente mayores que el LPS en el co-cultivo de Macrófagos-Adipocitos-BL (Mac-

Adi-BL). Algo similar ocurrió con la cepa CRL1434, que mostró niveles de leptina

significativamente mayores que el LPS al estimular los adipocitos, pero en el sistema Mac-

Adi-BL presentó valores similares al LPS. Esto refleja claramente la intercomunicación que

existe entre estas dos células (macrófagos y adipocitos) y que las BL pueden afectar la

producción de adipoquinas en este sistema. Kusunoki et al., utilizando el mismo sistema de

co-cultivo, demostraron inhibición del circulo vicioso que lleva a la inflamación crónica,


82

entre adipocitos y macrófagos, a través de la inhibición de citoquinas pro-inflamatorias

(TNF-α, IL-6 y MCP-1) de macrófagos y el aumento de adiponectina por adipocitos. Este

efecto, fue inducido por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Kusunoki et al.,

2014). Miyazawa et al. demostraron cómo el aumento de citoquinas pro-inflamatorias (IL-6,

IL-12 y TNF-α) inhibió la diferenciación de una línea célular de fibroblastos (3T3L1) en

adipocitos, a pesar que no determinaron componentes anti-inflamatorios, (Miyazawa et al.,

2012) sugiriendo que los lactobacilos podrían modular la diferenciación adipogénica y por

consiguiente la hipertrofia de los adipocitos. Esto, también fue sugerido por Suzuki et al.

pero en referencia al perfil de citoquinas producido por los adipocitos estimulados con BL

(Suzuki et al., 2015).

Nuestros resultados sugieren que, además de las citoquinas inflamatorias tales como

TNF-α, IL-6 y MCP-1, otras moléculas funcionales, como leptina, producidas por adipocitos

estimulados con BL, de una manera cepa dependiente, pueden influir en la diferenciación y

crecimiento de pre-adipocitos y adipocitos, y afectar el perfil de citoquinas y adipoquinas

producido en este sistema (Mac-Adi-BL).

Por otro lado, observamos una producción significativamente mayor de IL-6 en adipocitos

comparados con macrófagos, reflejando el aporte de los adipocitos sobre esta molécula que

está relacionada con la infiltración de macrófagos y la resistencia a insulina en el tejido

adiposo (Kanda et al., 2006; Bastard et al., 2007). En individuos obesos esta citoquina esta

incrementada (Bastard et al., 2007), y se estima que entre el 15 y el 35 % de los niveles de IL-

6 sistémica provienen del TA, además se correlaciona mejor que el TNF-α con los niveles de

TA y leptina en individuos con obesidad (Kern et al., 2001; Bastard et al., 2007). Podemos

sugerir, teniendo en cuenta nuestros resultados in vitro, que los niveles aumentados de IL-6

en la obesidad, podrían provenir principalmente de los adipocitos que componen el TA.

Además, como determinamos una correlación positiva entre leptina, IL-6 y MCP-1,

sugerimos que la determinación de estas tres moléculas principalmente en un método de

selección de cepas adipomoduladoras in vitro, debería tenerse en cuenta como criterio de

selección. Algo similar fue reportado por Miyazawa et al. (Miyazawa et al., 2012), en ese


83

estudio demostraron que el sobrenadante de adipocitos 3T3-L1, condicionado por BL,

estimuló significativamente la producción de IL-6 e IL-12 (pero no de TNF-α) en macrófagos

murinos (J774.1). Estableciendo de esta manera la influencia de los adipocitos en la respuesta

inmunes de macrófagos.

Por otro lado, algunos autores han indicado que aumentos en los niveles de leptina

se correlacionan con reducción de los niveles de IL10, en este caso esta relación fue

consecuencia de cambios en el tamaño de los adipocitos (Skurk et al., 2007a); Farnier et al.,

2003). Singh et al. demostraron que antagonistas de leptina mejoraron la colitis crónica en

ratones deficientes de IL-10 (Singh et al., 2013) demostrando el estrecho vínculo entre la

inflamación y la leptina, y sugiriendo un efecto regulador de IL-10 en los mecanismos de

acción de esta hormona. En este sentido, determinamos una correlación positiva entre

leptina e IL-10, por lo que podrían existir un efecto contraregulador entre estas dos

moléculas, algo similar a lo que ocurre con IL-10 y TNF-α. Observamos, además, en el

sistema Mac-Adi-BL una mayor concentración de adipoquinas (IL-6, IL-10, TNF-α, MCP-1

y leptina) cuando comparamos los niveles de producción de estas moléculas entre cultivos

individuales de macrófagos y adipocitos con el co-cultivo, otra evidencia de la estrecha

relación entre estas células que sugiere un posible efecto sinérgico en la producción de

adipoquinas cuando ambas están presentes. Este efecto sinérgico podría favorecer el circulo

vicioso entre las alteraciones metabólicas y la inflamación crónica en la obesidad. Si tenemos

en cuenta el aumento de macrófagos en el TA asociado con obesidad (Mraz and Haluzik,

2014b), el aumento de la producción de citoquinas en estas células mediado por leptina

(Fernández-Riejos et al., 2010), y el posible efecto sinérgico sobre la producción de citoquinas

entre macrófagos y adipocitos, donde interviene la leptina, demostramos el rol clave que

juega la leptina en vincular el estado nutricional con la competencia inmune, y la

importancia de seleccionar cepas con capacidad para modular los niveles de esta

adipoquina.

Sugerimos que las cepas CRL575, CRL143, CRL350, CRL117, CRL352, CRL576,

CRL355, CRL431 y CRL1434, las cuales inducen niveles altos de leptina (ya sea en adipocitos


84

o en el sistema Mac-Adi-BL) podrían estar orientadas para la utilización en terapias

nutricionales de enfermedades que cursen con niveles reducidos de leptina. En un caso

opuesto, disminución de los niveles de esta adipoquina serían necesarios para la

intervención de patologías inflamatorias o autoinmunes (La Cava et al., 2004), donde las

cepas CRL72, CRL66 y CRL1446 podrían ser utilizadas.

Finalmente, es importante mencionar que no hay contacto directo claramente establecido

entre las bacterias intestinales y el tejido adiposo o al menos que se haya demostrado hasta

el momento, a pesar de la hipótesis de la migración de microorganismos intestinales hacia

órganos periféricos (Burcelin et al., 2013; Lluch et al., 2015). Sin embargo, este contacto

podría estar mediado indirectamente a través de la translocación de productos bacterianos

(LPS, ADN, flagelina, LTA, PSA, etc.) desde el lumen intestinal hacia estos tejidos, o la

producción de citoquinas intestinales que afectan órganos periféricos, estimulando algunos

receptores de reconocimiento de patrones tales como los TLRs (Wolowczuk et al., 2008a;

Raybould, 2012; Lumeng, 2013; Lee and Lee, 2014; Cavalcante-Silva et al., 2015). Por otro

lado, la alteración de la barrera intestinal, como ocurre en distintos estados de malnutrición,

conduce a un aumento de la permeabilidad con la consiguiente exposición de los TLRs a

PMAMs derivados de la microbiota, tanto a nivel local (intestino) como sistémico (TA).

Batra et al. demostraron que la expresión y la capacidad de respuesta de los TLRs (TLR-1 a

-9) en pre-adipocitos y adipocitos murinos, están fuertemente regulados por leptina (Batra

et al., 2007). Teniendo esto en cuenta, consideramos que las BL adipomoduladoras, podrían

afectar la expresión de TLRs y por ende la respuesta inmune, pudiendo representar uno de

los mecanismos que utilizan estas bacterias para ejercer sus efectos beneficiosos sobre el

hospedador. Esto junto con las acciones pro-inflamatorias de esta hormona en una variedad

de células inmunes y otros tipos de células (Jaedicke et al., 2013), nos llevan a proponer que

las alteraciones inmunometabolicas podrian ser reguladas mediante la administración de

BL adipomoduladoras.

Finalmente, teniendo en cuenta el perfil adipomodulador, cepa dependiente, de las

BL (en el co-cultivo macrófagos-adipocitos), pudimos agruparlas en diferentes clusters


85

mostrando distintos porcentajes de similitudes entre ellas. En este contexto, es fundamental

seleccionar cepas con capacidades adipomoduladoras diferentes para estudiarlas in vivo, y

determinar si existe una correlación con los ensayos in vitro. Establecer, además, si estas

cepas podrían ser implementadas en el tratamiento de enfermedades donde los niveles de

leptina y la respuesta inmune estén desregulados.

El AM y el ACP, nos permitieron seleccionar tres cepas con perfiles diferentes para

ser evaluadas in vivo y corroborar sus efectos. De este modo seleccionamos las cepas L. casei

CRL431, L. fermentum CRL1446 y L. lactis CRL1434 como representativos de tres perfiles

adipomoduladores diferentes. En la Figura 15 resumimos el efecto adipoinmunomodulador

determinado en un sistema de co-cultivo de macrófagos y adipocitos.

Figura 15| Efecto adipoinmunomodulador de BL determinado en un sistema de co-cultivo de macrófagos y adipocitos (Mac-Adi-BL). Con diferentes colores se agrupan cepas con perfiles adipomoduladores diferentes, color azul (bajo), color gris (intermedio) y color rojo (alto), teniendo en cuenta los niveles de adipoquinas inducidos por cada cepa en el co-cultivo (TNFα, IL-6, MCP-1, IL-10, leptina y Ob-R).


86

El uso de microorganismos con propiedades para modular los niveles de

adipoquinas (leptina principalmente) podría ser una estrategia para el tratamiento de

algunas enfermedades metabólicas asociadas con alteraciones inmunes. Este enfoque podría

ser fácilmente aplicable en la obesidad y la desnutrición. Para tal fin seleccionamos estas tres

cepas (L. fermentum CRL1446, L. casei CRL431 y L. lactis CRL1434) con características

diferentes que nos permitirán establecer si existe una correlación entre la selección in vitro y

sus efectos in vivo.

Breve reseña de las BL seleccionadas

L. fermentum CRL1446 es un microorganismo con propiedades hipoglucémicas e

hipocolesterólemicas determinado en modelos experimentales en ratón (Abeijón Mukdsi et

al., 2012; Russo et al., 2016). Esta cepa, que posee la característica de regular los niveles de

leptina y de poseer un perfil inflamatorio bajo, con valores similares a los basales (resultados

in vitro obtenidos en este capítulo) podría ser una interesante alternativa para estrategias

orientadas a tratar la obesidad.

En relación a L. casei CRL431, es un probiótico de trayectoria reconocida, con

demostrados efectos inmunomoduladores, protección frente a infecciones en huéspedes

desnutridos (Gauffin et al., 2002a; Zelaya et al., 2012), activación de la inmunidad de la

mucosa intestinal (Galdeano and Perdigón, 2006) y la migración de la activación local a nivel

sistémico (Villena et al., 2011; Marranzino et al., 2012). A pesar de todos los estudios

disponibles no se estudió hasta ahora su capacidad adipomoduladora, con lo cual nuestros

resultados son un aporte para dilucidar los mecanismos que esta cepa utiliza para ejercer

sus reconocidos efectos probióticos. La inducción de la producción de leptina ejercida por

L. casei CRL431 observada en el co-cultivo la transforman en una de las cepas con mayor

potencial para aliviar las alteraciones inmunometabólicas asociadas a la desnutrición.

L. lactis CRL1434 fue la cepa que mostró el mayor efecto inmunomodulador y

adipomodulador in vitro, con los mayores niveles de citoquinas (macrófagos y adipocitos),

y elevados niveles de leptina (adipocitos y co-cultivo Mac-Adi-BL), lo cual la postula como


87

una gran candidata para ser evaluada en modelos de malnutrición in vivo, y poder comparar

sus efectos con las dos cepas anteriores.

Capítulo I Selección de BL moduladoras de adipoquinas Conclusiones

88

Conclusiones Este capítulo nos permitió determinar la capacidad adipomoduladora de

diferentes BL in vitro, algo que no se había estudiado hasta el momento. Determinamos

que la capacidad inmunobiótica (sobre macrófagos) de las cepas evaluadas afecta su

capacidad adipomoduladora (sistema Mac-Adi-BL). En este sistema, las BL

demostraron tener una gran influencia ya que no sólo modularon la producción de

leptina (efecto cepa dependiente) sino también afectaron la expresión de su receptor

(Ob-R en macrófagos) con lo cual pueden regular tanto los niveles de la adipoquinas

como su sensibilidad.

En este contexto, abordamos el desarrollo de un método de screening de

microorganismos (in vitro) con potencial terapéutico en malnutrición, que nos permitió

seleccionar tres cepas de BL con diferentes efectos adipomoduladores para su posterior

evaluación in vivo.

89

Capítulo II

Obesidad, la epidemia del siglo XXI

Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de obesidad

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Introducción

90

Introducción

Hasta principios del siglo XX, se consideraba a la obesidad como una problemática

individual, producto del descontrol con las comidas, y por lo tanto de total responsabilidad

de cada individuo. Esta situación se fue modificando a lo largo del tiempo y en la actualidad

la obesidad es declarada una epidemia multifactorial que representa una gran problemática

para la salud pública y la economía mundial (Ng et al., 2014), e involucra y responsabiliza a

cuatro áreas importantes de la sociedad “el consumidor”, “el estado”, “la industria

alimentaria” y “las ciencias de la salud”.

Hasta ahora, a pesar de la intensa investigación, los mecanismos subyacentes

implicados en el desarrollo de obesidad no han sido completamente aclarados. Sin embargo,

ha quedado bien establecido que tres factores principales (dieta, genética y MI) interactúan

entre sí y establecen el perfil inmuno-metabólico que determina el estado de salud general

del hospedador. El intestino, el cerebro y el tejido adiposo son los órganos afectados

principalmente por la interacción de estos tres factores dando lugar al desarrollo de esta

enfermedad (Wit et al., 2008, Blüher, 2009; Kälin et al., 2015). El papel de la inmunidad de la

mucosa intestinal (IMI) y del tejido adiposo visceral (TAV), es crítico para controlar la

homeostasis local, sistémica y la desregulación inmuno-metabólica asociada a la obesidad

inducida por la dieta (OID) (Sanz et al., 2013b), (Kredel and Siegmund, 2014;, Lean and

Malkova, 2015). A su vez, el sistema inmune juega un papel clave en la regulación de la

microbiota intestinal además de ser profundamente afectado por la dieta, con lo cual

además de su papel en la infección/ inflamación, la inmunidad puede jugar un papel clave

en la promoción de la salud o el desarrollo de enfermedades metabólicas (Palm et al., 2015;

De Rosa et al., 2015).

La microbiota intestinal humana abarca un ecosistema densamente poblado que

proporciona funciones esenciales para el hospedador, afectando el metabolismo y la

maduración inmune en un estado de simbiosis (Hooper and Macpherson, 2010), pero

cambios en la composición de la microbiota intestinal (disbiosis) se han observado en la

obesidad, y algunos experimentos con animales han sugerido esto como una causalidad del

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Introducción

91

desarrollo de esta enfermedad (Cani et al., 2007; Cani, 2014, Kredel and Siegmund, 2014;

Cani and Everard, 2015). En los seres humanos y ratones, el desarrollo de la obesidad se

correlaciona, en la mayoría de los casos, con cambios en la abundancia relativa de dos filos

bacterianos dominantes en el intestino, Bacteroidetes y Firmicutes, reportándose una

reducción del primero y un aumento del segundo, lo cual incrementa el índice

Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) (Xu and Gordon, 2003; Martens et al., 2008). Además, se ha

demostrado que la transferencia de la microbiota intestinal de ratones genéticamente obesos

(ob/ob) a ratones de tipo salvaje (WT) libres de gérmenes conduce a un aumento de la masa

grasa, dando lugar a la especulación de que la microbiota intestinal promueve la obesidad

mediante el aumento de la capacidad del huésped para extraer energía a partir de los

alimentos ingeridos (Hooper et al., 2001), además de controlar la ingesta de alimentos y la

distribución de dicha energía (Parekh et al., 2014).

El tejido adiposo (TA) se encuentra en la intersección de la nutrición, el metabolismo

y la inmunidad. La inflamación del TA fue propuesto como un mecanismo central en el

desarrollo de obesidad y sus complicaciones metabólicas y vasculares (Mraz and Haluzik

2014). Células inmunes residentes del TA son el segundo mayor componente celular

después de los adipocitos y, como tal, juegan un papel importante en el mantenimiento de

la homeostasis local y sistémica. Los cambios inducidos por la obesidad en el número de

células, la funcionalidad y el perfil de adipoquinas, resulta en la activación de la respuesta

inflamatoria local y sistémica, que marca la transición de la simple adiposidad a la

resistencia a insulina, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) o hígado graso no alcohólico (NAFLD)

asociados a la obesidad.

Teniendo en cuenta todo esto, se puede apreciar el papel fundamental que

desempeña la inmunidad en la promoción de la salud o la enfermedad metabólica (Slack et

al., 2009; Fujimura et al., 2010) y destacar las estrategias secundarias mediante la utilización

de prebióticos y probióticos, que tratan de contrarrestar estos efectos, regulando el perfil de

citoquinas y adipoquinas, para restablecer los cambios inmuno-metabólicos inducidos por

la dieta.

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Objetivo

92

Evaluar los efectos de una dieta alta en grasas (DAG)

con y sin la administración de Lactobacillus fermentum

CRL1446, Lactobacillus casei CRL431 y Lactococus lactis

CRL1434, sobre parámetros metabólicos, inmunológicos y la

composición de la microbiota intestinal.

Objetivo Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Capitulo II

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Resultados

93

Resultados

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre la ganancia de peso corporal

El peso es uno de los parámetros que se utiliza para definir el índice de masa corporal

(IMC) de un individuo, y con él se establece por definición su estado nutricional. La

ganancia de peso corporal deriva del anterior y se define como el aumento de peso en un

tiempo determinado. Es fundamental en intervenciones dietéticas ya que refleja cambios

macroscópicos inducidos por la dieta sobre un determinado organismo, es una manera

directa y rápida de seguir la evolución de un tratamiento dietario y correlacionarlo con

cambios en el tamaño y funcionalidad de órganos importantes como el tejido adiposo y las

alteraciones inmuno-metabólicas a nivel sistémico. En la Figura 16 se puede observar el

efecto de los diferentes tratamientos dietarios sobre el peso corporal (PC) expresado en

gramos (g) totales al final del período de estudio o como GPC (g final-g inicial/tiempo), a

los 7, 20 y 45 días. Observamos que la dieta DAG indujo un aumento de PC del 18% a los 20

días y del 22% a los 45 días de tratamiento, comparado con el grupo DE. En este caso la GPC

fue significativamente elevada por la administración de una DAG, con un aumento del 60%,

en comparación con el grupo DE. Por otro lado, los tratamientos DAG-CRL1446 y DAG-

CRL1434 mostraron una reducción significativa comparados con el grupo DAG. La

suplementación de la DAG con la cepa CRL1446 (DAG-CRL1446) mostró los valores de GPC

más bajos, siendo significativamente menor al grupo DE a los 7 días. A los 20 días, la GPC

de los grupos DAG-CRL1446 y DAG-CRL1434 no se diferenció significativamente del grupo

control (DE), y a los 45 días, a pesar de seguir induciendo una reducción significativa de la

GPC con respecto al grupo DAG, no se alcanzaron los valores del grupo control DE. La

suplementación de la DAG con la cepa CRL431 solo mostró una reducción significativa

sobre el peso corporal a los 20 días comparado con el grupo DAG. Los resultados indican

un fuerte efecto cepa dependiente sobre el PC y la GPC.


94

Figura 16| Peso corporal (g) (A), y ganancia de peso (g) (B), a los 7, 20 y 45 días después de la intervención dietética proporcionada por una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL1434) y Lactobacilluscasei CRL431 (RC-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre la conversión alimenticia

La GPC, como mencionamos anteriormente, es un parámetro fundamental a tener

en cuenta en modelos nutricionales ya que refleja cambios macroscópicos inducidos por la

dieta sobre un determinado organismo y junto a la ingesta de alimentos nos permite evaluar

la capacidad de un organismo para transformar gramos de alimentos consumidos en

gramos de peso corporal, lo que se conoce como conversión alimenticia (CA) o coeficiente

B

A


95

de conversión alimenticia (CCA). Estos parámetros están estrechamente relacionados a la

estructura de la microbiota intestinal (Raoult, 2008) y son afectados por la dieta. La

modificación del ecosistema intestinal por la administración de BL podría tener influencia

sobre este parámetro, ya sea para contrarrestar o favorecer al efecto de la dieta.

En este trabajo evaluamos la CA con el fin de determinar si la administración de las

BL seleccionadas ejercen efecto sobre este parámetro. En este trabajo, fue determinada la CA

como el cociente entre la GPC (g final-g inicial/tiempo) y la ingesta de alimento (g) de los

animales durante 7 semanas (Figura 17). La DAG mostró un aumento significativo de la CA,

con respecto al grupo DE en todos los tiempos evaluados, incluso a los 7 días de tratamiento

con DAG se observó el mayor aumento para este parámetro, siendo 3 veces mayor que el

grupo DE. La suplementación de DAG con las tres cepas en estudio CRL1446, CRL1434 y

CRL431 indujo una reducción significativa de la CA a lo largo de todo el tiempo que duró

el ensayo. En este sentido las cepas que se destacaron fueron CRL1446 y CRL1434,

demostrando que la suplementación de la DAG con BL tiene influencia en la CA.

Figura 17| Conversión alimenticia (CA) a los 7, 20 y 45 días. La CA es el cociente entre el alimento consumido (g) y la ganancia de peso corporal (g) expresado en porcentaje, después de la intervención dietética proporcionada por una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus caseiCRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 10 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).


96

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre parámetros bioquímicos

Los niveles de azúcares y lípidos en sangre son una medida directa del metabolismo

global de un organismo. Son fundamentalmente afectados por la dieta y nos dan una

medida directa del funcionamiento de hormonas metabólicamente claves como insulina,

glucagón, leptina, etc. Los estados de malnutrición tienden a desregular los niveles normales

o de homeostasis que se correlacionan con un buen estado de salud general. Nuestro

objetivo es determinar estos parámetros alterados por la DAG y analizar los efectos de BL

cuando son administradas conjuntamente con la dieta durante 7 semanas.

Para esto se determinó en plasma los niveles de colesterol total, triglicéridos y

glucosa (Figura 18), por métodos enzimáticos utilizando kits colorimétricos comerciales.

Determinamos que la DAG aumentó significativamente el nivel de glucosa,

colesterol y triglicéridos tanto a los 20 como a los 45 días, comparados con los animales

alimentados con la DE. La suplementación de la DAG con las cepas CRL1446 y CRL1434

indujo la reducción significativa de los tres metabolitos analizados comparados con el grupo

DAG, en ambos tiempos evaluados. La administración de CRL431 disminuyó

significativamente los niveles de glucosa y triglicéridos a los 20 días (Figura 18 A y C) y los

niveles de colesterol total a los 20 y 45 días (Figura 18 B), comparado con el grupo DAG.

Nuestros resultados demuestran el efecto cepa dependiente sobre el metabolismo de

azúcares y lípidos ejercido por BL.


97

Figura 18| Niveles en plasma de glucosa (A), colesterol total (B) y triglicéridos (C), a los 20 y 45 días de la administración de una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus caseiCRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

A

B

C


98

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre los niveles de leptina y citoquinas

En la Figura 19, observamos que la DAG induce un potente efecto adipomodulador,

aumentando significativamente los niveles de leptina en plasma; en 1.37 veces a los 20 días

y en 1.44 veces a los 45 días, comparados con la DE. La suplementación con BL modificó en

todos los casos el efecto de la DAG. La cepa CRL431 indujo un aumento de los niveles de

leptina, que fue significativamente superior al inducido por la DAG, mientras que las cepas

CRL1446 y CRL1434 indujeron una reducción significativa de los valores de la misma,

alcanzando los niveles del grupo control (DE).

Figura 19| Niveles en plasma de leptina a los 20 y 45 días de la administración de una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

También determinamos en plasma, los niveles de citoquinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10,

IL-17A, IFN-γ, TNF-α y MCP-1) a los 45 días de intervención. Solo observamos cambios

significativos en los niveles de IL-10, IL-6, TNF-α y MCP-1 (Figura 20). La DAG aumentó

significativamente los niveles de IL-6, TNF-α y MCP-1, al mismo tiempo que redujo los

niveles de IL-10, demostrando un efecto pro-inflamatorio, comparada con la DE. La

suplementación con las cepas CRL1446 y CRL1434 restableció totalmente los niveles de


99

citoquinas pro-inflamatorias (IL-6, TNF-α y MCP-1) y parcialmente la citoquina anti-

inflamatoria (IL-10) afectadas por la DAG. La suplementación con la cepa CRL431 indujo

aumentos significativos sobre los niveles de IL-6 e IL-10, comparados con el grupo DAG.

Figura 20| Niveles en plasma de IL-10 (A), TNF-α (B, IL-6 (C), MCP-1 (D), IFN (E), IL-2 (F), IL-17 (G) e IL-4 (H), a los 45 días de la administración de una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre el tejido adiposo (TA), hígado y bazo

En este trabajo de Tesis evaluamos el peso de hígado, bazo y tejido adiposo (TA)

(visceral (total), epididimal y mesentérico); pero solo observamos diferencias significativas

en el TA. En el cual, no sólo demostramos cambios en la estructura de las células adiposas

DE DAG

DAG-CRL1446

DAG-CRL1434

DAG-CRL431

A B C

FD E

G H


100

sino también en su funcionalidad. La DAG aumentó significativamente el peso del TA

visceral en 1.7 veces a los 20 días y 1.6 veces a los 45 días con respecto a la DE (Figura 21).

El efecto fue mayor en el tejido adiposo epididimal donde se observó la mayor diferencia

significativa entre ambos grupos (DAG vs DE). La suplementación de la DAG con CRL431

(DAG-CRL431) indujo una reducción significativa sobre el tejido adiposo epididimal, pero

no mostró cambios significativos sobre el TA visceral, comparado con el grupo DAG. Por

otro lado, la suplementación de la DAG con las cepas CRL1446 y CRL1434 indujo una

disminución significativa del TA visceral, mesentérico y epididimal comparado con el

grupo DAG. Mediante cortes histológicos teñidos con hematoxilina-eosina (Figura 23)

observamos cambios en la estructura del tejido TA, tanto en área como en número de

adipocitos entre los diferentes grupos (Figura 22). La DAG aumentó significativamente el

número de adipocitos entre 2000 y 4000 µm2 (adipocitos de mayor tamaño) a los 20 días y

entre 3000 y 8000 µm2 (adipocitos de mayor tamaño) a los 45 días, y redujo el número de

adipocitos de menor tamaño (entre 1000-2000 µm2) con respecto a la DE tanto a los 20 como

45 días. La suplementación de la DAG con las cepas CRL1446 y CRL1434 indujo una

reducción significativa de adipocitos medianos (1000-2000 µm2) y de gran tamaño (2000-

4000 µm2) a los 20 días, al mismo tiempo que aumentaron significativamente los adipocitos

pequeños (500-1000 µm2) comparados con el grupo DAG (Figura 22 A). La cepa CRL431

incremento los adipocitos medianos (1000-2000 µm2) y redujo significativamente los

adipocitos de gran tamaño (2000-4000 µm2) a pesar que el efecto no fue tan marcado como

el de las otras cepas (CRL1446 y CRL1434). A los 45 días (Figura 22 B), sola la

suplementación con la cepa CRL1446, mantuvo aumentado los adipocitos pequeños (1000-

2000 µm2) con la cual observamos un incremento muy marcado de adipocitos pequeños

(000 µm2) y una reducción casi total de adipocitos de mayor tamaño e intermedios (entre

1000-2000 y ≥2000 µm2).


101

Figura 21| Peso del tejido adiposo visceral (A), mesentérico (B) y epididimal (C), cada 100 gramos de peso corporal (%) a los 20 y 45 días, de ratones alimentados con una dieta estándar (DE) o una dieta alta en grasas (DAG), con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

A

B

C


102

Figura 22| Número de adipocitos en función del área a los 20 días (A) y 45 días (B), de ratones alimentados con una dieta estándar (DE) o con una dieta alta en grasas (DAG), con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05). Los adipocitos del tejido adiposo epididimal fueron agrupados por rangos de tamaño como sigue: áreas < 500; 500-1000; 1.000-2.000; y 2.000-4.000 µm2.

f f 0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0-500 500-1000 1000-2000 2000-4000 4000-8000

Num

ero

de a

dipo

citos

Área (µm2)

DE

DAG

DAG-CRL1446

DAG-CRL1434

DAG-CRL431

a a

b

ee

c

d

bb

a a

c

eeee e

f e

fe

f f

cc c

c

0

50

100

150

200

250

300

500-1000 1000-2000 2000-3000 3000-4000 4000-8000

Num

ero

de a

dipo

citos

Área (µm2)

DE

DAG

DAG-CRL1446

DAG-CRL1434

DAG-CRL431a

a

cc c

a

bb

cc

b

c c

bc

a

a

cc

cc

B

A


103

Figura 23|A

dipocitos a los 20 días (20) y45 días (45),de ratones alim

entados con una dieta estándar (DE) o con una restricción calórica del 25%

(RC

), con y sin la suplem

entación de BL: Lactobacillus fermentum

CRL1446 (R

C-C

RL1446), Lactococus lactis C

RL1434 (RC

-CR

L1434) y Lactobacilluscasei C

RL431 (RC

-C

RL431) en una dosis de 1x10

8 UFC

/mL. Las im

agenes fueron tomadas con un m

icroscopio Carl Zeiss - A

xio Scope.A1, con un objetivo de 40x, con luz visible,

y las fueron analizadas con el shoftware C

arl Zeiss – Axio V

ision reléase 4.8.


104

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre la funcionalidad de adipocitos ex vivo.

Además de evaluar la estructura del TA de los animales con diferentes tratamientos

dietarios, también evaluamos la funcionalidad de adipocitos ex vivo mediante la producción

de leptina (Figura 24) y la funcionalidad de macrófagos peritoneales mediante la producción

de citoquinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) y MCP-1 (Figura 25).

Los adipocitos extraídos de los diferentes grupos mostraron un perfil diferencial de

producción de leptina. La DAG, si bien, no afectó la producción basal (DMEM, sobrenadante

sin estímulo) de esta hormona con respecto al grupo DE, incrementó la respuesta al estímulo

con LPS, mostrando mayores niveles de producción de leptina en ambos tiempos (20 y 45

días). La suplementación de la dieta DAG con las 3 cepas en estudio redujo los niveles de

leptina en los adipocitos estimulados con LPS, esta reducción fue significativa cuando se

suplementó la dieta con CRL1446 y CRL1434, comparados con el grupo DAG, mientras que

la cepa CRL431 no mostró diferencias significativas.

Figura 24| Niveles de leptina producidos por adipocitos ex vivo con o sin estímulo de LPS, a los 20 (A) y 45 (B) días. Los adipocitos fueron extraídos del TA epididimal de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

A B


105

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre la funcionalidad de macrófagos peritoneales ex vivo.

Evaluamos además, la funcionalidad de macrófagos peritoneales ex vivo mediante

la producción citoquinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) y MCP-1) (Figura 25). Observamos que la

DAG redujo la producción de IL-10 (Figura 25D) a los 20 y 45 días y aumentó TNF-α, IL-6

y MCP-1 (citoquinas y quimoquina pro-inflamatorias) a los 45 días, cuando los macrófagos

fueron estimulados con LPS, con respecto a los macrófagos del grupo DE. Por otro lado, no

observamos diferencias significativas en la producción basal (DMEM, sobrenadante sin

estímulo) de citoquinas por los macrófagos de los diferentes grupos, salvo para los valores

de TNF-α (Figura 25A) y MCP-1 (Figura 25C) que estuvieron aumentados en los macrófagos

del grupo DAG, comparados con el grupo DE. La administración de las BL restableció los

niveles de IL-10 (Figura 25D) a valores similares al grupo DE, cuando los macrófagos eran

desafiados (LPS), destacándose la cepa CRL1434 que mostró los niveles más elevados. Por

otro lado, la administración de CRL1446 y CRL1434 indujo una reducción significativa de

los niveles de citoquinas y quimoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6 y MCP-1)

aumentados por la DAG. En cuanto a los valores obtenidos para la producción de MCP-1,

la cepa CRL431 no se diferenció significativamente del grupo DAG (Figura 25 C).

Demostrando así un efecto inmunomodulador diferencial de las cepas sobre macrófagos

peritoneales.


106

Figura 25| Niveles de TNF-α (A), IL-6 (B), MCP-1 (C) e IL-10 (D), producidos por macrófagos peritoneales con o sin estimulo de LPS a los 20 y 45 días, de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

B20 Días 45 Días

A

B

C

D


107

Efecto de la DAG y la administración de BL sobre la composición de la microbiota intestinal

Las comunidades microbianas presentes en las muestras de heces de ratones (n = 6)

de los diferentes grupos se analizaron por secuenciación masiva y paralela de amplicones

de DNAr 16S. La Tabla 4 presenta los índices Sobs, Chao, Shannon and Simpson de alfa

diversidad. La riqueza observada (análisis de rarefacción) demostró que la DAG indujo una

gran reducción de especies microbianas intestinales teóricas cuando se compraron con

sujetos alimentados con DE y de otros grupos con DAG suplementados con BL (Sobs).

Curiosamente, la condición DAG parece mantener la diversidad en términos de

homogeneidad de las comunidades, ya que mantuvo constante el índice de Shannon con el

paso del tiempo (20 y 45 días). Mientras que la suplementación de la dieta DAG con las tres

cepas permitió aumentar la diversidad en términos de homogeneidad ya que incrementó el

índice de Shannon con el paso del tiempo. Finalmente, la suplementación de DAG con las

cepas CRL1446 y CRL431 permitió una ganancia de diversidad con el paso del tiempo (20 y

45 días) ya que redujeron el índice de Simpson a menos de la mitad.

Tabla 4| Índices de alfa diversidad de las comunidades microbianas analizadas.

Comunidades microbianas analizadas en heces de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108

UFC/mL. (Sobs, Chao, Shannon y Simpson).

Muestras Distancia Coeficientes de alfa diversidad

Sobs Chao Shannon Simpson DE (20 días) 0,03 1374 10684,8871 3,677733 0,083645

DE (45 días) 0,03 1400 8550,039474 3,477148 0,196255

DAG (20 días) 0,03 1165 11516,06977 3,464834 0,079425

DAG (45 días) 0,03 1111 7788,684211 3,618846 0,074245

DAG-Lf1446 (20 días) 0,03 1288 11718,67925 3,154184 0,145135

DAG-Lf1446 (45 días) 0,03 1464 10134 4,219774 0,057941

DAG-Ll1434 (20 días) 0,03 1344 9621,514286 3,952231 0,055496

DAG-Ll1434 (45 días) 0,03 1421 12393,96667 4,014881 0,058305

DAG-Lc431 (20 días) 0,03 1250 12076,4 3,250251 0,105967

DAG-Lc431(45 días) 0,03 1399 9862,085714 4,338758 0,038472


108

Nuestros resultados demuestran algunos cambios importantes en la composición

de la microbiota intestinal a nivel de phylum (Figura 26) y género (Figura 27) entre nuestros

grupos de estudio. La DAG cambió la abundancia relativa de ciertos grupos de bacterias en

las muestras fecales de los ratones. En primer lugar, indujo un aumento del phylum

Proteobacteria (phylum relacionado con bacterias potencialmente patógenas) a los 20 días

comparado con el grupo DE. Por otro lado, mostró un aumento muy marcado del phylum

Firmicutes llegando a representar casi el 90% del total de la microbiota del grupo DAG a los

45 días, este aumento permitió que el grupo DAG presente los valores del índice F/B más

elevados de todos los grupos de estudio al final del experimento. Otro phylum afectado por

la DAG fue Bacteroidetes, el cual se redujo a la mitad cuando se comparó con el grupo DE a

los 45 días. Finalmente observamos un leve incremento del phylum Actinobacteria a los 45

días inducido por la DAG, comparado con el grupo DE. A pesar de aumentar el phylum

Firmicutes, la DAG indujo una disminución del género Lactobacillus (género correlacionado

con bacterias potencialmente probióticas) con el paso del tiempo (entre los 20 y los 45 días).

También observamos que el incremento del phylum Actinobacteria se correspondió a un

aumento del género Bifidobacterium a los 45 días de tratamiento, inducido por la DAG.

Finalmente, otros géneros que mostraron aumento por la DAG respecto al grupo DE fueron,

Roseburia, Ruminococcus, Lachnospiraceae y Clostridium XVIII, géneros sacarolíticos

relacionados con la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y el metabolismo

lipídico (Devillard et al., 2007). La suplementación de la DAG con las 3 cepas en estudio

(CRL1446, CRL1434 y CRL431) indujo una reducción del phylum Firmicutes y un aumento

de Bacteroidetes, permitiendo una reducción del índice F/B (Figura 28) comparados con el

grupo DAG. A nivel de género la administración de las 3 cepas incrementó principalmente

los géneros Alistipes, Dorea, Barnesiella y Clostridium XIVa, además del aumento del género

Lactobacillus inducido sólo por la cepa CRL1446, que se mantuvo en el tiempo a diferencia

de los otros grupos que mostraron una disminución de este género con el paso del tiempo

(entre los 20 y 45 días).


109

Figura 25| Abundancia relativa (%) a nivel de phylum, en heces de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones. Se presentan los 5 principales phylum que representan más del 99% de la MI.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

DE (día 20)

DE (día 45)

DAG (día 20)

DAG (día 45)

DAG-CRL1446 (día 20)






Abundancia relativa

Firmicutes

TM7

Proteobacteria

Bacteroidetes

Actinobacteria

Phylum


110

Figura 26| Abundancia relativa (%) a nivel de géneros, en heces de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

DE (día 20)

DE (día 45)

DAG (día 20)

DAG (día 45)







Abundancia relativa

TM7LactobacillusBifidobacteriumAlistipesDoreaClostridium XlVaRoseburiaBarnesiellaDesulfovibrioRuminococcusPseudoflavonifractorLachnospiraceaHelicobacterClostridium IVClostridium XVIIIBacteroidesFlavonifractorOscillibacterSphingomonasEnterorhabdusAllobaculumBlautiaFaecalibacteriumStreptococcusOdoribacterAnaerotruncusMucispirillumParabacteroidesGemmigerAnaerostipesErysipelotrichaceaeDialisterButyricicoccus

Género


111

Figura 27| Índice Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) para los diferentes grupos de ratones alimentados con una dieta estándar (DE), o una dieta alta en grasas (DAG) con y sin la suplementación de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (DAG-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (DAG-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (DAG-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones.

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Discusión

112

Discusión

En este capítulo evaluamos los efectos de una DAG con y sin la administración de

diferentes BL adipomoduladoras, L. fermentum CRL1446, L. lactis CRL1434 y L. casei CRL431

sobre parámetros metabólicos, inmunológicos y la estructura de la microbiota intestinal.

Utilizamos un modelo de dieta alta en grasas (35% de grasas) (DAG), donde el 60% de las

calorías es aportado por los lípidos. Este es un modelo ampliamente utilizado para inducir

obesidad en roedores, que imita los trastornos metabólicos asociados a la obesidad humana

y permite verlos en cortos períodos de tiempo, de 4 a 7 semanas (Wang and Liao, 2012). Con

este modelo inducimos un aumento del peso corporal (18 a 22 %) y de la ganancia de peso

(GP) (60%) comparado con el grupo control DE. Estos cambios se asociaron a alteraciones

bioquímicas, inmunológicas y de la estructura de la microbiota intestinal (MI), cambios que

han sido reportados por varios autores (Núñez et al., 2013)(Cano et al., 2013b; Núñez et al.,

2014).

Las determinaciones se realizaron en dos períodos de tiempo, 20 y 45 días, con el fin

de establecer los efectos del tiempo, además del de la dieta y de la suplementación con BL,

sobre los parámetros evaluados.

La administración de una DAG durante 45 días, como ya mencionamos indujo un

aumento del peso corporal comparado con la DE, este efecto se asoció a un marcado

aumento de la conversión alimenticia (CA), con respecto al grupo DE. En este sentido no

solo la DAG mostró efectos sobre la GP y la CA sino también la suplementación con BL. Dos

de las cepas, CRL1446 y CRL1434, indujeron una disminución significativa de estos

parámetros (GP y CA), manteniendo valores similares al grupo control DE, mientras que la

suplementación con la cepa CRL431 a pesar que redujo levemente la CA, no mostró

diferencias significativas sobre la GP con respecto al grupo DAG. De acuerdo con esto,

algunos autores reportaron un aumento de la GP inducido por esta cepa, en un modelo de

OID de 60 días (Núñez et al., 2013). Del mismo modo, Andersson et al. (Andersson et al.,

2010) también reportaron un aumento de peso en el grupo obeso suplementado con el

probiotico Lactobacillus plantarum DSM 15313. Por otra parte, Sato et al., (Sato et al., 2008b)


113

mostraron que la administración de Lactobacillus gasseri SBT2055, en un modelo murino de

sobrepeso, redujo el tamaño de los adipocitos mesentéricos. Yoo et al., (Yoo et al., 2013)

también reportaron efectos beneficiosos de la combinación dos cepas probioticas (L.

plantarum y L. curvatus), la cual redujo la acumulación de grasa en hígado, TA y previno la

obesidad inducida por la dieta. Esto, junto a nuestros resultados, demuestra que el efecto

modulador sobre el peso corporal es cepa dependiente, lo que sugiere modificaciones sobre

el metabolismo energético del hospedador y/o sobre un potencial de captación de energía

diferente inducido por cada cepa.

Analizando el peso del TA y los cortes histológicos (hematoxilina-eosina), observamos

una hipertrofia, incremento del peso (TA visceral, mesentérico y epididimal), acompañado

con un mayor número de adipocitos de gran tamaño (TA epididimal), inducido por la DAG,

comparado con la DE. Está establecido que el aumento de tamaño del TA está asociado a

cambios en el perfil de adipoquinas (Skurk et al., 2007), y la desregulación metabólica (Sam

and Mazzone, 2014b), lo que contribuye al desarrollo de enfermedades crónicas ligadas al

envejecimiento como la obesidad, la diabetes tipo 2 y el cáncer (Rose et al., 2004). En

consecuencia, en nuestro caso, la hipertrofia del TA inducida por la DAG, se correlaciono

con aumentos de la producción de adipoquinas pro-inflamatorias como leptina, IL-6, TNF-

α y MCP-1, lo cual podrían ser uno de los principales mecanismos por los que esta dieta

favorece los desequilibrios inmuno-metabólicos asociados con la obesidad (Fasshauer and

Blüher, 2015; Sam and Mazzone, 2014). Cuando suplementamos la DAG con las diferentes

BL, observamos que solo dos cepas, CRL1446 y CRL1434, revirtieron estas alteraciones,

contrarrestando completamente la expansión del TA, con una reducción del peso del tejido

y del área de los adipocitos que lo componen, comparados con el grupo DAG. En

consecuencia, esto se asoció a una reducción significativa de los niveles plasmáticos de

leptina, una adipoquina clave en el desarrollo de la obesidad inducida por la dieta. En este

sentido, observamos que la DAG indujo un aumento significativo de los niveles plasmáticos

de esta hormona, reflejando un estado de hiperleptinemia, que ya fue reportado por varios

autores, que además demostraron la capacidad de ciertos macronutrientes de la dieta


114

(específicamente lípidos), para inducir leptinoresistencia (Scarpace and Zhang, 2009;

Shapiro et al., 2008; Vasselli, 2012).

Recientemente, Cheng et al. reportaron la capacidad del ácido palmítico (AP, C16:0,

presente en la DAG) para inducir resistencia central (hipotálamo) a leptina y demostraron

que concentraciones elevadas de AP, sistémicas o centrales, pueden inducir respuesta pro-

inflamatoria y resistencia central a la leptina, asociada con trastornos de la homeostasis

energética en hígado y alteraciones del metabolismo lipídico (Cheng et al., 2015). La

suplementación de la DAG con las diferentes BL adipomoduladora, modifico los niveles de

leptina de forma in vivo. Las cepas CRL1446 y CRL1434 indujeron una reducción de los

niveles de la hormona, alcanzando niveles similares al control DE. Esta reducción de los

niveles de leptina se correlacionó con reducción de la GP, la CA, los niveles de glucosa y

lípidos en plasma y una reducción del tamaño del TA, demostrando el potencial

adipomodulador in vivo para estas cepas. Por otro lado, la suplementación con la cepa

CRL431 indujo un aumento de los niveles de leptina comparado con el grupo DAG, lo cual

explicaría en parte los efectos contrarios de esta cepa sobre alguno de los parámetros

evaluados. En este aspecto, hemos reportado un incremento de los niveles de leptina

inducidos por esta cepa en un modelo de re-nutrición (Fabersani E. et al. 2014).

Cuando analizamos los niveles de citoquinas en plasma, acoplado al aumento de

leptina, detectamos aumentos de dos citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IL-6, una

quimoquina (MCP-1) y la reducción de una citoquina reguladora como IL-10, por parte de

la DAG. Demostrando un estado inflamatorio crónico característico de la obesidad. Este

estado pro-inflamatori inducido por la DAG también fue reportado por otros autores tanto

en animales como en humanos (Novotny Núñez et al., 2015) y se establecio un vincula entre

el desarrollo de obesidad y la resistencia a la insulina en la diabetes tipo II (Maachi et al.,

2004; McArdle et al., 2013). En este caso, las dos cepas que redujeron los niveles de leptina

hicieron lo propio con los niveles de TNF-α, IL-6 y MCP-1, asociado principalmente a un

incremento plasmático de IL-10. Esto pone de manifiesto la capacidad inmuno-moduladora

in vivo de estas cepas, principalmente por mantener los niveles de IL-10 similares al grupo


115

control DE. Mientras que la suplementación con la cepa CRL431 a pesar de incrementar los

niveles de IL-10, no pudo revertir los incrementos de las citoquinas pro-inflatorias inducidos

por la DAG, quizás por mantener elevados los niveles de leptina.

En este contexto, fue reportado por varios autores una relación negativa entre la

obesidad y los niveles de IL-10 (Blüher et al., 2005; Jung et al., 2008), y en algunos casos esta

citoquina se correlaciono positivamente con la homeostasis energética y negativamente con

la resistencia a la insulina. Recientemente, Nakata et al., (Nakata et al., 2016), informaron

que la sobre expresión de IL-10 en ratones deficientes de leptina, redujo la hiperfagia, la

adiposidad, el aumento de TNF-α y la resistencia a la insulina. Con lo cual consideramos

que los aumentos de IL-10 y la reducción de los niveles de leptina inducidos por las cepas

CRL1446 y CRL1434 podrían ser los principales mecanismos por los cuales ejercen sus

efectos antiobesogenicos.

Los niveles plasmáticos de colesterol elevados son comúnmente asociados con la

obesidad y la dislipidemia que se desarrollan progresivamente en modelos de obesidad

inducida por la dieta (Do et al., 2011). En este caso observamos que los niveles de colesterol

total (CT) aumentaron con la administración de la DAG, y que la suplementación con BL

redujo los niveles de este lípido en plasma, con lo cual sugerimos que las 3 cepas evaluadas

tienen un efecto hipocolesterolémico sobre el huésped, destacándose las cepas CRL1446 y

CRL1434 que mostraron los mayores efectos. Hemos reportado un efecto

hipocolesterolémico de la cepa CRL1446 en un modelo murino de restricción calórica (RC)

(Russo et al., 2016), como así también en ratones alimentados con una dieta estándar, que

consumieron un queso desarrollado con esta cepa (Abeijón Mukdsi et al., 2013). Estos datos

sumados a los reportados en este capítulo confirman la capacidad de CRL1446 para reducir

los niveles de colesterol independientemente de la dieta administrada. Bhathena et al.

(Bhathena et al., 2009), informaron que la cepa Lactobacillus fermentum LF11976 productora

de feruloil esterasas (microencapsulada), disminuyo los lípidos séricos en hámsters

hipercolesterolémicos. El ácido ferulico presenta propiedades hipocolesterolémicas ya que

puede inhibir la hidroximetilglutaril CoA reductasa, enzima limitante de la velocidad en la


116

biosíntesis del colesterol y de la colesterol aciltransferasa, enzima que esterifica el colesterol

en los tejidos (principalmente en hígado), o mediante el aumento de la excreción de esteroles

ácidos (Balasubashini et al., 2003). Teniendo en cuenta que la cepa CRL1446 ha demostrado

tener una elevada actividad feruloil esterasa tanto in vivo como in vitro (Mukdsi et al., 2012),

este podría ser el mecanismo de acción por el cual ejerce su efecto hipocolesterolémico. Por

otro lado otros autores han reportado la capacidad de la microbiota intestinal para influir

sobre el metabolismo del colesterol tanto en animales como en humanos y las diferentes vías

que pueden utilizarse para su síntesis y degradación (Gérard, 2013). De esta manera, las BL

administradas al modular la estructura de la microbiota intestinal también podrían ejercer

sus efectos sobre los niveles de colesterol de forma indirecta, a través de la MI, afectando la

expresión y síntesis de genes relacionados al metabolismo lipídico. Yoo et al. (Yoo et al.,

2013) reportaron un aumento de los niveles plasmáticos y hepáticos de colesterol, inducidos

por una dieta rica en grasas, y la reducción de este lípido por la administración de L.

plantarum y L. curvatus. Núñez et al., también reportaron una reducción de los niveles de

colesterol por la cepa CRL431 en un modelo de obesidad inducido por la dieta. Nuestros

resultados, apoyan estos estudios realizados anteriormente (Núñez et al., 2014), a pesar de

que el mecanismo de acción no está completamente dilucidado. Finalmente, la cepa CRL

1434 es una cepa con gran capacidad inmunomoduladora evaluada in vitro, productora de

CLA, que no había sido evaluada previamente en modelos de obesidad in vivo. En este caso

observamos un efecto hipocolesterolemico, que podría estar asociado a la producción de

este compuesto bioactivo (CLA), para el cual se reportó la capacidad de reducir los niveles

plasmáticos de colesterol (Wilson et al., 2006).

En cuanto al metabolismo de glucosa, observamos que la DAG aumentó los niveles

plasmáticos de este azúcar con respecto a la DE. En este sentido, Cani et al. reportaron ya

en el 2007, la alteración de la composición de la MI y la permeabilidad inducida por la DAG,

la cual induce una endotoxemia metabolica que altera la respuesta inflamatoria y

desencadena hiperglucemia y resistencia a la insulina (Cani et al., 2007c). En conjunto, estos

datos establecen la fuerte relación existente entre la MI, la inflamación y las perturbaciones

metabólicas. Rabot et al. demostraron un menor consumo de calorías y un aumento de la


117

excreción de lípidos en ratones libres de gérmenes alimentados con una dieta alta en grasas,

lo que contribuyó a la resistencia del desarrollo de obesidad y revelo que la sensibilidad a

la insulina y el metabolismo del colesterol son objetivos metabólicos influenciados por la MI

(Rabot et al., 2010). Entre estas acciones regulatorias, la influencia de los microbios

intestinales sobre el metabolismo energético es de particular interés, ya que se ha propuesto

como una fuerza impulsora en la patogénesis de las enfermedades metabólicas,

especialmente en obesidad. La suplementación con las tres cepas (CRL1446, CRL1434 y

CRL431) mostró una reducción con respecto al grupo DAG sobre los niveles plasmáticos de

glucosa. Esto demuestra un efecto de las cepas sobre el metabolismo de azucares, el cual

podría estar asociado por un lado al perfil inmunomodulador (reducción de citoquinas pro-

inflamatorias y resistencia a insulina) y por otro a los cambios ejercidos sobre la microbiota

intestinal. Nuestros resultados muestran principalmente una marcada reducción del phylum

Firmicutes y del índice F/B por la suplementación de la DAG con las tres BL en estudio.

Teniendo en cuenta que las especies pertenecientes al phylum Firmicutes han demostrado

una gran capacidad para degradar polisacáridos de la dieta y favorecer la absorción de

azúcares y otros metabolitos (Krajmalnik-Brown et al., 2012; Flint et al., 2012) maximizando

así el suministro de energía proporcionada por la dieta (Jumpertz et al., 2011). En este

sentido varios autores han reportado la influencia de la MI sobre la sensibilidad a la insulina

y tolerancia a la glucosa, esto al parecer asociado a los niveles de citoquinas proinflamatorias

como TNF-α e IL-6 en plasma (Bäckhed et al., 2007; Rabot et al., 2010). Con lo cual

demostramos el efecto hipoglucémico de las tres cepas en estudio, por la modulación del

perfil inmunológico (CRL1446 y CRL1434) y la estructura de la MI (CRL1446, CRL1434 y

CRL431).

Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS) están

revolucionando nuestra evaluación y comprensión de las comunidades microbianas y

permiten obtener una cobertura mucho más completa de las comunidades microbianas. Los

cambios en la ganancia de peso corporal están muy asociados a la estructura de la

microbiota intestinal y al coeficiente de conversión alimenticia (CA), debido a que uno de


118

los principales parámetros afectados por la microbiota es la obtención de energía a partir de

la dieta (Bäckhed et al., 2004; Jumpertz et al., 2011b). Utilizando métodos de secuenciación

de alto rendimiento para estudiar los cambios en las comunidades microbianas intestinales,

encontramos que la microbiota intestinal se vio profundamente afectada por la DAG, esta

permitió un incremento del índice F/B con respecto a la DE (Figura 27), mediante un

aumento de miembros Firmicutes, lo que está de acuerdo a lo reportado por otros autores

que utilizaron modelos de obesidad genética (ob/ob) o inducida por la dieta (OID) en

roedores y humanos (Ley et al., 2005; Ley et al., 2006; Turnbaugh et al., 2008b) y han

correlacionado al Filo Firmicutes con la ganancia de peso y al Filo Bacteroidetes con la pérdida

del mismo. Este índice está muy relacionado a la obtención de energía por parte del huésped

y se ha establecido que la microbiota de individuos obesos tiene mayor capacidad de

extracción de energía y deposición de grasa corporal (Bäckhed et al., 2004a; Cox and Blaser,

2013b; Delzenne et al., 2015; Ussar et al., 2015). La suplementación de la DAG con las tres

cepas en estudio, redujo la abundancia relativa de Firmicutes y aumentó la de Bacteroidetes,

reduciendo el índice F/B por debajo del grupo DE, efecto que se mantuvo en el tiempo, esto

en parte explica la reducción de la ganancia de peso corporal observada en los grupos DAG

suplementados con las BL.

Analizando la composición de la MI a nivel de género, la DAG promovió la abundancia de

géneros como Bifidobacterium, Roseburia, Ruminococcus, Lachnospiraceae y Clostridium XVIII,

géneros sacaroliticos relacionados con la producción de ácidos grasos de cadena corta

(AGCC) en el intestino, metabolitos que son absorbidos y trasportados hasta diferentes

tejidos representando un aporte extra de energía y pudiendo contribuir con la inflamación

crónica de bajo grado asociada a la obesidad en un contexto pro-inflamatorio (Park et al.,

2015; Schwiertz et al., 2010), a pesar que lo datos al respecto son muy controvertidos. Otros

autores destacan la participación de estos géneros en el metabolismo lipídico a pesar que en

su caso la abundancia de algunos de ellos (Roseburia y Lachnospiraceae) se encontraban

reducidos al utilizar una dieta occidental rica en grasa (Druart et al., 2015). Más estudios

relacionados al metabolismo lipídico de la microbiota son necesarios para aclarar estas


119

cuestiones. En este sentido, nuestros resultados mostraron que la suplementación de la DAG

con BL mostró una mayor abundancia de géneros como Alistipes, Dorea, Prevotella,

Pseudoflavonifractor, Barnesiella y Clostridium XIVa. En este sentido Jiang et al. (Jiang et al.,

2015) informaron un aumento de la abundancia relativa de géneros como Alistipes y

Prevotella, en pacientes delgados sanos comparados con individuos con hígado

graso no alcohólico. De acuerdo con esto Louis et al., (Louis et al., 2016), mostraron que los

pacientes obesos, que tuvieron éxito en la pérdida de peso constantemente durante dos

años, al inicio del estudio tenían una MI enriquecida en géneros Alistipes y

Pseudoflavonifractor, en comparación con los pacientes que tuvieron menos éxito en la

reducción de peso. De esta manera sugerimos que la suplementación de la DAG con BL,

puede contrarrestar los efectos inducidos por la dieta, mediante modificación de la MI,

favoreciendo un enriquecimiento de géneros que se correlacionaron positivamente con

individuos delgados, sanos que tuvieron una mayor pérdida de peso sostenible en el

tiempo, además de reducir el índice F/B y poder afectar la extracción de energía por larte

del hospedador. De esta manera aportamos datos que refuerzan la idea que una misma dieta

puede impactar de manera diferente según la composición de la microbiota intestinal

(Power et al., 2014).

Observamos también que la suplementación de la DAG con la cepa CRL1446 fue el único

tratamiento dietario que aumentó la abundancia del genero Lactobacillus, y lo mantuvo

constante en el tiempo. Este género se correlaciona con efectos benéficos sobre el huésped

(Bernardeau et al., 2006; Zareie et al., 2006) y positivamente con la vida media (Zhang et al.,

2013). En este contexto, se estableció que un aumento de este género puede inducir una

reducción de filotipos asociados con patógenos como TM7 y Proteobacteria, debido a la

capacidad conocida de los Lactobacillus, para inhibir la adhesión de patógenos a la pared

intestinal y proteger contra patógenos por alteración de la barrera intestinal (Bernardeau et

al., 2006; Zareie et al., 2006). En este sentido la DAG prácticamente que eliminó la bundancia

relativa de este género, con lo cual se le atribuye otro efecto beneficioso a la suplementación

de la DAG con la cepa CRL1446.


120

Figura 28| Principales efectos ejercidos por la administración de BL, Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-CRL431), sobre la ganancia de peso corporal (GPC), la microbiota intestinal (MI), el tejido adiposo (TA), metabolismo (ME) y el sistema inmune (SI), en un modelo de obesidad inducido por una dieta alta en grasas (DAG). Las flechas hacia arriba o hacia abajo representan aumento o reducción de un parámetro, respectivamente, y los colores representan a cada cepa, CRL1446 (verde), CRL1434 (naranja) y CRL431 (azul).

Capitulo II Efecto de BL adipomoduladoras en obesidad Conclusiones

121

Conclusiones Este capítulo nos permitió determinar que el tipo de dieta, el tiempo de

tratamiento y la suplementación con BL, producen cambios en la estructura de MI,

parámetros metabólicos e inmunológicos. En general, los resultados muestran que la

suplementación de la DAG con BL puede modular los efectos ejercidos por la dieta,

afectando el peso corporal, con un efecto cepa dependiente. Estos efectos de las BL

estuvieron asociados con cambios sobre tres sistemas principales, la composición de

la MI, la estructura del TA y el perfil de adipoquinas. Globalmente observamos que

la suplementación de la DAG con BL fue capaz de enriquecer géneros relacionados

con la vida media, la pérdida de peso, la salud intestinal y la reducción de grasa

corporal, comparado con el grupo DAG, y no se observaron grandes diferencias de

composición de la MI entre los grupos suplementados. Con respecto a la estructura

del TA, y el perfil de adoquinas determinamos diferencias entre las cepas, mientras

CRL1446 y CRL1434 redujeron los niveles de leptina, y citoquinas pro-inflamatorias,

CRL431 aumentó los niveles de esta hormona y no mostró grandes cambios sobre el

perfil de citoquinas con respecto a la DAG. Las cepas que redujeron los niveles de

leptina se asociaron con mayores efectos hipolipemiantes e hipoglucemiantes. En este

sentido se destacó la cepa L. fermentum CRL1446, con lo cual podría postularse como

un agente terapéutico complementario para alteraciones metabólicas como

hipercolesterolemia, hiperglucemia e hiperleptinemia asociadas con la obesidad

inducida por DAG. Asi mismo, la cepa CRL1434 mostró un comportamiento similar

a la cepa CRL1446, con la diferencia que este microorganismo posee mayor capacidad

inmunomoduladora in vivo (IL-10) y menor efecto modulador de la MI. Este trabajo

demuestra la gran influencia de la administración de cepas adipomoduladoras

específicas sobre el perfil general de adipoquinas, la MI y su impacto sobre la salud

general del hospedador.

122

Capítulo III

Restricción calórica, un nuevo concepto

Efecto de bacterias lácticas adipomoduladoras en un modelo murino de restricción calórica

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Introducción

123

Introducción

La restricción calórica (RC) se define como una reducción en la ingesta de energía por debajo

de la cantidad de calorías que se consume ad libitum, ≥ 10% en estudios en seres humanos y

por lo general ≥ 20% en roedores (Bales and Kraus, 2013). La RC se puede explicar, a partir

del punto de vista de la evolución, como un mecanismo de compensación que está

involucrado en las respuestas metabólicas y neuroendócrinas que los organismos vivos

utilizan para adaptarse a períodos de ausencia de alimentos (Holliday, 1989).

El protocolo general que se utiliza para llevar a cabo experimentos de RC en modelos

animales es alimentar ad libitum a un grupo de animales (grupo control), y otro grupo con

un porcentaje menor a la ración diaria del grupo control, de esta manera los animales son

sometidos a una reducción en la ingesta calórica total (Masoro, 2009). Es importante destacar

que la RC ha sido considerada como el único régimen experimental que puede alargar la

vida útil efectiva en diversos modelos animales, mediante la reducción de enfermedades

relacionadas con el envejecimiento, pero el mecanismo por el cual ejerce su efecto sigue

siendo controvertido (Zhang et al., 2013).

El objetivo principal de individuos con sobrepeso y obesidad en riesgo es una pérdida de

peso moderada y sostenible en el tiempo, que se asocie a mejoras de múltiples factores

metabólicos y hormonales implicados en la patogénesis de la enfermedad, lo cual ya se

consigue con una pérdida de peso del 5% al 10% (Wing et al., 2011). Los enfoques

farmacológicos para la reducción de peso corporal (PC) tienen, en la actualidad, una pobre

eficacia a largo plazo, con lo cual, las estrategias como la restricción calórica (RC), programas

de ejercicio, o la cirugía bariátrica son de gran interés.

Por otro lado, se ha demostrado que la microbiota intestinal desempeña un papel

fundamental en la salud del huésped, y uno de los principales factores que afecta su

composición es la dieta. En cuanto a lo reportado sobre microbiota intestinal y RC, la misma

favorece filotipos que se correlacionan positivamente con la “esperanza de vida” o

longevidad, como ser especies pertenecientes al género Lactobacillus (Zhang et al., 2013),

además se ha informado la reducción de la carga de antígenos como lipopolisacárido (LPS)

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Introducción

124

o la proteína de unión a lipopolisacárido (LBP). La microbiota intestinal desarrolla una

actividad metabólica intensa que permite mejorar la biodisponibilidad de nutrientes y la

degradación de compuestos no digeribles (a través de enzimas microbianas o la

estimulación de las actividades endógenas), el suministro de nuevos nutrientes, (como

AGCC o vitaminas del complejo B), la eliminación de anti-nutrientes nocivos y otros

compuestos. Estas funciones metabólicas tienen un impacto importante en la salud y el

estado nutricional del huésped; sin embargo, dependen de la composición de la microbiota

intestinal y sus complejas interacciones con la dieta y el genoma del individuo (Cani, 2014,

Ojeda et al. 2015, Druart et al. 2015, Sanchez, Panahi, and Tremblay 2015).

La modulación de la microbiota intestinal a través de la dieta o la administración de

microrganismos benéficos es una estrategia interesante para aliviar las alteraciones

ocasionadas por trastornos nutricionales. Además de la RC, la administración de bacterias

adipomoduladoras, capaces de alterar tanto la composición como la estructura de la

microbiota intestinal y del tejido adiposo (TA), podrían ser una opción prometedora e

incluso la combinación de ambas estrategias (RC+BL) podrían sinergizar el efecto que éstas

tienen por separado. Hasta la fecha, no hay información acerca del efecto de BL

adipomoduladoras en modelos animales de RC.

En este trabajo de tesis utilizamos tres cepas previamente seleccionadas in vitro por su

capacidad adipomoduladora y evaluamos su efecto en un modelo experimental de RC en

ratón. Estas tres cepas mostraron características inmunomoduladoras y adipomoduladoras

que se suman a las características probióticas que ya habían sido reportadas; como ser

actividad feruloil esterasa (AFE) (CRL1446), movilización de células B productoras de IgA

secretoria e inducción de fagocitosis en macrófagos (CRL431) y producción de ácido

linoleico conjugado (CLA) (CRL1434).

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Objetivo

125

Evaluar los efectos de una dieta de restricción

calórica con y sin la administración de Lactobacillus

fermentum CRL1446, Lactobacillus casei CRL431 y

Lactococcus lactis CRL1434, sobre parámetros metabólicos,

inmunológicos y la composición de la microbiota intestinal.

Objetivo Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Capitulo III

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Resultados

126

Resultados

Efecto de la RC y la administración de BL sobre la ganancia de peso corporal (GPC)

En la Figura 29 se puede observar el efecto de los diferentes tratamientos dietarios sobre el

peso corporal expresado en gramos (g) totales al final del período de estudio o como GPC

(g final-g inicial/tiempo), a los 7, 20 y 45 días (Figura 29). Observamos que un 25% de RC

indujo una reducción en el peso corporal (g), del 18%, a los 20 días, y del 24%, a los 45 días,

que represento una reducción de un 55% a los 20 días y un 80% a los 45 días si se expresa

como GPC en comparación con el grupo alimentado con dieta estándar (DE). Por otro lado,

la suplementación de la dieta RC con BL, si bien, no afectó significativamente el peso

corporal con respecto al grupo RC, produjo diferentes efectos significativos sobre la GPC; la

cepa CRL431 (grupo RC-CRL431) indujo una mayor GPC comparada con el grupo RC (24%

más a los 20 días y 21% a los 45 días), mientras que la suplementación de la RC con las cepas

CRL1446 (RC-CRL1446) y CRL1434 (RC-CRL1434) redujeron significativamente la GPC en

relación al grupo RC. Esta reducción, comparados con el grupo RC, fue de un 80% a los 20

días, y de un 104% a los 45 días (es decir, pérdida de peso) para el grupo RC-CRL1446,

mientras que RC-CRL1434 redujo un 38% a los 20 días y un 70% a los 45 días. Por otro lado,

a los 7 días (Figura 29) (cuando todavía la RC no afecta significativamente este parámetro

(GPC)), la suplementación con las cepas CRL1446 y CRL431 mostraron diferencias

significativas con respecto a la dieta RC, este efecto fue opuesto, es decir, mientras CRL1446

redujo la GPC, la cepa CRL431 la aumentó, demostrando un fuerte efecto cepa dependiente

sobre la GPC.


127

Figura 29| Peso (A) y Ganancia de peso corporal (B) (g) total a los 7, 20 y 45 días, después de la intervención dietética proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL1434) y Lactobacillus caseiCRL431 (RC-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

B

A


128

Efecto de la RC y la administración de BL sobre la conversión alimenticia

En este trabajo, fue determinada la CA como el cociente entre la GPC (g final-g

inicial/tiempo) y la ingesta de alimento (g) de los animales durante 7 semanas (Figura 30).

La Figura 30 muestra la CA en los días 7, 20 y 45, para los diferentes tratamientos. Nuestros

resultados indican que una dieta de RC disminuye significativamente la CA desde los 20

días de tratamiento; reduciéndola 13 veces con respecto a la DE a los 45 días. La

administración de BL a la dieta RC muestra cambios significativos en este parámetro. Las

cepas CRL1446 y CRL1434 redujeron significativamente la CA ya en el día 7

(aproximadamente 5 veces), comparado con el grupo RC. Es importante destacar que a este

tiempo la RC no muestra efectos significativamente diferentes a los del grupo control (DE).

A los 20 y 45 días se mantuvo esta tendencia con la administración de CRL1446 y CRL1434

(3.7 veces). Por otra parte, la suplementación de RC con la cepa CRL431 aumentó

significativamente la CA en todos los tiempos comparada con el grupo RC, este aumento

fue de 1,3 veces a los 7 días, 1.8 veces a los 20 días, y de 8 veces a los 45 días.

Figura 30| Conversión alimenticia (CA) a los días 7, 20 y 45. La CA se obtiene del cociente entre el alimento consumido (g) y la GPC (g) por 100 (cien), después de la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).


129

Efecto de la dieta RC y la administración de BL sobre parámetros bioquímicos

Es importante determinar los parámetros bioquímicos y hormonales alterados por la dieta

y determinar la influencia de las BL sobre ellos cuando son administradas de forma

continua. Para ello, fue determinado en plasma los niveles de colesterol, triglicéridos y

glucosa por métodos enzimáticos utilizando kits colorimétricos comerciales, como se

describió anteriormente.

Nuestros resultados muestran que la dieta de RC fue muy eficiente para reducir

significativamente los niveles de los metabolitos analizados en plasma (glucosa, colesterol

y triglicéridos), tanto a los 20 como a los 45 días, comparados con los animales alimentados

con la DE. La suplementación de la RC con las cepas CRL1446 y CRL431 indujeron

diferencias significativas en glucosa y colesterol con respecto al control de RC (Figura 31A

y B). Con la administración de CRL431 durante 20 días observamos que los niveles de

glucosa se recuperan totalmente; es decir se obtuvieron valores similares al control de DE,

mientras que a los 45 días esta recuperación fue parcial (Figura 31A). Las cepas CRL 1446 y

CRL1434 no indujeron cambios en los valores de glucosa comparados con el grupo RC

(Figura 31A). Cuando analizamos los valores de colesterol en sangre observamos que la

administración de CRL1446 redujo significativamente los niveles de colesterol total, a los 20

y 45 días en comparación con el control de RC (Figura 31B). Por otra parte, No observamos

efectos significativos de ninguna cepa sobre los niveles de triglicéridos (Figura 31C).


130

Figura 31| Niveles en plasma de glucosa (A), colesterol total (B), y triglicéridos (C), a los 20 y 45 días de la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL1434) y Lactobacilluscasei CRL431 (RC-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

B

C

A


131

Efecto de la dieta RC y la administración de BL sobre los niveles plasmáticos de citoquinas y leptina

En este trabajo observamos que la dieta de RC posee un potente efecto adipomodulador por

sí sola, reduciendo significativamente los niveles de leptina en un 70%, tanto a los 20 como

45 días de tratamiento (Figura 32), comparados con la dieta DE. la administración de

CRL431 revierte parcialmente la reducción inducida por la RC en ambos tiempos,

mostrando un aumento significativo de los niveles de leptina del 32% con respecto al grupo

RC. Por el contrario, la suplementación con CRL1446 y CRL1434 solo tuvieron efecto sobre

la misma a los 45 días, en donde indujeron una reducción significativa de los niveles de

leptina; en un 50% comparados con el control de RC.

Figura 32| Niveles de leptina en plasma de ratones a los 20 y 45 días de la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-CRL431) en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).


132

Se determinó los niveles de las siguientes citoquinas en plasma a los 45 días de intervención:

IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α Y MCP-1. De las cuales sólo observamos cambios

en los niveles de IL-10, IL-17 y TNF-α (Figura 33 A, B y C). La dieta de RC sólo redujo

significativamente los niveles de TNF-α comparada con la DE. Las dietas RC-CRL1434 y

RC-CRL431 indujeron un aumento significativo de los niveles de IL-10 e IL-17 comparados

con el grupo control de RC; además de restablecer los niveles de TNF-α a valores normales.

Figura 33| Niveles plasmáticos de IL-10 (A), IL-17 (B), TNF-α (C), IL-6 (D), IFN-γ (E), IL-4 (F) e IL-2 (G), a los 45 días de la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-RCL434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

CBA

D FE

G H


133

Efecto de la dieta RC y la administración de BL sobre el peso del tejido adiposo (TA), bazo e hígado

Evaluamos el peso de hígado (Figura 34 A), bazo (Figura 34 B) y tejido adiposo (TA) (total,

epididimal y mesentérico) (Figura 35); observamos diferencias significativas sólo en el TA.

La dieta de RC indujo una reducción significativa del TA total (Figura 35) de un 18% a los

20 días y un 24% a los 45 días con respecto al control DE. La suplementación de la RC con

CRL431 restableció completamente el peso del TA a los 20 días y parcialmente a los 45 días.

En cuanto, que la suplementación de RC con CRL1446 y CRL1434, indujeron una reducción

del TA total en un 22%, a los 20 días, comparado con el grupo RC. La diferencia principal

en el efecto de estas cepas (CRL1446 y CRL1434) estuvo en el tipo de TA afectado, mientras

que CRL1446 redujo el tamaño del TA mesentérico (Figura 35, C), CRL1434 redujo el TA

epididimal (Figura 35, B) a los 20 días.

Figura 34| Peso de Hígado (A) y Bazo (B) en 100 gramos de peso corporal (%) de ratones, a los 20 y 45 días de intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

B

A


134

Figura 35| Peso del TA total (epididimal + mesénterico) (A), TA epididimal (B) y TA mesentérico (C) en 100 gramos de peso corporal (%), de ratones a los 20 y 45 días de intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

B

A

C


135

En el TA observamos además cambios en la estructura de las células adiposas mediante

cortes histológicos teñidos con hematoxilina-eosina (Figura 37). Determinamos cambios

tanto en el área como el número de adipocitos entre los diferentes grupos estudiados (Figura

36). La dieta RC favoreció el aumento significativo del número de adipocitos de menor área

(entre 0-500 y 500-1000 µm2) y la reducción del número de adipocitos de mayor área (entre

1000-2000 y ≥2000 µm2) con respecto a la DE, tanto a los 20 como 45 días. La suplementación

con BL sólo indujo cambios significativos a los 45 días con la cepa CRL1446 (Figura 36, B),

en donde se observó un gran incremento de adipocitos con un área de 0-500 µm2 (pequeños)

y una reducción casi total de adipocitos entre 1000-2000 µm2 (adipocitos grandes).

Figura 36| Número de adipocitos epididimales en función del área (µm2), de ratones a los 20 (A) y 45 (B)días, de la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Los adipocitos fueron agrupados por rangos de tamaño como sigue: áreas entre 0-500; 500-1000; 1.000-2.000; y 2.000-4.000 mµ2. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

Área (µm2) Área (µm2)

A B

b b


136

Figura 37|A

dipocitos a los 20 días (20) y45 días (45),de ratones alim

entados con una dieta estándar (DE) o con una dieta alta en grasas (D

AG

), con y sin la suplem

entación de BL: Lactobacillus fermentum

CRL1446 (D

AG

-CR

L1446), Lactococus lactis CRL1434 (D

AG

-CR

L1434) y Lactobacilluscasei CRL431 (D

AG

-CR

L431)en una dosis de 1x10

8 UFC

/mL. Las im

agenes fueron tomadas con un m

icroscopio Carl Zeiss - A

xio Scope.A1, con un objetivo de 40x, con luz visible, y las fueron

analizadas con el shoftware C

arl Zeiss – Axio V

ision reléase 4.8.


137

Efecto de la dieta RC y la administración de BL sobre la funcionalidad de adipocitos murinos

Evaluamos la funcionalidad de adipocitos ex vivo mediante la producción de leptina. Los

adipocitos obtenidos del tejido adiposo epididimal de ratones de los diferentes grupos

mostraron un perfil diferencial de producción de leptina (Figura 38). Los adipocitos no

estimulados (DMEM, sobrenadante) corresponden al control basal de leptina y citoquinas;

mientras que aquellos estimulados con LPS corresponden al control (+) de estimulación.

Nuestros resultados muestran que la dieta RC indujo una reducción de los niveles de

leptina, tanto a los 20 como 45 días, independientemente del estímulo (LPS) que recibieron

las células, lo que demuestra una influencia significativa de la dieta RC sobre la capacidad

secretora del tejido adiposo (capacidad adipomoduladora). Los adipocitos del grupo RC-

CRL431 produjeron niveles significativamente altos de leptina a los 45 días de tratamiento,

estas células mostraron este aumento, tanto con LPS como con DEMEN, con respecto a los

adipocitos del grupo RC. Por lo contrario, la administración de CRL1446 indujo en los

adipocitos (con LPS y con DEMEN) una reducción significativa de la producción leptina a

los 45 días de tratamiento, con respecto al grupo control de RC. La cepa CRL1434 indujo

una disminución de leptina a los 45 días cuando los adipocitos son estimulados con LPS.

Figura 38| Niveles de leptina producidos por adipocitos epididimales de ratones con (LPS) o sin estímulo (DEMEN), a los 20 (A) y 45 (B) días, después que los animales fueron sometidos a una intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-Lf1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-Ll1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-Lc431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

A B


138

Efecto de la dieta de RC y la administración de BL sobre la funcionalidad de macrófagos peritoneales murinos

La funcionalidad de macrófagos peritoneales ex vivo fue evaluada mediante la producción

de TNF-α, IL-6, MCP-1 e IL-10. Cuando analizamos la producción de citoquinas en los

macrófagos peritoneales, observamos que la dieta de RC indujo una reducción tanto de la

producción basal de citoquinas (DMEM) como la inducida por LPS, a los 20 y 45 días con

respecto a los macrófagos del grupo DE (Figura 39).

Si analizamos la influencia de las BL, observamos que la suplementación de la dieta RC con

las cepas CRL1434 y CRL431 favorecen la producción basal de TNF-α, IL-6 (citoquinas pro-

inflamatorias) e IL-10 (citoquina reguladora) a los 20 y 45 días de administración con

respecto al control de RC. Mientras que la cepa CRL1446 no induce modificaciones

significativas de estas citoquinas con respecto al grupo RC en este período. La producción

basal a los 20 días de MCP-1 se mantuvo con valores similares entre todos los grupos.

En cuanto al estímulo pro-inflamatorio con LPS, observamos que el mismo indujo una

producción significativa de las citoquinas y de MCP-1 en todos los grupos experimentales

comparado con la producción basal. A los 20 días, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 fueron

significativamente mayores en los tres grupos suplementados con BL (RC-CRL1446, RC-

CRL1434 y RC-CRL431) comparados con el grupo RC. En este sentido se destacaron, la cepa

CRL431 que mostró los mayores valores para TNF-α, y la cepa CRL1434 para IL-10. Por

otro lado, los niveles de MCP-1 fueron significativamente menores en los grupos

suplementados con CRL1446 y CRL1434, comparados con el grupo RC, mientras que para

el grupo RC-CRL431 mostró niveles similares al control DE. A los 45 días, los grupos RC-

CRL1434 y RC-CRL431 mantuvieron su efecto sobre los niveles de IL-10. En cuanto a los

niveles de TNFα, tanto el grupo RC-CRL431 como RC-CRL1434 indujeron un aumento

significativo; mientras que para IL-6, sólo el grupo RC-CRL431 se diferenció

significativamente con respecto a RC. Finalmente, los niveles de MCP-1 continuaron

disminuidos para todos los grupos RC, con o sin la suplementación de BL.


139

Figura 39| Niveles de TNF-α (A), IL-6 (B), MCP-1 (C) e IL-10 (D) producidos por macrófagos peritoneales estimulados con LPS o sin estimular (DMEM), a los 20 y 45 días, los cuales fueron extraídos de ratones despuésde la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-Lf1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-Ll1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-Lc431), en una dosis de 1x108 UFC/mL. Cada grupo de datos representa la media ± ES (error estándar) de 8 ratones, letras diferentes indican diferencia significativa, por el test de ANOVA con ensayo post hoc de Tukey (p<0,05).

20 Días 45 Días

A

B

C

D


140

Efecto de la dieta RC y la administración de BL sobre la composición de la microbiota intestinal

Las comunidades microbianas presentes en las muestras de heces de ratones de los

diferentes grupos se analizaron por secuenciación masiva y paralela de amplicones de

DNAr 16S. La Tabla 5 presenta los índices Sobs, Shannon and Simpson de alfa diversidad. La

riqueza observada (análisis de rarefacción) demostró que no hay grandes diferencias entre

las microbiotas intestinales obtenidas de todos los tratamientos. Sin embargo, los ratones

RC con y sin suplementación de BL, mostraron una tendencia en la disminución del número

de especies microbianas intestinales cuando se compararon con los ratones DE (Sobs).

Curiosamente, la condición RC parece inducir una ganancia de diversidad en términos de

homogeneidad de las comunidades, ya que aumentó el índice de Shannon con el paso del

tiempo. Esto es apoyado con la inversa del índice de Simpson (1/ Simpson) que indica

diversidad, donde el tratamiento RC a los 45 días (11.8) es casi el doble de la diversidad

observada a los 20 días (6.2), contrario a lo observado para los otros tratamientos. La

suplementación de la dieta RC con las cepas CRL1446 y CRL431 redujeron la biodiversidad,

principalmente debido al aumento de la dominancia de ciertas especies en la comunidad

microbiana, aumentando el índice de Simpson y reduciendo el de Shannon, con respecto a

los demás tratamientos.


141

Tabla 5| Índices de alfa diversidad de las comunidades microbianas analizadas

Los ratones fueron sometidos a la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-Lf1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-Ll1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-Lc431), en una dosis de 1x108 UFC/mL, los 20 y 45 días. (Sobs, Shannon, Simpson).

Nuestros resultados demuestran cambios importantes en la composición de la microbiota

intestinal a nivel de phylum (Figura 40) y género (Figura 41) entre los grupos de estudio. La

dieta de RC cambió la abundancia relativa de ciertos grupos de bacterias en las muestras

fecales de los ratones. En primer lugar, indujo una reducción de los principales phylum

relacionados con patógenos, como son Proteobacteria y TM7, mostrando una reducción de la

abundancia relativa de 5,4 veces a los 20 días y de 2,5 veces a los 45 días, comparado con el

grupo DE. Por otro lado, indujo un aumento de dos phylum que se reducen con el tiempo;

como son Bacteroidetes y Actinobacteria, mostrando un aumento de 6,7 veces a los 20 días y

11,3 veces a los 45 días para Actinobacterias y de 3,4 veces a los 20 días y 4 veces a los 45 días

para Bacteroidetes, comparado con el grupo DE. Debido a estos cambios, la RC redujo

significativamente la relación Firmicutes / Bacteroidetes (F/B) (Figura 42) tanto a los 20 como

45 días, con respecto al grupo DE. El phylum Firmicutes no mostró cambios significativos

entre los grupos controles (DE) y RC. Los cambios a nivel de phylum inducidos por la RC se

Muestras Coeficientes de alfa diversidadDistancia Sobs Shannon Simpson

DE (20 días) 0,0300 1374 3,6777 0,0836DE (45 días) 0,0300 1400 3,4771 0,1963 RC (20 días) 0,0300 1275 3,0224 0,1609RC (45 días) 0,0300 1399 3,6284 0,0848 RC-CRL1446 (20 días) 0,0300 1269 2,7711 0,2049RC-CRL1446 (45 días) 0,0300 1193 2,2196 0,2742 RC-CRL1434 (20 días) 0,0300 1235 3,4516 0,0988RC-CRL1434 (45 días) 0,0300 1474 3,7409 0,0740 RC-CRL431 (20 días) 0,0300 1133 2,3185 0,2650RC-CRL431 (45 días) 0,0300 1249 2,7095 0,2454


142

correlacionaron con aumentos de dos géneros principales que representaron casi el 70% de

la microbiota en el grupo RC, estos fueron Lactobacillus y Bifidobacterium. El aumento fue de

5,7 veces a los 20 días y de 24 veces a los 45 días para Lactobacillus y de 30 veces a los 20 días

y 75 veces a los 45 días para Bifidobacterium. Otro género que mostró aumento por la RC fue

Barnesiella incrementándose 12 veces a los 20 días y 5 veces a los 45 días, con respecto al

grupo DE.

Figura 40| Abundancia relativa (%) a nivel de phylum en heces de ratones sometidos a la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-Lf1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-Ll1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-Lc431), en una dosis de 1x108 UFC/mL, los 20 y 45 días. Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones y se presentan los 5 principales Phylum, que representan más del 99% de la microbiota intestinal.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

DE (día 20)

DE (día 45)

RC (día 20)

RC (día 45)

RC-CRL1446 (día 20)




RC-CRL431 (día 20)

RC-CRL431 (día 45)

Abundancia relativa

Firmicutes

TM7

Proteobacteria

Bacteroidetes

Actinobacteria

Phylum


143

La suplementación de la RC con L. fermentum CRL1446 permitió un incremento del phylum

Actinobacteria, alcanzando casi el 50% de la abundancia relativa en el día 45 de tratamiento

para el grupo RC-CRL1446. Por otro lado, redujo la abundancia de Firmicutes por debajo del

20% tanto a los 20 como 45 días de tratamiento, siendo el grupo que posee las proporciones

más bajas en comparación con los otros grupos. La reducción del phylum Firmicutes se

correlacionó con una reducción de la relación F/B y del género Lactobacillus, a pesar de que

fue el único tratamiento (RC-CRL1446) que mantuvo los niveles de este género con el paso

del tiempo a diferencia de la RC que los disminuye (figura 41). Para el resto de tratamientos

se observó una disminución del género Lactobacillus entre los 20 y 45 días. Por otro lado, el

aumento del Phylum Actinobacteria reportado para el grupo RC-CRL1446 se correlacionó

con aumentos muy marcados de la abundancia relativa del género Bifidobacterium,

alcanzando casi el 50% de la comunidad microbiana para este grupo a los 45 días (Figura

41), indicando un efecto bifidogénico para la dieta RC-CRL1446. La suplementación de la

RC con la cepa L. casei CRL431 indujo un aumento significativo del phylum Firmicutes a los

20 días, este aumento se correlacionó con un aumento del género Lactobacillus, que

representó el 70% de la microbiota intestinal para este grupo (RC-CRL431), con lo cual

mostró el valor más elevado de la relación F/B para este tiempo (Figura 42). Este efecto se

perdió a los 45 días. Finalmente, el grupo RC- CRL1434 no mostró diferencias significativas

en la composición de la microbiota (philum y género) con respecto al grupo RC.


144

Figura 41| Abundancia relativa (%) a nivel de género en heces de ratones sometidos a la intervención dietética, proporcionada por una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-Lf1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-Ll1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-Lc431), en una dosis de 1x108 UFC/mL, los 20 y 45 días. Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones y se presentan los 20 principales Géneros que representan más del 99% de la microbiota intestinal.

0% 20% 40% 60% 80% 100%

DE (día 20)

DE (día 45)

RC (día 20)

RC (día 45)





RC-CRL431 (día 20)

RC-CRL431 (día 45)

Abundancia relativa

GéneroTM7

Lactobacillus

Bifidobacterium

Alistipes

Dorea

Clostridium XlVa

Roseburia

Barnesiella

Desulfovibrio

Ruminococcus

Pseudoflavonifractor

Lachnospiracea

Helicobacter

Clostridium IV

Clostridium XVIII

Bacteroides

Flavonifractor

Oscillibacter

Sphingomonas

Enterorhabdus

Allobaculum


145

Figura 42| Relación Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) para los diferentes grupos de ratones a los 20 y 45 días de tratamiento dietario con una dieta estándar (DE), o una RC del 25% con y sin la suplementación de bacterias lácticas: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacilluscasei CRL431 (RC-CRL431). Cada grupo de datos representa la media de 6 ratones.

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Discusión

146

Discusión

Utilizamos un modelo de restricción calórica leve que se alcanza con un déficit del 25% del

alimento diario consumido, con el cual inducimos una pérdida de aproximadamente 24%

de peso corporal a los 45 días, diferenciándose de la desnutrición moderada (26-39%) o

severa (>40%) que presentan elevada mortalidad (Gómez et al., 2000). Las determinaciones

se realizaron en dos períodos de tiempo, 20 y 45 días, con el fin de analizar el tiempo como

variable, además de la dieta y la suplementación con BL.

Existen muchos estudios epidemiológicos y clínicos que sugieren que la RC disminuye la

incidencia de la enfermedad cardiovascular, diabetes tipo 2, y diferentes tipos de cáncer en

seres humanos (Anderson and Weindruch, 2010). La RC “sin desnutrición” retrasa el

proceso de envejecimiento y prolonga la vida media de diversas especies por mecanismos

no totalmente conocidos (Spindler, 2010). La relación lineal inversa entre la ingesta de

calorías y la vida media, sugiere que los reguladores del metabolismo energético son

importantes para los efectos de la RC (Anderson and Weindruch, 2010). Sin embargo, la

evaluación de la respuesta metabólica a la dieta RC es un campo que no está completamente

aclarado y requiere estudios adicionales.

En este capítulo evaluamos los efectos de una dieta de RC con y sin la administración de

diferentes BL adipomoduladoras, L. fermentum CRL1446, L. casei CRL431 y L. lactis CRL1434,

sobre parámetros metabólicos, inmunológicos y la estructura de la microbiota intestinal.

La administración de la RC durante 45 días indujo una reducción del peso de 24% con

respecto al grupo DE. Nuestros resultados mostraron que la suplementación con CRL1446

y CRL1434 indujeron una disminución significativa de la GPC, mientras que CRL431 indujo

un aumento significativo, comparados con la RC. Esto demuestra un efecto modulador cepa

dependiente sobre el metabolismo energético del hospedador, ya que todos los animales de

los grupos RC consumieron la misma cantidad de alimento, sugiriendo un potencial de

captación de energía diferente inducido por cada cepa, esto está estrechamente relacionado

a la composición de la microbiota intestinal (Turnbaugh and Gordon, 2009), que fue afectada

por los diferentes tratamientos dietarios (se discute más adelante). Estos hallazgos son


147

interesantes ya que se ha postulado a la modulación de la microbiota intestinal como una

posible estrategia para el tratamiento de la obesidad (Kobyliak et al., 2016).

Hasta el momento se han reportado diferentes efectos (controversiales) de la administración

de probióticos sobre la GPC y la acumulación de grasa corporal. En este sentido, Raoult et

al. , (Armougom et al., 2009; Raoult, 2009) afirmaron que la administración en la dieta de

suplementos que contienen probióticos principalmente del phylum Firmicutes, incluyendo

géneros como Lactobacillus spp. y Enterococcus spp., se utilizan con frecuencia para mantener

la salud y promover el crecimiento. Estos autores también describieron la ganancia de peso

en niños que recibieron Lactobacillus spp., como un tratamiento para la diarrea, además del

aumento de este género en pacientes obesos. Por lo que sugieren que los probióticos pueden

estar relacionados con el control del peso corporal y el desarrollo de obesidad. En oposición

a este punto de vista, Ehrlich (2009) (Ehrlich, 2009), Delzenne y Reid (2009) (Delzenne and

Reid, 2009) afirmaron que la humanidad ha estado consumiendo probióticos la mayor parte

de su historia sin inducir obesidad. Además, insistieron, en que los probióticos no están

relacionados con el desarrollo de obesidad, y que el phylum Firmicutes (aumentado en la

obesidad) no sólo contiene al género Lactobacillus, sino también otros microorganismos

incluidos algunos patógenos como Bacillus anthracis. En medio de estas discusiones, nuestro

trabajo muestra que el tratamiento con cepas del género Lactobacillus puede modular la

ganancia de peso corporal de manera cepa dependiente. En este sentido, Kang et al., (Kang

et al., 2010), demostraron que la administración de Lactobacillus gasseri BNR17 indujo una

reducción del peso corporal y la masa de tejido adiposo blanco en ratas con sobrepeso

inducido por la dieta, así como Kang otro autores (Yoo et al., 2013; Tomaro-Duchesneau et

al., 2013; Novotny Núñez et al., 2015; Toshimitsu et al., 2016), reportaron efectos beneficiosos

del género Lactobacillus en modelos de obesidad inducido por la dieta. Nuestros resultados

representan la primera evidencia del efecto de este género sobre RC, y demuestra que al

igual que en modelos de obesidad inducidos por la dieta el efecto es cepa dependiente y no

se puede generalizar a nivel de género. Nuestros resultados también mostraron que los

cambios en la GPC estuvieron asociados con cambios en el tamaño del TA y el área de

adipocitos. En este sentido la RC redujo ambos parámetros, favoreciendo el número de


148

adipocitos pequeños (0-500 µm2) y reduciendo los de gran tamaño (1000-2000 µm2). Por otro

lado, las cepas CRL1446 y CRL1434 que redujeron la GPC, comparados con RC, fueron los

tratamientos que en mayor medida redujeron, tanto el tamaño del TA, como el área de

adipocitos, destacándose la cepa CRL1446 que mostró el mayor número de adipocitos

pequeños (0-500 µm2) a los 45 días de tratamiento. La cepa CRL431 que aumentó la GPC,

comparado con la RC, se caracterizó por aumentar el peso del TA, pero no mostró cambios

significativos en el área de adipocitos con respecto a RC. Teniendo en cuenta estos

resultados sugerimos que el efecto sobre el peso corporal o la GPC, es cepa dependiente, y

se debe principalmente a cambios sobre la estructura del TA inducido por la dieta (RC o

RC+BL). Estos cambios repercuten a nivel metabólico, endócrino e inmunológico ya que el

TA impacta sobre estos sistemas (Sam and Mazzone, 2014b; Grant and Dixit, 2015) y puede

contribuir al mantenimiento de la homeostasis o al desarrollo de enfermedades (Rezaee F,

2013; Manna and Jain, 2015). En este sentido, observamos efectos de la RC y la

administración oral de BL tanto sobre parámetros bioquímicos como inmunológicos.

La RC redujo los niveles en plasma de leptina y TNF-α, dos adipoquinas pro-inflamatorias

relacionadas con el desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y la promoción de cáncer

(Rose et al., 2004). La reducción de adipoquinas pro-inflamatorias (leptina y TNF-α) se

asoció a una disminución del TA y lípidos en plasma, lo cual demuestra un efecto

adipomodulador de la RC también reportado por otros autores (Fontana et al., 2004, 2010).

Teniendo en cuenta que estas dos adipoquinas se correlacionan con el aumento de tejido

adiposo (Faggioni et al., 2001b), la inflamación, y el desarrollo de enfermedades crónicas

ligadas al envejecimiento como la obesidad, la diabetes tipo 2, enfermedad cardiovascular

y cáncer (Rose et al., 2004), sugerimos que el efecto adipomodulador de la RC, mediante

remodelación de la estructura del TA, el perfil de adipoquinas (principalmente leptina y

TNF-α) podría ser uno de los principales mecanismos por los cuales esta dieta prolonga la

vida media de diferentes especies (Colman et al., 2009). La leptina y el TNF-α están

relacionados con la sensibilidad de la insulina independientemente de la obesidad,

mostrando una disminución en los niveles de insulina y aumentos en los niveles de glucosa.

A pesar de la complejidad del eje adipoinsular (relación entre el TA y células β-


149

pancreáticas) se ha establecido que las principales adipoquinas que influyen sobre este eje

son leptina, adiponectina y TNF-α (Dunmore and Brown, 2013). La mayoría de los estudios

sugieren que leptina y TNF-α disminuyen la síntesis y secreción de insulina por las células

β-páncreaticas (Dunmore and Brown, 2013), y aumentan la extracción hepática de insulina

(Ceddia et al., 2002; Covey et al., 2006). Como resultado, la secreción de insulina se reduce

por la leptina (Andreev et al., 2009). Este eje adipoinsular es parte de una retroalimentación

inhibitoria mediada por la leptina sobre la secreción de insulina con el fin de disminuir la

adipogénesis. Cuando suplementamos la RC con las BL, observamos que las cepas CRL1446

y CRL1434 reforzaron algunos efectos de la RC, como la reducción de los niveles de leptina,

mostrando niveles significativamente inferiores a los observados en el grupo RC. Mientras

que CRL431 se comporta de manera opuesta, principalmente por contrarrestar la reducción

del TA inducido por la RC, lo que se asoció, con aumentos significativos de los niveles

plasmáticos de leptina, TNF-α, IL-17 y glucosa, comparado con el grupo RC. Cuando

analizamos la producción de leptina por adipocitos de forma ex vivo, observamos una

reducción significativa de los niveles de la hormona inducidos por RC, en comparación con

adipocitos del grupo DE, con o sin el estímulo de LPS. Esto se puede explicar si tenemos en

cuenta la histología del TA donde observamos una reducción del área de los adipocitos del

grupo RC, ya que fue reportado por algunos autores (Skurk et al., 2007), que los niveles de

leptina son directamente proporcionales al tamaño de los adipocitos. La suplementación de

la dieta RC con BL sólo mostró efectos significativos con respecto al grupo RC, a los 45 días.

Donde las cepas que redujeron los niveles de leptina in vivo (CRL1446 y CRL1434), ejercieron

el mismo efecto ex vivo, confirmando que la modulación del área de los adipocitos por parte

de las BL podría ser responsable de la disminución de los niveles de leptina.

Por otro lado, analizamos los niveles de citoquinas en plasma para el grupo RC a los 45 días,

observamos una reducción significativa en los niveles de TNF-α, comparado con el grupo

DE, y una pequeña disminución en IL-6 e IL-17, que no fueron significativas. Un efecto

similar observamos para los macrófagos que fueron desafiados de forma ex vivo (LPS).

Observamos que los macrófagos pertenecientes al grupo RC mostraron una reducción de

citoquinas pro-inflamatorias, comparados con los macrófagos del grupo DE, esto fue


150

independientemente del estímulo para IL-6, IL-10 y TNF-α, pero no para MCP-1 que sólo

indujo diferencias significativas en su producción cuando los macrófagos fueron desafiados

con LPS (entre el grupo RC y DE). Si bien hubo una reducción en los niveles de citoquinas

inducidos por las RC, estas células seguían respondiendo en gran medida a un estímulo

pro-inflamatorio como el LPS, (diferencia significativa entre macrófagos con y sin estímulo)

lo cual indica que mejoraron su funcionalidad. Por otro lado, la suplementación de RC con

BL, se caracterizó por incrementar los niveles de citoquinas comparados con el grupo RC.

En este sentido observamos aumentos en los niveles de; IL-10, (principalmente CRL1434)

TNF-α e IL-6 (se destacó la cepa CRL431). Los niveles de MCP-1 fueron significativamente

reducidos por las cepas CRL1446 y CRL1434 y aumentados por CRL431, comparados con el

grupo RC.

Al analizar los parámetros bioquímicos observamos que la RC disminuyó los niveles de

glucosa en ambos días de tratamiento (20 y 45), y la suplementación con BL afecto los niveles

de la misma, la cepa CRL431 aumentó significativamente los niveles de glucosa mientras

que CRL1446 y CRL1434 la redujeron significativamente a los 45 días, siempre comparados

con el grupo RC. Esto demuestra la influencia de BL adipomoduladoras sobre el

metabolismo de glucosa, este efecto podría estar principalmente relacionado a la

modulación de los niveles de leptina ejercidos por las cepas, con lo cual se afecta la

sensibilidad de insulina y por ende los niveles de glucosa. Esto fue también reportando por

(Bäckhed et al., 2004). Por otra parte esto también puede estar asociado a cambios en la

microbiota intestinal, ya que cambios en los principales phylum que gobiernan la microbiota

intestinal, como Firmicutes y Bacteroidete,s afectan la extracción de energía de la dieta y por

ende los niveles de metabolitos en sangre (Jumpertz et al., 2011).

Aproximadamente cada día, hasta 1 g de colesterol de la dieta entra en el colon, de hecho, a

pesar de enormes variaciones entre individuos, sólo la mitad del colesterol de la dieta se

absorbe en promedio, principalmente en el duodeno y el yeyuno proximal (Gérard, 2013).

Además del colesterol proveniente de la dieta, sus niveles en suero se mantienen mediante

la síntesis de novo que ocurre principalmente en el hígado, en este sentido Caesar et al.,


151

(Caesar et al., 2016) demostraron como los lípidos de la dieta interactúan con la microbiota

intestinal y regulan la síntesis de colesterol hepático y sus niveles en suero. En este caso,

estos autores evaluaron dietas estándares y ricas en grasas (saturadas o poliinsaturadas),

pero no estudiaron el efecto de la RC. La administración de RC con o sin la suplementación

de BL mostró efectos sobre los niveles de colesterol y glucosa, mientras que la dieta RC fue

el único tratamiento responsable de la disminución de TG. Algunos autores mostraron que

la RC tiene profundos y sostenidos efectos beneficiosos sobre los principales factores de

riesgo como, aterosclerosis, colesterol en suero, LDL-Colesterol, HDL-Colesterol y TG, que

por lo general aumentan con la edad avanzada (Fontana et al., 2004). Estos autores muestran

además que la RC proporciona un poderoso efecto protector contra la obesidad y la

resistencia a la insulina. Por un lado, la reducción del 25 % en la ingesta diaria explica este

descenso de los niveles de colesterol inducidos por la RC, y por otra parte, la RC afecta la

estructura de la microbiota con lo cual sugerimos, que esto podría alterar el metabolismo

hepático y con ello la síntesis de novo de este lípido (Caesar et al., 2016). La administración

de la cepa CRL1446 a la RC, fue cepa que indujo un mayor descenso de los niveles de

colesterol total, en comparación con el resto de tratamientos de RC. Con este resultado

podemos sugerir que CRL1446 tiene un efecto hipocolesterolémico en el modelo

experimental utilizado, y podría estar actuando sinérgicamente con la RC, para reducir los

niveles de este lípido. Bhathena et al. (Bhathena et al., 2009), informaron que la cepa

Lactobacillus fermentum LF11976 productora de feruloil esterasas (microencapsulada),

disminuyó los lípidos séricos en hámsters hipercolesterolémicos. El ácido ferúlico presenta

propiedades hipocolesterolémicas ya que puede inhibir la hidroximetilglutaril CoA

reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol y la colesterol

aciltransferasa, enzima que esterifica el colesterol en los tejidos (principalmente en hígado),

y mediante el aumento de la excreción de esteroles ácidos (Balasubashini et al., 2003).

Teniendo en cuenta que la cepa CRL1446 ha demostrado tener una elevada actividad

feruloil esterasa tanto in vivo como in vitro (Mukdsi et al., 2012), este podría ser el mecanismo

de acción por el cual ejerce su efecto hipocolesterolémico, además de las modificaciones que

induce sobre la microbiota intestinal (se discute más adelante).


152

Esto demuestra que la suplementación de la RC con cepas adipomoduladoras específicas

como CRL1446 y CRL1434, podría ser un tratamiento eficaz para combatir la obesidad,

mediante la reducción de, el tamaño del TA y la producción de adipoquinas pro-

inflamatorias, como leptina, TNF-α y MCP-1, modulando de esta manera el estado

metabólico general de un individuo. Mientras que, en en el otro extremo, la RC, que puede

llegar a cursar con desnutrición si se prolonga en el tiempo, la cepa CRL431 podría

representar una mejor opción para reestablecer las alteraciones inmuno-metabólicas

inducidas por la dieta, ya que favorece el aumento de GPC, el tamaño del TA, y con ello el

aumento de adipoquinas pro-inflamatorias (leptina, TNF-α e IL-17) necesarias para

combatir las infecciones en individuos desnutridos con un sistema inmune deficiente.

Los cambios en la ganancia de peso corporal (GPC) y el coeficiente de conversión

alimenticia (CCA) están muy asociados a la estructura de la microbiota intestinal, debido a

que uno de los principales parámetros afectados por la microbiota es la obtención de energía

a partir de la dieta (Bäckhed et al., 2004; Jumpertz et al., 2011). Los recientes avances en las

tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS) están revolucionando nuestra

evaluación y comprensión de las comunidades microbianas, la amplificación de las regiones

rRNA 16S acoplados a la generación HTS permiten obtener una cobertura completa de las

comunidades microbianas, y la investigación a nivel más profundo de las complejas

interacciones entre las especies presentes en una comunidad dada. Utilizando métodos de

secuenciación de alto rendimiento para estudiar los cambios en las comunidades

microbianas intestinales, encontramos que la microbiota intestinal se vio profundamente

afectada por la RC, esta permitió una reducción del índice F/B (Figura 42), mediante una

ganancia de Bacteroidetes, lo que está de acuerdo a lo reportado por otros autores que

utilizaron tratamientos restrictivos como la cirugía bariátrica (Damms-Machado et al., 2015).

Este índice está muy relacionado a la obtención de energía por parte del huésped (Jumpertz

et al., 2011), donde se demostró que el phylum Firmicute favorece la extracción de energía de

la dieta. Este efecto reductor sobre este phylum fue mayor cuando suplementamos la RC con

la cepa CRL1446 a los 20 días, mientras que la cepa CRL431 indujo un efecto totalmente

opuesto, presentando los mayores niveles del índice F/B a los 20 días (Figura 42). Las


153

especies pertenecientes al phylum Firmicutes han demostrado una gran capacidad para

degradar polisacáridos de la dieta y favorecer la absorción de azúcares y otros metabolitos

(Krajmalnik-Brown et al., 2012; Flint et al., 2012) maximizando así el suministro de energía

proporcionada por la dieta (Jumpertz et al., 2011). A su vez este aumento en la extracción

de energía podría explicar el aumento de tamaño del TA inducido por esta cepa, y la

reducción inducida por CRL1446, modulando a su vez los niveles de adipoquinas

(principalmente leptina). Esto podría explicar en parte los cambios opuestos observados

sobre la ganancia de peso corporal en esos dos grupos (RC-CRL1446 y RC-CRL431),

mientras que la cepa CRL1434, si bien, no mostró grandes cambios sobre la estructura de la

microbiota intestinal comparada con el grupo RC, creemos que sus efectos están mediados

por su elevada capacidad inmunomoduladora evaluada in vitro y demostrada, además, in

vivo, con aumentos principalmente de los niveles de IL-10.

Analizando la composición de la MI a nivel de género, observamos que La RC promovió

significativamente la abundancia de dos géneros principalmente, Lactobacillus y

Bifidobacterium, en el intestino de los ratones (Figura 41). En este sentido, Zhang et al. (Zhang

et al., 2013), informaron que la dieta RC enriquece la microbiota intestinal con filotipos que

se correlacionan positivamente con la vida media, por ejemplo, el género Lactobacillus, y una

disminución de los que se correlacionan negativamente, tales como patógenos oportunistas.

En este contexto nosotros observamos un efecto similar inducido por la dieta RC, que mostró

una gran reducción de dos filotipos asociados con patógenos como TM7 y Proteobacteria.

Además del aumento del género Lactobacillus. Nuestros resultados corroboran el aumento

de Lactobacillus por la RC, pero además, demuestran que la suplementación con la cepa

CRL431 (RC-CRL431) induce mayores niveles de este género tanto a los 20 como 45 días, y

que, la suplementación con la cepa CRL1446 (RC-CRL1446) fue el único tratamiento dietario

capaz de mantener los niveles de este género constante en el tiempo, ya que para todos los

grupos restantes este género se redujo con el paso del tiempo.

Otro efecto interesante de la RC fue el aumento del género Bifidobacterium, algo que no se

había reportado hasta el momento para la RC, sin embargo, fue la suplementación con la


154

cepa CRL1446 el tratamiento dietario que mostró el mayor efecto bifidogénico, llegando a

representar casi el 50% de la comunidad microbiana intestinal de dicho grupo a los 45 días.

Zhang et al. (Zhang et al., 2013) sugirieron, que en condiciones de disponibilidad de

nutrientes restringido, como ocurre en la RC, un individuo puede extraer nutrientes de

manera más eficiente de las proteínas y grasas, dejando una proporción de polisacáridos

vegetales indigeribles más abundante en relación a otras fuentes de energía, para el colon.

Esta afirmación podría explicar el aumento de la abundancia de bifidobacterias por RC,

debido al efecto bifidogénico reportado para la fibra dietética (Davis et al., 2011).

Los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium responsables de efectos beneficiosos sobre el

hospedador (Saez-Lara et al., 2015), podrían representar otro mecanismo por el cual la RC

extiende la vida media de un individuo, esto debido a su capacidad conocida, para inhibir

la adhesión de patógenos a la pared intestinal, proteger la alteración de la barrera intestinal,

mejorar el tránsito intestinal, entre otros .

De esta manera sugerimos que la suplementación de la RC con BL específicas, puede

modificar los efectos de la dieta sobre la microbiota intestinal y viceversa, reforzando la idea

de que una misma dieta puede impactar de manera diferente según la composición de la

microbiota intestinal del individuo (Power et al., 2014). Hasta el momento, este es el primer

estudio que informa un efecto bifidogénico asociado a la RC y aún mayor posterior a la

suplementación con BL. Aunque la base molecular de dicho efecto sigue sin dilucidar, si

este se deriva de la mayor disponibilidad relativa de fibra dietética en el colon o tal vez por

subproductos metabólicos que actúen como prebióticos. La RC suplementada con BL podría

representar un tratamiento eficaz para promover el crecimiento de bacterias beneficiosas,

que puede mejorar la función intestinal (Bernardeau et al., 2006).


155

Figura 43| Principales efectos ejercidos por la administración de las cepas Lactobacillus fermentum CRL1446 (CR-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (CR-CRL431), sobre la ganancia de peso corporal (GPC), la microbiota (MI), el tejido adiposo (TA), el sistema inmune (SI) y el metabolismo (ME), en un modelo de restricción calórica del 25 % (RC). Las flechas hacia arriba o hacia abajo representan aumento o reducción de un parámetro, respectivamente, y los colores representan a cada cepa, CRL1446 (verde), CRL1434 (naranja) y CRL431 (azul).

Capitulo III Efecto de BL adipomoduladoras en restricción calórica Conclusiones

156

Conclusiones Este estudio demuestra que la RC, el tiempo de tratamiento (20 - 45 días) y la

suplementación con BL, producen cambios en el perfil de la microbiota intestinal,

parámetros metabólicos e inmunológicos.

La suplementación con L. fermentum CRL1446 aumentó la abundancia relativa de

bifidobacterias y fue capaz de mantener el género Lactobacillus en el tiempo. Por otra parte,

esta cepa demostró poseer propiedades hipocolesterolémicas e hipoglucemiantes además

de inducir una disminución de leptina. No se caracteriza por poseer un perfil

inmunomodulador.

Lactobacillus casei CRL431 se caracterizó por favorecer el aumento Lactobacillus y aumentar

el índice F/B, con lo que mejoraría la absorción de nutrientes de la dieta, además de poseer

un perfil inmunomodulador. En este modelo, L. casei CRL431 restablece los valores de

glucosa disminuidos por la RC además de inducir un aumento de leptina.

Lactococcus lactis CRL1434 presentó mayor capacidad inmunomoduladora, sin afectar

significativamente la composición de la microbiota intestinal. Posee propiedades

hipoglucemiante e induce una disminución de leptina.

L. fermentum CRL1446 y Lactococcus lactis CRL1434 podrían ser cepas potencialmente

probióticas para corregir las alteraciones inmuno-metabólicas asociadas con la obesidad

mediante su capacidad adipomoduladora.

L. casei CRL431 es una cepa adecuada para utilizar en casos de desnutrición donde se

busca mejorar, la absorción de nutrientes y la protección frente a infecciones, además de

la estimulación del sistema inmune.

157

ConclusionesFinales

En este trabajo de Tesis Doctoral se puede evidenciar la importancia de la dieta como factor

fundamental en el mantenimiento de la homeostasis corporal o como desencadenante de

enfermedades metabólicas, a través de la MI, y la posibilidad de utilizar cepas probióticas

específicas, como una estrategia viable para minimizar o mejorar los cambios inducidos por

la dieta. Esto se puede ver claramente en la Figura 43, donde se representa la distribución

de los diferentes tratamientos dietarios utilizados en esta tesis, en función de la composición

de su MI. Con esto se observa en primer lugar que son las dietas (RC y DAG) las principales

responsables de los cambios (en sentido opuesto) de la MI, y en segundo lugar que la

suplementación con BL puede afectar el efecto de la dieta sobre la MI.

Figura 43| Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en métricas UniFrac Fast. Componentes en PC1, PC2 y PC3 se representan explicando casi 50 % de la variabilidad en forma combinada. Muestra la distribución de los diferentes tratamientos dietarios en función de la composición de la MI, cada grupo está representado por círculos de diferentes colores. Dieta estándar (DE), restricción calórica (RC) con y sin la suplementación de bacterias lácticas: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (CR-CRL1434) y Lactobacillus casei CRL431 (RC-CRL431). Dieta alta en grasas (DAG) con y sin la administración de BL: Lactobacillus fermentum CRL1446 (RC-CRL1446), Lactococus lactis CRL1434 (RC-CRL1434) y Lactobacilluscasei CRL431 (RC-CRL431) a los 20 (20D) y 45 (45D) días.

-0,20

-0,10

0,00

0,10

0,20

0,30

-0,30 -0,20 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40

PC3

–13

.4%

Var

iatio

n

PC1 - 43.7% VariationDERCRC + BL DAG

DAG 45D

DE 20D

CRL431 20D

DAG 20D

RC 20D

RC 45D

CRL1446 20D

CRL431 45DCRL1446 45D

DAG + BL

DE 45D

CRL1434 20DCRL1434 45D

CRL431 45D

CRL1446 20D

CRL1446 45DCRL431 20D

CRL1434 45D

CRL1434 20D

Establecer un proceso de selección de cepas con potencial probiótico para obesidad

representa un verdadero desafío, esto teniendo en cuenta el amplio abanico por el cual una

bacteria podría ejercer su efecto beneficioso, sin embargo, abordamos este compromiso

focalizándonos en la metainflamacion (inflamación de órganos metabólicos) asociada a la

obesidad como responsable del desarrollo de esta enfermedad y tomando a la leptina como

adipoquina central en este proceso.

En primer lugar, este trabajo nos permitió establecer el perfil inmuno- y adipo-

modulador de diferentes BL y poder, en base a los resultados obtenidos, seleccionar tres

cepas con características específicas que pudieran ser evaluadas in vivo; Lactobacillus

fermentum CRL1446, Lactobacillus casei CRL431 y Lactococus lactis CRL1434. La

capacidad adipomoduladora de estas BL no había sido estudiado hasta el momento y puede

representar uno de los posibles mecanismos de acción a la hora de ejercer sus efectos

benéficos.

Posteriormente, en la evaluación in vivo de las cepas seleccionadas, pudimos conocer

el comportamiento de cada una de ellas en presencia de dos dietas diferentes, una dieta de

restricción calórica (RC), y una dieta alta en grasas (DAG) durante 7 semanas. Los resultados

obtenidos revelaron un cambio significativo sobre la composición de la MI y la estructura y

funcionalidad del TA, así como sobre parámetros inmuno-metabólicos inducido por la

dieta. En este contexto las BL administradas conjuntamente con la dieta, modularon de

manera cepa dependiente, el efecto de la dieta, ya sea revirtiéndolo parcial o totalmente, o

acentuándolo.

Los cambios sobre la MI y el TA, repercutieron sobre parámetros metabólicos e

inmunológicos de los animales experimentales, destacándose CRL1446 y CRL1434 como

dos cepas prometedoras para prevenir o minimizar las alteraciones inmuno-metabólicas

asociadas a la obesidad y la dieta alta en grasas (DAG). CRL1446 también mostró efectos

interesantes combinada con la RC, con lo cual se la postula como una cepa candidata para

la elaboración de un alimento funcional con miras a prevenir el sobrepeso y la obesidad.

Esta cepa no sólo mantuvo las características deseables de la RC, sino que además añadió

efectos bifidogénicos, hipocolesterolémicos e hipoglucemiantes.

En cuanto a L. casei CRL431 mostró mejores características para utilizar en casos de

desnutrición donde se busca mejorar, la absorción de nutrientes y la protección frente a

infecciones. Si bien, CRL431 es ampliamente reconocida como probiótico, sus propiedades

adipomoduladoras no habían sido reportadas.

La comparación de los ensayos in vitro con los in vivo nos permitió observar que el

efecto adipomodulador determinado in vitro, no se puede extrapolar totalmente a los

estudios in vivo; sin embargo, podría reducir el amplio espectro de microrganismos con

potencial “anti-obesidad”. Mientras que CRL1434 y CRL1446, aumentaban o mantenían los

niveles de leptina, respectivamente, en el co-cultivo, en ambos modelos animales (RC y

DAG), redujeron significativamente los niveles de esta hormona. Esto demuestra el rol clave

de la MI sobre el perfil de adipoquinas, afectando principalmente la extracción de energía y

su almacenamiento en el TA, efecto difícil de evaluar de forma in vitro hasta el momento.

Con lo cual planteamos a este sistema de co-cultivo, paso previo a los estudios in vivo, como

un método de selección de cepas adipomoduladoras para el tratamiento y/o prevención de

enfermedades asociadas a la malnutrición.

Una bacteria no es la causa ni la solución del problema, pero entender los

mecanismos por los que las cepas probióticas contribuyen a reestablecer las alteraciones

inmuno-metabólicas y los cambios en la composición de la MI nos ayudaran a diseñar

métodos de screening más específicos y mejorar la selección de cepas que representen

nuevas alternativas prometedoras para contribuir en la lucha contra un problema de salud

mundial como la obesidad.

BL

Metabolismo

TA

Dieta

MI

Lactobacillus Fermentum CRL1446

CR 25%

Leptina

HFD 60%

Lactococcus lactis 1434

Lactobacillus casei CRL431

Proyecciones

163

Determinar la capacidad adipomoduladora de diferentes componentes de BL o medios condicionados por éstas, sobre adipocitos, para establecer que fragmentos de las bacterias ejercen el efecto adipomodulador, si es necesario la viabilidad de la mismas y si el efecto es diferente al de la bacteria completa.

Establecer mediante ensayos de compatibilidad entre Lactobacillus fermentum CRL1446 y diferentes cepas del género Bifidobacterium, para determinar un posible efecto bifidogénico o sinérgico en el crecimiento de ambos géneros.

Estudiar el efecto de las cepas seleccionas sobre la expresión de receptores toll-like en células intestinales y del tejido adiposo.

Poner en marcha un nuevo modelo de obesidad, con un tratamiento dietario que convine restricción calórica (RC) Y bacterias lácticas (BL), para procurar establecer la eficacia de dicha estrategia nutricional para revertir las alteraciones inmuno-metabólicas y establecer si existe un efecto sinérgico por la combinación de ambas.

Plantear un estudio clínico con Lactobacillus fermentum CRL1446 y/o Lactococcus lactis CRL1434 en pacientes con sobrepeso u obesidad, para corroborar los resultados obtenidos hasta el momento en modelos animales.

Iniciar el desarrollo de un alimento funcional, conteniendo la o las cepas en estudio, para prevenir la obesidad y contrarrestar el sobrepeso.

Proyecciones

Bibliografía

Bibliografia

165

Bibliografía

A

Abeijón Mukdsi, M. c., Gauffin Cano, M. p., González, S. n., and Medina, R. b. (2012a). Administration of Lactobacillus fermentum CRL1446 increases intestinal feruloyl esterase activity in mice. Lett. Appl. Microbiol. 54, 18–25.

Abeijón Mukdsi, M.C., Haro, C., González, S.N., and Medina, R.B. (2013a). Functional goat milk cheese with feruloyl esterase activity. J. Funct. Foods 5, 801–809.

Alastair, F., Emma, G., and Emma, P. (2011). Nutrition in Inflammatory Bowel Disease. J. Parenter. Enter. Nutr. 35, 571–580.

Amar, J., Chabo, C., Waget, A., Klopp, P., Vachoux, C., Bermúdez-Humarán, L.G., Smirnova, N., Bergé, M., Sulpice, T., Lahtinen, S., et al. (2011). Intestinal mucosal adherence and translocation of commensal bacteria at the early onset of type 2 diabetes: molecular mechanisms and probiotic treatment. EMBO Mol. Med. 3, 559–572.

Anderson, R.M., and Weindruch, R. (2010). Metabolic reprogramming, caloric restriction and aging. Trends Endocrinol. Metab. TEM 21, 134–141.

Andersson, U., Bränning, C., Ahrné, S., Molin, G., Alenfall, J., Onning, G., Nyman, M., and Holm, C. (2010). Probiotics lower plasma glucose in the high-fat fed C57BL/6J mouse. Benef. Microbes 1, 189–196.

Andreev, V.P., Paz-Filho, G., Wong, M.-L., and Licinio, J. (2009). Deconvolution of insulin secretion, insulin hepatic extraction post-hepatic delivery rates and sensitivity during 24-hour standardized meals: time course of glucose homeostasis in leptin replacement treatment. Horm. Metab. Res. Horm. Stoffwechselforschung Horm. Metab. 41, 142–151.

Antuna-Puente, B., Feve, B., Fellahi, S., and Bastard, J.-P. (2008). Adipokines: the missing link between insulin resistance and obesity. Diabetes Metab. 34, 2–11.

Arango Duque, G., and Descoteaux, A. (2014). Macrophage Cytokines: Involvement in Immunity and Infectious Diseases. Front. Immunol. 5.

Armougom, F., Henry, M., Vialettes, B., Raccah, D., and Raoult, D. (2009). Monitoring Bacterial Community of Human Gut Microbiota Reveals an Increase in Lactobacillus in Obese Patients and Methanogens in Anorexic Patients. PLOS ONE 4, e7125.

Ayina, C.N.A., Noubiap, J.J.N., Etoundi Ngoa, L.S., Boudou, P., Gautier, J.F., Mengnjo, M.K., Mbanya, J.C., and Sobngwi, E. (2016). Association of serum leptin and adiponectin with anthropomorphic indices of obesity, blood lipids and insulin resistance in a Sub-Saharan African population. Lipids Health Dis. 15.

Bibliografia

166

Aziz, Q., Doré, J., Emmanuel, A., Guarner, F., and Quigley, E.M.M. (2013). Gut microbiota and gastrointestinal health: current concepts and future directions. Neurogastroenterol. Motil. 25, 4–15.

B

Bäckhed, F., Ding, H., Wang, T., Hooper, L.V., Koh, G.Y., Nagy, A., Semenkovich, C.F., and Gordon, J.I. (2004a). The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15718–15723.

Bäckhed, F., Ley, R.E., Sonnenburg, J.L., Peterson, D.A., and Gordon, J.I. (2005). Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science 307, 1915–1920.

Bäckhed, F., Manchester, J.K., Semenkovich, C.F., and Gordon, J.I. (2007). Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 979–984.

Balasubashini, M.S., Rukkumani, R., and Menon, V.P. (2003). Protective effects of ferulic acid on hyperlipidemic diabetic rats. Acta Diabetol. 40, 118–122.

Bales, C.W., and Kraus, W.E. (2013). Caloric Restriction. J. Cardiopulm. Rehabil. Prev. 33, 201–208.

Barkhausen, T., Tschernig, T., Rosenstiel, P., van Griensven, M., Vonberg, R.-P., Dorsch, M., Mueller-Heine, A., Chalaris, A., Scheller, J., Rose-John, S., et al. (2011). Selective blockade of interleukin-6 trans-signaling improves survival in a murine polymicrobial sepsis model. Crit. Care Med. 39, 1407–1413.

Bastard, J.P., Jardel, C., Bruckert, E., Blondy, P., Capeau, J., Laville, M., Vidal, H., and Hainque, B. (2000). Elevated levels of interleukin 6 are reduced in serum and subcutaneous adipose tissue of obese women after weight loss. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, 3338–3342.

Bastard, J.-P., Lagathu, C., Caron, M., and Capeau, J. (2007). Point-counterpoint: Interleukin-6 does/does not have a beneficial role in insulin sensitivity and glucose homeostasis. J. Appl. Physiol. Bethesda Md 1985 102, 821–822; author reply 825.

Batra, A., Pietsch, J., Fedke, I., Glauben, R., Okur, B., Stroh, T., Zeitz, M., and Siegmund, B. (2007). Leptin-Dependent Toll-Like Receptor Expression and Responsiveness in Preadipocytes and Adipocytes. Am. J. Pathol. 170, 1931–1941.

Bernardeau, M., Guguen, M., and Vernoux, J.P. (2006). Beneficial lactobacilli in food and feed: long-term use, biodiversity and proposals for specific and realistic safety assessments. FEMS Microbiol. Rev. 30, 487–513.

Bernstein, R.L., Hyun, W.C., Davis, J.H., Fulwyler, M.J., and Pershadsingh, H.A. (1989). Flow cytometric analysis of mature adipocytes. Cytometry 10, 469–474.

Bibliografia

167

Beutler, B.A. (1999). The role of tumor necrosis factor in health and disease. J. Rheumatol. Suppl. 57, 16–21.

Bhathena, J., Martoni, C., Kulamarva, A., Urbanska, A.M., Malhotra, M., and Prakash, S. (2009). Orally Delivered Microencapsulated Live Probiotic Formulation Lowers Serum Lipids in Hypercholesterolemic Hamsters. J. Med. Food 12, 310–319.

Bleau, C., Lamontagne, L., and Savard, R. (2005a). New Lactobacillus acidophilus isolates reduce the release of leptin by murine adipocytes leading to lower interferon-γ production. Clin. Exp. Immunol. 140, 427–435.

Bleau, C., Lamontagne, L., and Savard, R. (2005c). New Lactobacillus acidophilus isolates reduce the release of leptin by murine adipocytes leading to lower interferon-gamma production. Clin Exp Immunol 140, 427–435.

Blüher, M. (2009). Adipose tissue dysfunction in obesity. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes Off. J. Ger. Soc. Endocrinol. Ger. Diabetes Assoc. 117, 241–250.

Blüher, M. (2012a). Clinical Relevance of Adipokines. Diabetes Metab. J. 36, 317–327.

Blüher, M. (2013). Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 27, 163–177.

Blüher, M. (2014). Adipokines – removing road blocks to obesity and diabetes therapy. Mol. Metab. 3, 230–240.

Blüher, M., and Mantzoros, C.S. (2015). From leptin to other adipokines in health and disease: Facts and expectations at the beginning of the 21st century. Metabolism 64, 131–145.

Blüher, M., Fasshauer, M., Tönjes, A., Kratzsch, J., Schön, M.R., and Paschke, R. (2005). Association of interleukin-6, C-reactive protein, interleukin-10 and adiponectin plasma concentrations with measures of obesity, insulin sensitivity and glucose metabolism. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes Off. J. Ger. Soc. Endocrinol. Ger. Diabetes Assoc. 113, 534–537.

Bokarewa, M., Bokarew, D., Hultgren, O., and Tarkowski, A. (2003). Leptin consumption in the inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 62, 952–956.

Bouchery, T., Kyle, R., Camberis, M., Shepherd, A., Filbey, K., Smith, A., Harvie, M., Painter, G., Johnston, K., Ferguson, P., et al. (2015). ILC2s and T cells cooperate to ensure maintenance of M2 macrophages for lung immunity against hookworms. Nat. Commun. 6, 6970.

Bravo, J.A., Julio-Pieper, M., Forsythe, P., Kunze, W., Dinan, T.G., Bienenstock, J., and Cryan, J.F. (2012). Communication between gastrointestinal bacteria and the nervous system. Curr. Opin. Pharmacol. 12, 667–672.

Bibliografia

168

Brown, K., DeCoffe, D., Molcan, E., and Gibson, D.L. (2012). Diet-Induced Dysbiosis of the Intestinal Microbiota and the Effects on Immunity and Disease. Nutrients 4, 1095–1119.

Burcelin, R., Serino, M., Chabo, C., Garidou, L., Pomié, C., Courtney, M., Amar, J., and Bouloumié, A. (2013). Metagenome and metabolism: the tissue microbiota hypothesis. Diabetes Obes. Metab. 15, 61–70.

Busso, N., So, A., Chobaz-Péclat, V., Morard, C., Martinez-Soria, E., Talabot-Ayer, D., and Gabay, C. (2002). Leptin Signaling Deficiency Impairs Humoral and Cellular Immune Responses and Attenuates Experimental Arthritis. J. Immunol. 168, 875–882.

C

Caesar, R., Tremaroli, V., Kovatcheva-Datchary, P., Cani, P.D., and Bäckhed, F. (2015). Crosstalk between Gut Microbiota and Dietary Lipids Aggravates WAT Inflammation through TLR Signaling. Cell Metab. 22, 658–668.

Caesar, R., Nygren, H., Orešič, M., and Bäckhed, F. (2016). Interaction between dietary lipids and gut microbiota regulates hepatic cholesterol metabolism. J. Lipid Res. 57, 474–481.

Calder, P.C. (2013). Feeding the immune system. Proc. Nutr. Soc. 72, 299–309.

Cani, P.D. (2014). Metabolism in 2013: The gut microbiota manages host metabolism. Nat. Rev. Endocrinol. 10, 74–76.

Cani, P.D., and Delzenne, N.M. (2009). Interplay between obesity and associated metabolic disorders: new insights into the gut microbiota. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 737–743.

Cani, P.D., and Everard, A. (2015). Talking microbes: When gut bacteria interact with diet and host organs. Mol. Nutr. Food Res. n/a-n/a.

Cani, P.D., Amar, J., Iglesias, M.A., Poggi, M., Knauf, C., Bastelica, D., Neyrinck, A.M., Fava, F., Tuohy, K.M., Chabo, C., et al. (2007a). Metabolic Endotoxemia Initiates Obesity and Insulin Resistance. Diabetes 56, 1761–1772.

Cani, P.D., Neyrinck, A.M., Fava, F., Knauf, C., Burcelin, R.G., Tuohy, K.M., Gibson, G.R., and Delzenne, N.M. (2007b). Selective increases of bifidobacteria in gut microflora improve high-fat-diet-induced diabetes in mice through a mechanism associated with endotoxaemia. Diabetologia 50, 2374–2383.

Cano, P.G., Santacruz, A., Trejo, F.M., and Sanz, Y. (2013a). Bifidobacterium CECT 7765 improves metabolic and immunological alterations associated with obesity in high-fat diet-fed mice. Obesity 21, 2310–2321.

Carding, S., Verbeke, K., Vipond, D.T., Corfe, B.M., and Owen, L.J. (2015). Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microb. Ecol. Health Dis. 26.

Bibliografia

169

Carswell, E.A., Old, L.J., Kassel, R.L., Green, S., Fiore, N., and Williamson, B. (1975). An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 3666–3670.

Carvalho, B.M., and Abdalla Saad, M.J. (2013). Influence of Gut Microbiota on Subclinical Inflammation and Insulin Resistance. Mediators Inflamm. 2013, 1–13.

Catalán, V., Gómez-Ambrosi, J., Rodríguez, A., Salvador, J., and Frühbeck, G. (2009). Adipokines in the treatment of diabetes mellitus and obesity. Expert Opin. Pharmacother. 10, 239–254.

Cavalcante-Silva, L.H.A., Galvão, J.G.F.M., da Silva, J.S. de F., de Sales-Neto, J.M., and Rodrigues-Mascarenhas, S. (2015). Obesity-Driven Gut Microbiota Inflammatory Pathways to Metabolic Syndrome. Front. Physiol. 6.

Cebra, J.J. (1999). Influences of microbiota on intestinal immune system development. Am. J. Clin. Nutr. 69, 1046S–1051S.

Ceddia, R.B., Koistinen, H.A., Zierath, J.R., and Sweeney, G. (2002). Analysis of paradoxical observations on the association between leptin and insulin resistance. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 16, 1163–1176.

Cerf-Bensussan, N., and Gaboriau-Routhiau, V. (2010). The immune system and the gut microbiota: friends or foes? Nat. Rev. Immunol. 10, 735–744.

Cerovic, V., Bain, C.C., Mowat, A.M., and Milling, S.W.F. (2014). Intestinal macrophages and dendritic cells: what’s the difference? Trends Immunol. 35, 270–277.

Cha, M.C., and Jones, P.J.H. (1998). Dietary fat type and energy restriction interactively influence plasma leptin concentration in rats. J. Lipid Res. 39, 1655–1660.

Chadban, S.J., Tesch, G.H., Foti, R., Lan, H.Y., Atkins, R.C., and Nikolic-Paterson, D.J. (1998). Interleukin-10 differentially modulates MHC class II expression by mesangial cells and macrophages in vitro and in vivo. Immunology 94, 72–78.

Chan, J.L., Blüher, S., Yiannakouris, N., Suchard, M.A., Kratzsch, J., and Mantzoros, C.S. (2002). Regulation of circulating soluble leptin receptor levels by gender, adiposity, sex steroids, and leptin: observational and interventional studies in humans. Diabetes 51, 2105–2112.

Chang, B.J., Park, S.U., Jang, Y.S., Ko, S.H., Joo, N.M., Kim, S.I., Kim, C.-H., and Chang, D.K. (2011). Effect of functional yogurt NY-YP901 in improving the trait of metabolic syndrome. Eur. J. Clin. Nutr. 65, 1250–1255.

Charo, I.F., Myers, S.J., Herman, A., Franci, C., Connolly, A.J., and Coughlin, S.R. (1994). Molecular cloning and functional expression of two monocyte chemoattractant protein 1

Bibliografia

170

receptors reveals alternative splicing of the carboxyl-terminal tails. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2752–2756.

Chatterjee, T.K., Stoll, L.L., Denning, G.M., Harrelson, A., Blomkalns, A.L., Idelman, G., Rothenberg, F.G., Neltner, B., Romig-Martin, S.A., Dickson, E.W., et al. (2009). Pro-inflammatory phenotype of perivascular adipocytes: influence of high fat feeding. Circ. Res. 104, 541–549.

Cheng, L., Yu, Y., Szabo, A., Wu, Y., Wang, H., Camer, D., and Huang, X.-F. (2015). Palmitic acid induces central leptin resistance and impairs hepatic glucose and lipid metabolism in male mice. J. Nutr. Biochem. 26, 541–548.

Cho, K.W., Morris, D.L., and Lumeng, C.N. (2014). Flow Cytometry Analyses of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 537, 297–314.

Choe, S.S., Huh, J.Y., Hwang, I.J., Kim, J.I., and Kim, J.B. (2016). Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Cell. Endocrinol. 30.

Cildir, G., Akıncılar, S.C., and Tergaonkar, V. (2013). Chronic adipose tissue inflammation: all immune cells on the stage. Trends Mol. Med. 19, 487–500.

Cipolletta, D., Feuerer, M., Li, A., Kamei, N., Lee, J., Shoelson, S.E., Benoist, C., and Mathis, D. (2012). PPARγ is a major driver of the accumulation and phenotype of adipose-tissue Treg cells. Nature 486, 549–553.

Colman, R.J., Anderson, R.M., Johnson, S.C., Kastman, E.K., Kosmatka, K.J., Beasley, T.M., Allison, D.B., Cruzen, C., Simmons, H.A., Kemnitz, J.W., et al. (2009). Caloric Restriction Delays Disease Onset and Mortality in Rhesus Monkeys. Science 325, 201–204.

Cook, K.S., Min, H.Y., Johnson, D., Chaplinsky, R.J., Flier, J.S., Hunt, C.R., and Spiegelman, B.M. (1987). Adipsin: a circulating serine protease homolog secreted by adipose tissue and sciatic nerve. Science 237, 402–405.

Cordain, L., Eaton, S.B., Sebastian, A., Mann, N., Lindeberg, S., Watkins, B.A., O’Keefe, J.H., and Brand-Miller, J. (2005). Origins and evolution of the Western diet: health implications for the 21st century. Am. J. Clin. Nutr. 81, 341–354.

Cotillard, A., Kennedy, S.P., Kong, L.C., Prifti, E., Pons, N., Le Chatelier, E., Almeida, M., Quinquis, B., Levenez, F., Galleron, N., et al. (2013). Dietary intervention impact on gut microbial gene richness. Nature 500, 585–588.

Covey, S.D., Wideman, R.D., McDonald, C., Unniappan, S., Huynh, F., Asadi, A., Speck, M., Webber, T., Chua, S.C., and Kieffer, T.J. (2006). The pancreatic beta cell is a key site for mediating the effects of leptin on glucose homeostasis. Cell Metab. 4, 291–302.

Bibliografia

171

Cox, L.M., and Blaser, M.J. (2013a). PATHWAYS IN MICROBE-INDUCED OBESITY. Cell Metab. 17, 883–894.

Cross, M.L., Ganner, A., Teilab, D., and Fray, L.M. (2004). Patterns of cytokine induction by gram-positive and gram-negative probiotic bacteria. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 42, 173–180.

Cunha, F.Q., Moncada, S., and Liew, F.Y. (1992). Interleukin-10 (IL-10) inhibits the induction of nitric oxide synthase by interferon-gamma in murine macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 182, 1155–1159.

Custodio, J., Elizathe, L., Murawski, B., and Rutsztein, G. (2015). Obesity in Argentina: a remaining challenge. Public health policies and prevalence rates. Rev. Mex. Trastor. Aliment. 6, 137–142.

D

Damms-Machado, A., Mitra, S., Schollenberger, A.E., Kramer, K.M., Meile, T., Königsrainer, A., Huson, D.H., and Bischoff, S.C. (2015). Effects of Surgical and Dietary Weight Loss Therapy for Obesity on Gut Microbiota Composition and Nutrient Absorption. BioMed Res. Int. 2015.

Dardeno, T.A., Chou, S.H., Moon, H.-S., Chamberland, J.P., Fiorenza, C.G., and Mantzoros, C.S. (2010). Leptin in Human Physiology and Therapeutics. Front. Neuroendocrinol. 31, 377–393.

Davis, L.M.G., Martínez, I., Walter, J., Goin, C., and Hutkins, R.W. (2011). Barcoded Pyrosequencing Reveals That Consumption of Galactooligosaccharides Results in a Highly Specific Bifidogenic Response in Humans. PLoS ONE 6.

De Rosa, V., Procaccini, C., Calì, G., Pirozzi, G., Fontana, S., Zappacosta, S., La Cava, A., and Matarese, G. (2007). A Key Role of Leptin in the Control of Regulatory T Cell Proliferation. Immunity 26, 241–255.

De Rosa, V., Galgani, M., Santopaolo, M., Colamatteo, A., Laccetti, R., and Matarese, G. (2015a). Nutritional control of immunity: Balancing the metabolic requirements with an appropriate immune function. Semin. Immunol.

Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., and Banchereau, J. (1992). Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175, 671–682.

Delzenne, N., and Reid, G. (2009). No causal link between obesity and probiotics. Nat. Rev. Microbiol. 7, 901–901.

Bibliografia

172

Delzenne, N.M., and Cani, P.D. (2011). Interaction Between Obesity and the Gut Microbiota: Relevance in Nutrition. Annu. Rev. Nutr. 31, 15–31.

Delzenne, N.M., Cani, P.D., Everard, A., Neyrinck, A.M., and Bindels, L.B. (2015). Gut microorganisms as promising targets for the management of type 2 diabetes. Diabetologia 58, 2206–2217.

Desruisseaux, M.S., Nagajyothi, Trujillo, M.E., Tanowitz, H.B., and Scherer, P.E. (2007). Adipocyte, Adipose Tissue, and Infectious Disease. Infect. Immun. 75, 1066–1078.

Devillard, E., McIntosh, F.M., Duncan, S.H., and Wallace, R.J. (2007). Metabolism of Linoleic Acid by Human Gut Bacteria: Different Routes for Biosynthesis of Conjugated Linoleic Acid. J. Bacteriol. 189, 2566–2570.

van Dielen, F.M., van’t Veer, C., Schols, A.M., Soeters, P.B., Buurman, W.A., and Greve, J.W. (2001). Increased leptin concentrations correlate with increased concentrations of inflammatory markers in morbidly obese individuals. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. J. Int. Assoc. Study Obes. 25, 1759–1766.

Do, G.-M., Oh, H.Y., Kwon, E., Cho, Y., Shin, S., Park, H.-J., Jeon, S.-M., Kim, E., Hur, C.-G., Park, T.-S., et al. (2011). Long-term adaptation of global transcription and metabolism in the liver of high-fat diet-fed C57BL/6J mice. Mol. Nutr. Food Res. 55 Suppl 2, S173-185.

Dogi, C.A., Galdeano, C.M., and Perdigón, G. (2008). Gut immune stimulation by non pathogenic Gram(+) and Gram(−) bacteria. Comparison with a probiotic strain. Cytokine 41, 223–231.

Dong, H., Rowland, I., Tuohy, K.M., Thomas, L.V., and Yaqoob, P. (2010). Selective effects of Lactobacillus casei Shirota on T cell activation, natural killer cell activity and cytokine production. Clin. Exp. Immunol. 161, 378–388.

Druart, C., Bindels, L.B., Schmaltz, R., Neyrinck, A.M., Cani, P.D., Walter, J., Ramer-Tait, A.E., and Delzenne, N.M. (2015a). Ability of the gut microbiota to produce PUFA-derived bacterial metabolites: Proof of concept in germ-free versus conventionalized mice. Mol. Nutr. Food Res. 59, 1603–1613.

Dunmore, S.J., and Brown, J.E.P. (2013). The role of adipokines in β-cell failure of type 2 diabetes. J. Endocrinol. 216, T37–T45.

DuPont, A.W., and DuPont, H.L. (2011). The intestinal microbiota and chronic disorders of the gut. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 8, 523–531.

E

Bibliografia

173

Eckburg, P.B., Bik, E.M., Bernstein, C.N., Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent, M., Gill, S.R., Nelson, K.E., and Relman, D.A. (2005). Diversity of the Human Intestinal Microbial Flora. Science 308, 1635–1638.

Edgar, R.C., Haas, B.J., Clemente, J.C., Quince, C., and Knight, R. (2011). UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinforma. Oxf. Engl. 27, 2194–2200.

Ehrlich, S.D. (2009). Probiotics – little evidence for a link to obesity. Nat. Rev. Microbiol. 7, 901–901.

Erejuwa, O.O., Sulaiman, S.A., and Wahab, M.S.A. (2014). Modulation of Gut Microbiota in the Management of Metabolic Disorders: The Prospects and Challenges. Int. J. Mol. Sci. 15, 4158–4188.

Esteve Ràfols, M. (2014). Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinol. Nutr. 61, 100–112.

Everard, A., Belzer, C., Geurts, L., Ouwerkerk, J.P., Druart, C., Bindels, L.B., Guiot, Y., Derrien, M., Muccioli, G.G., Delzenne, N.M., et al. (2013). Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 9066–9071.

Ewaschuk, J., Endersby, R., Thiel, D., Diaz, H., Backer, J., Ma, M., Churchill, T., and Madsen, K. (2007). Probiotic bacteria prevent hepatic damage and maintain colonic barrier function in a mouse model of sepsis. Hepatology 46, 841–850.

F

Faggioni, R., Feingold, K.R., and Grunfeld, C. (2001a). Leptin regulation of the immune response and the immunodeficiency of malnutrition. Faseb J 15, 2565–2571.

Fantuzzi, G. (2005). Adipose tissue, adipokines, and inflammation. J. Allergy Clin. Immunol. 115, 911–919.

Farnier, C., Krief, S., Blache, M., Diot-Dupuy, F., Mory, G., Ferre, P., and Bazin, R. (2003). Adipocyte functions are modulated by cell size change: potential involvement of an integrin/ERK signalling pathway. Int. J. Obes. 27, 1178–1186.

Farooqi, I.S., Jebb, S.A., Langmack, G., Lawrence, E., Cheetham, C.H., Prentice, A.M., Hughes, I.A., McCamish, M.A., and O’Rahilly, S. (1999). Effects of Recombinant Leptin Therapy in a Child with Congenital Leptin Deficiency. N. Engl. J. Med. 341, 879–884.

Farooqi, I.S., Matarese, G., Lord, G.M., Keogh, J.M., Lawrence, E., Agwu, C., Sanna, V., Jebb, S.A., Perna, F., Fontana, S., et al. (2002). Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. J. Clin. Invest. 110, 1093–1103.

Bibliografia

174

Fasshauer, M., and Blüher, M. (2015). Adipokines in health and disease. Trends Pharmacol. Sci. 36, 461–470.

Fernández-Riejos, P., Najib, S., Santos-Alvarez, J., Martín-Romero, C., Pérez-Pérez, A., González-Yanes, C., and Sánchez-Margalet, V. (2010). Role of leptin in the activation of immune cells. Mediators Inflamm. 2010, 568343.

Ferrante, A.W. (2013). The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes Obes. Metab. 15, 34–38.

Feuerer, M., Herrero, L., Cipolletta, D., Naaz, A., Wong, J., Nayer, A., Lee, J., Goldfine, A., Benoist, C., Shoelson, S., et al. (2009). Fat Treg cells: a liaison between the immune and metabolic systems. Nat. Med. 15, 930–939.

Fiorentino, D.F., Zlotnik, A., Mosmann, T.R., Howard, M., and O’Garra, A. (1991). IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J. Immunol. Baltim. Md 1950 147, 3815–3822.

Flint, H.J., Scott, K.P., Duncan, S.H., Louis, P., and Forano, E. (2012). Microbial degradation of complex carbohydrates in the gut. Gut Microbes 3, 289–306.

Fontana, L., Meyer, T.E., Klein, S., and Holloszy, J.O. (2004). Long-term calorie restriction is highly effective in reducing the risk for atherosclerosis in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 6659–6663.

Fontana, L., Klein, S., and Holloszy, J.O. (2010). Effects of long-term calorie restriction and endurance exercise on glucose tolerance, insulin action, and adipokine production. Age 32, 97–108.

Fujimura, K.E., Slusher, N.A., Cabana, M.D., and Lynch, S.V. (2010). Role of the gut microbiota in defining human health. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8, 435–454.

G

G De Palma, J.C. (2009). Pivotal Advance: Bifidobacteria and Gram-negative bacteria differentially influence immune responses in the proinflammatory milieu of celiac disease. J. Leukoc. Biol. 87, 765–778.

Galdeano, C.M., and Perdigón, G. (2006). The Probiotic Bacterium Lactobacillus casei Induces Activation of the Gut Mucosal Immune System through Innate Immunity. Clin. Vaccine Immunol. 13, 219–226.

Galgani, M., De Rosa, V., and Matarese, G. (2015). T cell metabolism and susceptibility to autoimmune diseases. Mol. Immunol. 68, 558–563.

Bibliografia

175

Ganapathy, V., Thangaraju, M., Prasad, P.D., Martin, P.M., and Singh, N. (2013). Transporters and receptors for short-chain fatty acids as the molecular link between colonic bacteria and the host. Curr. Opin. Pharmacol. 13, 869–874.

Gauffin, C.P., Aguero, G., and Perdigon, G. (2002a). Adjuvant effects of Lactobacillus casei added to a renutrition diet in a malnourished mouse model. Biocell 26, 35–48.

Gauffin Cano, P., and Perdigon, G. (2003). Probiotics induce resistance to enteropathogens in a re-nourished mouse model. J Dairy Res 70, 433–440.

Gauffin Cano, P., Santacruz, A., Trejo, F.M., and Sanz, Y. (2013). Bifidobacterium CECT 7765 improves metabolic and immunological alterations associated with obesity in high-fat diet fed mice. Obesity 21, 2310–2321.

Gérard, P. (2013). Metabolism of Cholesterol and Bile Acids by the Gut Microbiota. Pathogens 3, 14–24.

Gerez, C.L., Torres, M.J., de Valdez, G.F., and Rollán, G. (2013). Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria. Biol. Control 64, 231–237.

Gerner, R.R., Wieser, V., Moschen, A.R., and Tilg, H. (2013). Metabolic inflammation: role of cytokines in the crosstalk between adipose tissue and liver. Can. J. Physiol. Pharmacol. 91, 867–872.

Glass, C.K., and Olefsky, J.M. (2012). INFLAMMATION AND LIPID SIGNALING IN THE ETIOLOGY OF INSULIN RESISTANCE. Cell Metab. 15, 635–645.

Gómez, F., Ramos Galvan, R., Frenk, S., Cravioto Muñoz, J., Chávez, R., and Vázquez, J. (2000). Mortality in second and third degree malnutrition. 1956. Bull. World Health Organ. 78, 1275–1280.

Granato, D., Branco, G.F., Nazzaro, F., Cruz, A.G., and Faria, J.A.F. (2010). Functional Foods and Nondairy Probiotic Food Development: Trends, Concepts, and Products. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 9, 292–302.

Grant, R.W., and Dixit, V.D. (2015). Adipose tissue as an immunological organ. Obesity 23, 512–518.

Griffin, G.K., Newton, G., Tarrio, M.L., Bu, D., Maganto-Garcia, E., Azcutia, V., Alcaide, P., Grabie, N., Luscinskas, F.W., Croce, K.J., et al. (2012). IL-17 and TNF-α sustain neutrophil recruitment during inflammation through synergistic effects on endothelial activation. J. Immunol. Baltim. Md 1950 188, 6287–6299.

H

Bibliografia

176

Hajer, G.R., Haeften, T.W. van, and Visseren, F.L.J. (2008). Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. Eur. Heart J. 29, 2959–2971.

Halaas, J.L., Gajiwala, K.S., Maffei, M., Cohen, S.L., Chait, B.T., Rabinowitz, D., Lallone, R.L., Burley, S.K., and Friedman, J.M. (1995). Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science 269, 543–546.

Harley, I.T.W., and Karp, C.L. (2012). Obesity and the gut microbiome: Striving for causality. Mol. Metab. 1, 21–31.

Harman-Boehm, I., Blüher, M., Redel, H., Sion-Vardy, N., Ovadia, S., Avinoach, E., Shai, I., Klöting, N., Stumvoll, M., Bashan, N., et al. (2007). Macrophage infiltration into omental versus subcutaneous fat across different populations: effect of regional adiposity and the comorbidities of obesity. J. Clin. Endocrinol. Metab. 92, 2240–2247.

Heilbronn, L.K., and Campbell, L.V. (2008). Adipose tissue macrophages, low grade inflammation and insulin resistance in human obesity. Curr. Pharm. Des. 14, 1225–1230.

Herrera, M., Salva, S., Villena, J., Barbieri, N., Marranzino, G., and Alvarez, S. (2014). Dietary Supplementation with Lactobacilli Improves Emergency Granulopoiesis in Protein-Malnourished Mice and Enhances Respiratory Innate Immune Response. PLoS ONE 9.

Hildebrandt, M.A., Hoffmann, C., Sherrill-Mix, S.A., Keilbaugh, S.A., Hamady, M., Chen, Y.-Y., Knight, R., Ahima, R.S., Bushman, F., and Wu, G.D. (2009). High-fat diet determines the composition of the murine gut microbiome independently of obesity. Gastroenterology 137, 1716-1724-2.

Hoffmann, A., Kralisch, S., Duhring, S., Ebert, T., Jeromin, F., Kloting, N., Bluher, M., Burckhardt, R., and Fasshauer, M. (2014). Effects of leptin on macrophages in vivo. Atherosclerosis 235, e194.

Hoggard, N., Mercer, J.G., Rayner, D.V., Moar, K., Trayhurn, P., and Williams, L.M. (1997). Localization of leptin receptor mRNA splice variants in murine peripheral tissues by RT-PCR and in situ hybridization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 232, 383–387.

Holliday, R. (1989). Food, reproduction and L’ongevity: Is the extended lifespan of calorie-restricted animals an evolutionary adaptation? BioEssays 10, 125–127.

Hooper, L.V., and Macpherson, A.J. (2010). Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat. Rev. Immunol. 10, 159–169.

Hooper, L.V., Wong, M.H., Thelin, A., Hansson, L., Falk, P.G., and Gordon, J.I. (2001). Molecular Analysis of Commensal Host-Microbial Relationships in the Intestine. Science 291, 881–884.

Bibliografia

177

Hooper, L.V., Midtvedt, T., and Gordon, J.I. (2002). How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine. Annu. Rev. Nutr. 22, 283–307.

Houde, A.-A., Légaré, C., Biron, S., Lescelleur, O., Biertho, L., Marceau, S., Tchernof, A., Vohl, M.-C., Hivert, M.-F., and Bouchard, L. (2015). Leptin and adiponectin DNA methylation levels in adipose tissues and blood cells are associated with BMI, waist girth and LDL-cholesterol levels in severely obese men and women. BMC Med. Genet. 16.

Howard, J.K., Lord, G.M., Matarese, G., Vendetti, S., Ghatei, M.A., Ritter, M.A., Lechler, R.I., and Bloom, S.R. (1999). Leptin protects mice from starvation-induced lymphoid atrophy and increases thymic cellularity in ob/ob mice. J. Clin. Invest. 104, 1051–1059.

Huh, J.Y., Park, Y.J., Ham, M., and Kim, J.B. (2014). Crosstalk between Adipocytes and Immune Cells in Adipose Tissue Inflammation and Metabolic Dysregulation in Obesity. Mol. Cells 37, 365–371.

Hurst, S.M., Wilkinson, T.S., McLoughlin, R.M., Jones, S., Horiuchi, S., Yamamoto, N., Rose-John, S., Fuller, G.M., Topley, N., and Jones, S.A. (2001). Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity 14, 705–714.

J

Jaedicke, K.M., Roythorne, A., Padget, K., Todryk, S., Preshaw, P.M., and Taylor, J.J. (2013). Leptin up-regulates TLR2 in human monocytes. J. Leukoc. Biol. 93, 561–571.

Jiang, W., Wu, N., Wang, X., Chi, Y., Zhang, Y., Qiu, X., Hu, Y., Li, J., and Liu, Y. (2015). Dysbiosis gut microbiota associated with inflammation and impaired mucosal immune function in intestine of humans with non-alcoholic fatty liver disease. Sci. Rep. 5, 8096.

Juarez, G.E., Villena, J., Salva, S., de Valdez, G.F., and Rodriguez, A.V. (2013). Lactobacillus reuteri CRL1101 beneficially modulate lipopolysaccharide-mediated inflammatory response in a mouse model of endotoxic shock. J. Funct. Foods 5, 1761–1773.

Jumpertz, R., Le, D.S., Turnbaugh, P.J., Trinidad, C., Bogardus, C., Gordon, J.I., and Krakoff, J. (2011a). Energy-balance studies reveal associations between gut microbes, caloric load, and nutrient absorption in humans123. Am. J. Clin. Nutr. 94, 58–65.

Jung, S.H., Park, H.S., Kim, K.-S., Choi, W.H., Ahn, C.W., Kim, B.T., Kim, S.M., Lee, S.Y., Ahn, S.M., Kim, Y.K., et al. (2008). Effect of weight loss on some serum cytokines in human obesity: increase in IL-10 after weight loss. J. Nutr. Biochem. 19, 371–375.

K

Kälin, S., Heppner, F.L., Bechmann, I., Prinz, M., Tschöp, M.H., and Yi, C.-X. (2015). Hypothalamic innate immune reaction in obesity. Nat. Rev. Endocrinol. 11, 339–351.

Bibliografia

178

Kanda, H., Tateya, S., Tamori, Y., Kotani, K., Hiasa, K., Kitazawa, R., Kitazawa, S., Miyachi, H., Maeda, S., Egashira, K., et al. (2006). MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. J. Clin. Invest. 116, 1494–1505.

Kang, J.-H., Yun, S.-I., and Park, H.-O. (2010). Effects of Lactobacillus gasseri BNR17 on body weight and adipose tissue mass in diet-induced overweight rats. J. Microbiol. Seoul Korea 48, 712–714.

Kern, P.A., Ranganathan, S., Li, C., Wood, L., and Ranganathan, G. (2001). Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin resistance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 280, E745-751.

Keusch, G.T. (2003). The History of Nutrition: Malnutrition, Infection and Immunity. J. Nutr. 133, 336S–340S.

Kobyliak, N., Conte, C., Cammarota, G., Haley, A.P., Styriak, I., Gaspar, L., Fusek, J., Rodrigo, L., and Kruzliak, P. (2016). Probiotics in prevention and treatment of obesity: a critical view. Nutr. Metab. 13, 14.

Koppel, N., and Balskus, E.P. (2016). Exploring and Understanding the Biochemical Diversity of the Human Microbiota. Cell Chem. Biol. 23, 18–30.

Kosteli, A., Sugaru, E., Haemmerle, G., Martin, J.F., Lei, J., Zechner, R., and Ferrante, A.W. (2010). Weight loss and lipolysis promote a dynamic immune response in murine adipose tissue. J. Clin. Invest. 120, 3466–3479.

Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z.-E., Kang, D.-W., and DiBaise, J.K. (2012). Effects of Gut Microbes on Nutrient Absorption and Energy Regulation. Nutr. Clin. Pract. Off. Publ. Am. Soc. Parenter. Enter. Nutr. 27, 201–214.

Kratz, M., von Eckardstein, A., Fobker, M., Buyken, A., Posny, N., Schulte, H., Assmann, G., and Wahrburg, U. (2002). The Impact of Dietary Fat Composition on Serum Leptin Concentrations in Healthy Nonobese Men and Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 5008–5014.

Kredel, L.I., and Siegmund, B. (2014). Adipose-Tissue and Intestinal Inflammation – Visceral Obesity and Creeping Fat. Front. Immunol. 5.

Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S. (2011). Pathogen Recognition by the Innate Immune System. Int. Rev. Immunol. 30, 16–34.

Kusunoki, H., Taniyama, Y., Otsu, R., Rakugi, H., and Morishita, R. (2014). Anti-inflammatory effects of hepatocyte growth factor on the vicious cycle of macrophages and adipocytes. Hypertens. Res. 37, 500–506.

Bibliografia

179

L

La Cava, A., Alviggi, C., and Matarese, G. (2004). Unraveling the multiple roles of leptin in inflammation and autoimmunity. J Mol Med Berl 82, 4–11.

Lakhan, S.E., and Kirchgessner, A. (2011). Gut microbiota and sirtuins in obesity-related inflammation and bowel dysfunction. J. Transl. Med. 9, 202.

Le Chatelier, E., Nielsen, T., Qin, J., Prifti, E., Hildebrand, F., Falony, G., Almeida, M., Arumugam, M., Batto, J.-M., Kennedy, S., et al. (2013). Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers. Nature 500, 541–546.

Lean, M.E.J., and Malkova, D. (2015). Altered gut and adipose tissue hormones in overweight and obese individuals: cause or consequence? Int. J. Obes. 2005.

LeBlanc, J.G., Milani, C., de Giori, G.S., Sesma, F., van Sinderen, D., and Ventura, M. (2013). Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 160–168.

de LeBlanc Ade, M., Castillo, N.A., and Perdigon, G. (2010). Anti-infective mechanisms induced by a probiotic Lactobacillus strain against Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Int J Food Microbiol 138, 223–231.

Lee, B.-C., and Lee, J. (2014). Cellular and Molecular Players in Adipose Tissue Inflammation in the Development of Obesity-induced Insulin Resistance. Biochim. Biophys. Acta 1842, 446–462.

Lehr, S., Hartwig, S., Lamers, D., Famulla, S., Müller, S., Hanisch, F.-G., Cuvelier, C., Ruige, J., Eckardt, K., Ouwens, D.M., et al. (2012). Identification and Validation of Novel Adipokines Released from Primary Human Adipocytes. Mol. Cell. Proteomics MCP 11.

Ley, R.E., Bäckhed, F., Turnbaugh, P., Lozupone, C.A., Knight, R.D., and Gordon, J.I. (2005). Obesity alters gut microbial ecology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 11070–11075.

Ley, R.E., Turnbaugh, P.J., Klein, S., and Gordon, J.I. (2006). Microbial ecology: Human gut microbes associated with obesity. Nature 444, 1022–1023.

Lillford, P.J. (2016). The impact of food structure on taste and digestibility. Food Funct. 7, 4131–4136.

Lin, H.V., Frassetto, A., Jr, E.J.K., Nawrocki, A.R., Lu, M.M., Kosinski, J.R., Hubert, J.A., Szeto, D., Yao, X., Forrest, G., et al. (2012). Butyrate and Propionate Protect against Diet-Induced Obesity and Regulate Gut Hormones via Free Fatty Acid Receptor 3-Independent Mechanisms. PLOS ONE 7, e35240.

Bibliografia

180

Lluch, J., Servant, F., Païssé, S., Valle, C., Valière, S., Kuchly, C., Vilchez, G., Donnadieu, C., Courtney, M., Burcelin, R., et al. (2015). The Characterization of Novel Tissue Microbiota Using an Optimized 16S Metagenomic Sequencing Pipeline. PLoS ONE 10, e0142334.

Louis, S., Tappu, R.-M., Damms-Machado, A., Huson, D.H., and Bischoff, S.C. (2016). Characterization of the Gut Microbial Community of Obese Patients Following a Weight-Loss Intervention Using Whole Metagenome Shotgun Sequencing. PLoS ONE 11.

Lozupone, C., Lladser, M.E., Knights, D., Stombaugh, J., and Knight, R. (2011). UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME J. 5, 169–172.

Lumeng, C.N. (2013). Innate Immune Activation in Obesity. Mol. Aspects Med. 34, 12–29.

M

Maachi, M., Piéroni, L., Bruckert, E., Jardel, C., Fellahi, S., Hainque, B., Capeau, J., and Bastard, J.-P. (2004). Systemic low-grade inflammation is related to both circulating and adipose tissue TNFα, leptin and IL-6 levels in obese women. Int. J. Obes. 28, 993–997.

Magoč, T., and Salzberg, S.L. (2011). FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinforma. Oxf. Engl. 27, 2957–2963.

Man, D., C, J., Rogosa, M., and Sharpe, M.E. (1960). A MEDIUM FOR THE CULTIVATION OF LACTOBACILLI. J. Appl. Microbiol. 23, 130–135.

Mancuso, P., Gottschalk, A., Phare, S.M., Peters-Golden, M., Lukacs, N.W., and Huffnagle, G.B. (2002). Leptin-Deficient Mice Exhibit Impaired Host Defense in Gram-Negative Pneumonia. J. Immunol. 168, 4018–4024.

Manna, P., and Jain, S.K. (2015). Obesity, Oxidative Stress, Adipose Tissue Dysfunction, and the Associated Health Risks: Causes and Therapeutic Strategies. Metab. Syndr. Relat. Disord. 13, 423–444.

Mantzoros, C.S., Moschos, S., Avramopoulos, I., Kaklamani, V., Liolios, A., Doulgerakis, D.E., Griveas, I., Katsilambros, N., and Flier, J.S. (1997). Leptin Concentrations in Relation to Body Mass Index and the Tumor Necrosis Factor-α System in Humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3408–3413.

Mantzoros, C.S., Magkos, F., Brinkoetter, M., Sienkiewicz, E., Dardeno, T.A., Kim, S.-Y., Hamnvik, O.-P.R., and Koniaris, A. (2011). Leptin in human physiology and pathophysiology. Am. J. Physiol. - Endocrinol. Metab. 301, E567–E584.

Marranzino, G., Villena, J., Salva, S., and Alvarez, S. (2012). Stimulation of macrophages by immunobiotic Lactobacillus strains: influence beyond the intestinal tract. Microbiol. Immunol. 56, 771–781.

Bibliografia

181

Martens, E.C., Chiang, H.C., and Gordon, J.I. (2008). Mucosal Glycan Foraging Enhances Fitness and Transmission of a Saccharolytic Human Gut Bacterial Symbiont. Cell Host Microbe 4, 447–457.

Martí, A., Marcos, A., and Martínez, J.A. (2001). Obesity and immune function relationships. Obes. Rev. 2, 131–140.

Martín-Romero, C., Santos-Alvarez, J., Goberna, R., and Sánchez-Margalet, V. (2000). Human leptin enhances activation and proliferation of human circulating T lymphocytes. Cell. Immunol. 199, 15–24.

Masoro, E.J. (2009). Caloric restriction-induced life extension of rats and mice: A critique of proposed mechanisms. Biochim. Biophys. Acta BBA - Gen. Subj. 1790, 1040–1048.

Matarese, G., Giacomo, A.D., Sanna, V., Lord, G.M., Howard, J.K., Tuoro, A.D., Bloom, S.R., Lechler, R.I., Zappacosta, S., and Fontana, S. (2001). Requirement for Leptin in the Induction and Progression of Autoimmune Encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5909–5916.

Matarese, G., Moschos, S., and Mantzoros, C.S. (2005). Leptin in Immunology. J. Immunol. 174, 3137–3142.

Matarese, G., Procaccini, C., and De Rosa, V. (2012). At the crossroad of T cells, adipose tissue, and diabetes. Immunol. Rev. 249, 116–134.

Matsushima, K., Larsen, C.G., DuBois, G.C., and Oppenheim, J.J. (1989). Purification and characterization of a novel monocyte chemotactic and activating factor produced by a human myelomonocytic cell line. J. Exp. Med. 169, 1485–1490.

Matthews, V.B., Allen, T.L., Risis, S., Chan, M.H.S., Henstridge, D.C., Watson, N., Zaffino, L.A., Babb, J.R., Boon, J., Meikle, P.J., et al. (2010). Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia 53, 2431–2441.

McArdle, M.A., Finucane, O.M., Connaughton, R.M., McMorrow, A.M., and Roche, H.M. (2013). Mechanisms of Obesity-Induced Inflammation and Insulin Resistance: Insights into the Emerging Role of Nutritional Strategies. Front. Endocrinol. 4.

McMullen, M.H., Hamilton-Reeves, J.M., Bonorden, M.J., Wangen, K.E., Phipps, W.R., Feirtag, J.M., and Kurzer, M.S. (2006). Consumption of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium longum does not alter phytoestrogen metabolism and plasma hormones in men: a pilot study. J Altern Complement Med 12, 887–894.

Medina, R.B., Oliszewski, R., Abeijón Mukdsi, M.C., Van Nieuwenhove, C.P., and González, S.N. (2011). Sheep and goat’s dairy products from South America: Microbiota and its metabolic activity. Small Rumin. Res. 101, 84–91.

Bibliografia

182

Michaud, A., Drolet, R., Noël, S., Paris, G., and Tchernof, A. (2012). Visceral fat accumulation is an indicator of adipose tissue macrophage infiltration in women. Metabolism 61, 689–698.

Minervini, F., and De Angelis, M. (2016). Editorial: Microorganisms for Functional Food. Front. Microbiol. 7.

Miyazawa, K., He, F., Yoda, K., and Hiramatsu, M. (2012). Potent effects of, and mechanisms for, modification of crosstalk between macrophages and adipocytes by lactobacilli. Microbiol. Immunol. 56, 847–854.

Molofsky, A.B., Nussbaum, J.C., Liang, H.-E., Dyken, S.J.V., Cheng, L.E., Mohapatra, A., Chawla, A., and Locksley, R.M. (2013). Innate lymphoid type 2 cells sustain visceral adipose tissue eosinophils and alternatively activated macrophages. J. Exp. Med. 210, 535–549.

Morris, D.L., Singer, K., and Lumeng, C.N. (2011). Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 14, 341–346.

Moschen, A.R., Wieser, V., and Tilg, H. (2012). Dietary Factors: Major Regulators of the Gut’s Microbiota. Gut Liver 6, 411–416.

Mosser, D.M., and Zhang, X. (2008). Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol. Rev. 226, 205–218.

Moya-Pérez, A., Neef, A., and Sanz, Y. (2015). Bifidobacterium pseudocatenulatum CECT 7765 Reduces Obesity-Associated Inflammation by Restoring the Lymphocyte-Macrophage Balance and Gut Microbiota Structure in High-Fat Diet-Fed Mice. PLoS ONE 10.

Mraz, M., and Haluzik, M. (2014a). The role of adipose tissue immune cells in obesity and low-grade inflammation. J. Endocrinol. 222, R113–R127.

Mukdsi, M.C.A., Cano, M.P.G., González, S.N., and Medina, R.B. (2012). Administration of Lactobacillus fermentum CRL1446 increases intestinal feruloyl esterase activity in mice. Lett. Appl. Microbiol. 54, 18–25.

N

Nakata, M., Yamamoto, S., Okada, T., Gantulga, D., Okano, H., Ozawa, K., and Yada, T. (2016). IL-10 gene transfer upregulates arcuate POMC and ameliorates hyperphagia, obesity and diabetes by substituting for leptin. Int. J. Obes. 40, 425–433.

Neels, J.G., and Olefsky, J.M. (2006). Inflamed fat: what starts the fire? J. Clin. Invest. 116, 33–35.

Ng, M., Fleming, T., Robinson, M., Thomson, B., Graetz, N., Margono, C., Mullany, E.C., Biryukov, S., Abbafati, C., Abera, S.F., et al. (2014a). Global, regional and national prevalence

Bibliografia

183

of overweight and obesity in children and adults 1980-2013: A systematic analysis. Lancet Lond. Engl. 384, 766–781.

Nishimoto, N., and Kishimoto, T. (2004). Inhibition of IL-6 for the treatment of inflammatory diseases. Curr. Opin. Pharmacol. 4, 386–391.

Novotny Núñez, I., Maldonado Galdeano, C., de Moreno de LeBlanc, A., and Perdigón, G. (2015). Lactobacillus casei CRL 431 administration decreases inflammatory cytokines in a diet-induced obese mouse model. Nutr. Burbank Los Angel. Cty. Calif 31, 1000–1007.

Núñez, I.N., Galdeano, C.M., Carmuega, E., Weill, R., de Moreno de LeBlanc, A., and Perdigón, G. (2013). Effect of a probiotic fermented milk on the thymus in Balb/c mice under non-severe protein–energy malnutrition. Br. J. Nutr. 110, 500–508.

Núñez, I.N., Galdeano, C.M., de LeBlanc, A. de M., and Perdigón, G. (2014). Evaluation of immune response, microbiota, and blood markers after probiotic bacteria administration in obese mice induced by a high-fat diet. Nutr. Burbank Los Angel. Cty. Calif 30, 1423–1432.

O

Ojeda, P., Bobe, A., Dolan, K., Leone, V., and Martinez, K. (2015a). Nutritional modulation of gut microbiota — the impact on metabolic disease pathophysiology. J. Nutr. Biochem.

Oswald, I.P., Wynn, T.A., Sher, A., and James, S.L. (1992). Interleukin 10 inhibits macrophage microbicidal activity by blocking the endogenous production of tumor necrosis factor alpha required as a costimulatory factor for interferon gamma-induced activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 8676–8680.

Ouchi, N., Parker, J.L., Lugus, J.J., and Walsh, K. (2011). Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat. Rev. Immunol. 11, 85–97.

P

Palm, N.W., de Zoete, M.R., and Flavell, R.A. (2015). Immune-microbiota interactions in health and disease. Clin. Immunol. Orlando Fla 159, 122–127.

Papathanassoglou, E., El-Haschimi, K., Li, X.C., Matarese, G., Strom, T., and Mantzoros, C. (2006a). Leptin Receptor Expression and Signaling in Lymphocytes: Kinetics During Lymphocyte Activation, Role in Lymphocyte Survival, and Response to High Fat Diet in Mice. J. Immunol. 176, 7745–7752.

Parekh, P.J., Arusi, E., Vinik, A.I., and Johnson, D.A. (2014). The Role and Influence of Gut Microbiota in Pathogenesis and Management of Obesity and Metabolic Syndrome. Front. Endocrinol. 5.

Bibliografia

184

Park, J., Kim, M., Kang, S.G., Jannasch, A.H., Cooper, B., Patterson, J., and Kim, C.H. (2015). Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR–S6K pathway. Mucosal Immunol. 8, 80–93.

Petschow, B., Doré, J., Hibberd, P., Dinan, T., Reid, G., Blaser, M., Cani, P.D., Degnan, F.H., Foster, J., Gibson, G., et al. (2013). Probiotics, prebiotics, and the host microbiome: the science of translation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1306, 1–17.

Połka, J., Rebecchi, A., Pisacane, V., Morelli, L., and Puglisi, E. (2015). Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by high-throughput sequencing of 16S rRNA amplicons. Food Microbiol. 46, 342–356.

Power, S.E., O’Toole, P.W., Stanton, C., Ross, R.P., and Fitzgerald, G.F. (2014). Intestinal microbiota, diet and health. Br. J. Nutr. 111, 387–402.

Procaccini, C., De Rosa, V., Galgani, M., Carbone, F., La Rocca, C., Formisano, L., and Matarese, G. (2013). Role of Adipokines Signaling in the Modulation of T Cells Function. Front. Immunol. 4.

Q

Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K.S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T., et al. (2010). A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464, 59–65.

Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., Peplies, J., and Glöckner, F.O. (2013). The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Res. 41, D590-596.

R

Rabot, S., Membrez, M., Bruneau, A., Gérard, P., Harach, T., Moser, M., Raymond, F., Mansourian, R., and Chou, C.J. (2010). Germ-free C57BL/6J mice are resistant to high-fat-diet-induced insulin resistance and have altered cholesterol metabolism. FASEB J. 24, 4948–4959.

Raoult, D. (2008). Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631–634.

Raoult, D. (2009). Probiotics and obesity: a link? Nat. Rev. Microbiol. 7, 616.

Ravussin, E., and Smith, S.R. (2002). Increased Fat Intake, Impaired Fat Oxidation, and Failure of Fat Cell Proliferation Result in Ectopic Fat Storage, Insulin Resistance, and Type 2 Diabetes Mellitus. Ann. N. Y. Acad. Sci. 967, 363–378.

Bibliografia

185

Raybould, H.E. (2012). Gut microbiota, epithelial function and derangements in obesity. J. Physiol. 590, 441–446.

Reis, B.S., Lee, K., Fanok, M.H., Mascaraque, C., Amoury, M., Cohn, L., Rogoz, A., Dallner, O.S., Moraes-Vieira, P.M., Domingos, A.I., et al. (2015). Leptin receptor signaling in T cells is required for Th17 differentiation. J. Immunol. Baltim. Md 1950 194, 5253–5260.

Rezaee F (2013). Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders. J. Diabetes Metab. 1.

Rhee, S.H. (2011). Basic and translational understandings of microbial recognition by toll-like receptors in the intestine. J. Neurogastroenterol. Motil. 17, 28–34.

Roberfroid, M.B. (2000). Concepts and strategy of functional food science: the European perspective. Am. J. Clin. Nutr. 71, 1660S–4S; discussion 1674S–5S.

Robinson, E.A., Yoshimura, T., Leonard, E.J., Tanaka, S., Griffin, P.R., Shabanowitz, J., Hunt, D.F., and Appella, E. (1989). Complete amino acid sequence of a human monocyte chemoattractant, a putative mediator of cellular immune reactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 1850–1854.

Rodríguez, J.M., Murphy, K., Stanton, C., Ross, R.P., Kober, O.I., Juge, N., Avershina, E., Rudi, K., Narbad, A., Jenmalm, M.C., et al. (2015). The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microb. Ecol. Health Dis. 26.

Rooks, M.G., and Garrett, W.S. (2016). Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat. Rev. Immunol. 16, 341–352.

Rose, D.P., Komninou, D., and Stephenson, G.D. (2004). Obesity, adipocytokines, and insulin resistance in breast cancer. Obes. Rev. Off. J. Int. Assoc. Study Obes. 5, 153–165.

Roth, C.L., Kratz, M., Ralston, M.M., and Reinehr, T. (2011). Changes in adipose-derived inflammatory cytokines and chemokines after successful lifestyle intervention in obese children. Metabolism 60, 445–452.

Rousset, F., Garcia, E., Defrance, T., Péronne, C., Vezzio, N., Hsu, D.H., Kastelein, R., Moore, K.W., and Banchereau, J. (1992). Interleukin 10 is a potent growth and differentiation factor for activated human B lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1890–1893.

Russo, M., Fabersani, E., Abeijón-Mukdsi, M.C., Ross, R., Fontana, C., Benítez-Páez, A., Gauffin-Cano, P., and Medina, R.B. (2016a). Lactobacillus fermentum CRL1446 Ameliorates Oxidative and Metabolic Parameters by Increasing Intestinal Feruloyl Esterase Activity and Modulating Microbiota in Caloric-Restricted Mice. Nutrients 8.

S

Bibliografia

186

Saez-Lara, M.J., Gomez-Llorente, C., Plaza-Diaz, J., and Gil, A. (2015). The Role of Probiotic Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria in the Prevention and Treatment of Inflammatory Bowel Disease and Other Related Diseases: A Systematic Review of Randomized Human Clinical Trials. BioMed Res. Int. 2015, e505878.

Sahin-Efe, A., Katsikeris, F., and Mantzoros, C.S. (2012). Advances in adipokines. Metabolism 61, 1659–1665.

Salcedo, R., Ponce, M.L., Young, H.A., Wasserman, K., Ward, J.M., Kleinman, H.K., Oppenheim, J.J., and Murphy, W.J. (2000). Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1: direct role of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression. Blood 96, 34–40.

Salminen, S., and Wright, A. von (2004). Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition (CRC Press).

Sam, S., and Mazzone, T. (2014a). Adipose Tissue Changes in Obesity and the Impact on Metabolic Function. Transl. Res.

Samaras, K., Botelho, N.K., Chisholm, D.J., and Lord, R.V. (2010). Subcutaneous and Visceral Adipose Tissue Gene Expression of Serum Adipokines That Predict Type 2 Diabetes. Obesity 18, 884–889.

Sanchez, M., Panahi, S., and Tremblay, A. (2015). Childhood Obesity: A Role for Gut Microbiota? Int. J. Environ. Res. Public. Health 12, 162–175.

Sanz, Y., Santacruz, A., and Gauffin, P. (2010). Gut microbiota in obesity and metabolic disorders. Proc. Nutr. Soc. 69, 434–441.

Sanz, Y., Rastmanesh, R., and Agostonic, C. (2013a). Understanding the role of gut microbes and probiotics in obesity: How far are we? Pharmacol. Res. 69, 144–155.

Sato, M., Uzu, K., Yoshida, T., Hamad, E.M., Kawakami, H., Matsuyama, H., Abd El-Gawad, I.A., and Imaizumi, K. (2008a). Effects of milk fermented by Lactobacillus gasseri SBT2055 on adipocyte size in rats. Br. J. Nutr. 99, 1013–1017.

Scarpace, P.J., and Zhang, Y. (2009). Leptin resistance: a prediposing factor for diet-induced obesity. Am. J. Physiol. - Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, R493–R500.

Scheller, J., Chalaris, A., Schmidt-Arras, D., and Rose-John, S. (2011). The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6. Biochim. Biophys. Acta 1813, 878–888.

Scherer, P.E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., and Lodish, H.F. (1995). A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J. Biol. Chem. 270, 26746–26749.

Bibliografia

187

Schloss, P.D., Westcott, S.L., Ryabin, T., Hall, J.R., Hartmann, M., Hollister, E.B., Lesniewski, R.A., Oakley, B.B., Parks, D.H., Robinson, C.J., et al. (2009). Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75, 7537–7541.

Schwiertz, A., Taras, D., Schäfer, K., Beijer, S., Bos, N.A., Donus, C., and Hardt, P.D. (2010). Microbiota and SCFA in lean and overweight healthy subjects. Obes. Silver Spring Md 18, 190–195.

Sekirov, I., Russell, S.L., Antunes, L.C.M., and Finlay, B.B. (2010). Gut microbiota in health and disease. Physiol. Rev. 90, 859–904.

Sera, N., Yokoyama, N., Abe, Y., Ide, A., Imaizumi, M., Usa, T., Tominaga, T., Ejima, E., Ashizawa, K., Ohmoto, Y., et al. (2000). Thyroid Hormones Influence Serum Leptin Levels in Patients with Graves’ Disease During Suppression of β-Adrenergic Receptors. Thyroid 10, 641–646.

Shapiro, A., Mu, W., Roncal, C., Cheng, K.-Y., Johnson, R.J., and Scarpace, P.J. (2008). Fructose-induced leptin resistance exacerbates weight gain in response to subsequent high-fat feeding. Am. J. Physiol. - Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R1370–R1375.

Shapiro, H., Lutaty, A., and Ariel, A. (2011). Macrophages, Meta-Inflammation, and Immuno-Metabolism. Sci. World J. 11, 2509–2529.

Shen, J., Obin, M.S., and Zhao, L. (2013). The gut microbiota, obesity and insulin resistance. Mol. Aspects Med. 34, 39–58.

Siegmund, B., Lear-Kaul, K.C., Faggioni, R., and Fantuzzi, G. (2002). Leptin deficiency, not obesity, protects mice from Con A-induced hepatitis. Eur. J. Immunol. 32, 552–560.

Siegrist, M., Stampfli, N., and Kastenholz, H. (2008). Consumers’ willingness to buy functional foods. The influence of carrier, benefit and trust. Appetite 51, 526–529.

Sieweke, M.H., and Allen, J.E. (2013). Beyond Stem Cells: Self-Renewal of Differentiated Macrophages. Science 342, 1242974.

Singh, U.P., Singh, N.P., Guan, H., Busbee, B., Price, R.L., Taub, D.D., Mishra, M.K., Fayad, R., Nagarkatti, M., and Nagarkatti, P.S. (2013). Leptin antagonist ameliorates chronic colitis in IL-10−/− mice. Immunobiology 218, 1439–1451.

Skurk, T., Alberti-Huber, C., Herder, C., and Hauner, H. (2007a). Relationship between Adipocyte Size and Adipokine Expression and Secretion. J. Clin. Endocrinol. Metab. 92, 1023–1033.

Bibliografia

188

Slack, E., Hapfelmeier, S., Stecher, B., Velykoredko, Y., Stoel, M., Lawson, M.A.E., Geuking, M.B., Beutler, B., Tedder, T.F., Hardt, W.-D., et al. (2009). Innate and Adaptive Immunity Cooperate Flexibly to Maintain Host-Microbiota Mutualism. Science 325, 617–620.

Sousa, R., Halper, J., Zhang, J., Lewis, S.J., and Li, W.I. (2008). Effect of Lactobacillus acidophilus supernatants on body weight and leptin expression in rats. BMC Complement Altern Med 8, 5.

Spindler, S.R. (2010). Caloric restriction: from soup to nuts. Ageing Res. Rev. 9, 324–353.

Stecher, B., Macpherson, A.J., Hapfelmeier, S., Kremer, M., Stallmach, T., and Hardt, W.-D. (2005). Comparison of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Colitis in Germfree Mice and Mice Pretreated with Streptomycin. Infect. Immun. 73, 3228–3241.

Suzuki, M., Tada, A., Kanmani, P., Watanabe, H., Aso, H., Suda, Y., Nochi, T., Miyazawa, K., Yoda, K., He, F., et al. (2015). Advanced Application of Porcine Intramuscular Adipocytes for Evaluating Anti-Adipogenic and Anti-Inflammatory Activities of Immunobiotics. PLOS ONE 10, e0119644.

T

Takaoka, M., Nagata, D., Kihara, S., Shimomura, I., Kimura, Y., Tabata, Y., Saito, Y., Nagai, R., and Sata, M. (2009). Periadventitial Adipose Tissue Plays a Critical Role in Vascular Remodeling. Circ. Res. 105, 906–911.

Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N., Culpepper, J., Devos, R., Richards, G.J., Campfield, L.A., Clark, F.T., Deeds, J., et al. (1995). Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 83, 1263–1271.

Terán, V., Pizarro, P.L., Zacarías, M.F., Vinderola, G., Medina, R., and Van Nieuwenhove, C. (2015). Production of conjugated dienoic and trienoic fatty acids by lactic acid bacteria and bifidobacteria. J. Funct. Foods 19, 417–425.

Thuny, F., Richet, H., Casalta, J.-P., Angelakis, E., Habib, G., and Raoult, D. (2010). Vancomycin Treatment of Infective Endocarditis Is Linked with Recently Acquired Obesity. PLOS ONE 5, e9074.

Tian, Z., Sun, R., Wei, H., and Gao, B. (2002). Impaired natural killer (NK) cell activity in leptin receptor deficient mice: leptin as a critical regulator in NK cell development and activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298, 297–302.

Tomaro-Duchesneau, C., Saha, S., Malhotra, M., Jones, M.L., Labbé, A., Rodes, L., Kahouli, I., and Prakash, S. (2013). Effect of orally administered L. fermentum NCIMB 5221 on markers of metabolic syndrome: an in vivo analysis using ZDF rats. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 115–126.

Bibliografia

189

Toshimitsu, T., Mochizuki, J., Ikegami, S., and Itou, H. (2016). Identification of a Lactobacillus plantarum strain that ameliorates chronic inflammation and metabolic disorders in obese and type 2 diabetic mice. J. Dairy Sci. 99, 933–946.

Trayhurn, P. (2013). Hypoxia and Adipose Tissue Function and Dysfunction in Obesity. Physiol. Rev. 93, 1–21.

Tsai, Y.-T., Cheng, P.-C., and Pan, T.-M. (2014). Anti-obesity effects of gut microbiota are associated with lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 1–10.

Turnbaugh, P.J., and Gordon, J.I. (2009). The core gut microbiome, energy balance and obesity. J. Physiol. 587, 4153–4158.

Turnbaugh, P.J., Ley, R.E., Mahowald, M.A., Magrini, V., Mardis, E.R., and Gordon, J.I. (2006). An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444, 1027–1031.

Turnbaugh, P.J., Bäckhed, F., Fulton, L., and Gordon, J.I. (2008a). Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host Microbe 3, 213–223.

Turnbaugh, P.J., Backhed, F., Fulton, L., and Gordon, J.I. (2008b). Marked alterations in the distal gut microbiome linked to diet-induced obesity. Cell Host Microbe 3, 213–223.

Turnbaugh, P.J., Ridaura, V.K., Faith, J.J., Rey, F.E., Knight, R., and Gordon, J.I. (2009a). The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci. Transl. Med. 1, 6ra14.

Turnbaugh, P.J., Hamady, M., Yatsunenko, T., Cantarel, B.L., Duncan, A., Ley, R.E., Sogin, M.L., Jones, W.J., Roe, B.A., Affourtit, J.P., et al. (2009b). A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature 457, 480–484.

Tzanavari, T., Giannogonas, P., and Karalis, K.P. (2010). TNF-alpha and obesity. Curr. Dir. Autoimmun. 11, 145–156.

U

Uotani, S., Bjørbaek, C., Tornøe, J., and Flier, J.S. (1999). Functional properties of leptin receptor isoforms: internalization and degradation of leptin and ligand-induced receptor downregulation. Diabetes 48, 279–286.

Ussar, S., Griffin, N.W., Bezy, O., Fujisaka, S., Vienberg, S., Softic, S., Deng, L., Bry, L., Gordon, J.I., and Kahn, C.R. (2015). Interactions between Gut Microbiota, Host Genetics and Diet Modulate the Predisposition to Obesity and Metabolic Syndrome. Cell Metab. 22, 516–530.

Bibliografia

190

V

Vaishnava, S., Behrendt, C.L., Ismail, A.S., Eckmann, L., and Hooper, L.V. (2008). Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20858–20863.

Van Coillie, E., Van Damme, J., and Opdenakker, G. (1999). The MCP/eotaxin subfamily of CC chemokines. Cytokine Growth Factor Rev. 10, 61–86.

Varzaneh, F.N., Keller, B., Unger, S., Aghamohammadi, A., Warnatz, K., and Rezaei, N. (2014). Cytokines in common variable immunodeficiency as signs of immune dysregulation and potential therapeutic targets - a review of the current knowledge. J. Clin. Immunol. 34, 524–543.

Vasselli, J.R. (2012). The Role of Dietary Components in Leptin Resistance. Adv. Nutr. Int. Rev. J. 3, 736–738.

Vasselli, J.R., Scarpace, P.J., Harris, R.B.S., and Banks, W.A. (2013). Dietary Components in the Development of Leptin Resistance123. Adv. Nutr. 4, 164–175.

Velagapudi, V.R., Hezaveh, R., Reigstad, C.S., Gopalacharyulu, P., Yetukuri, L., Islam, S., Felin, J., Perkins, R., Borén, J., Oresic, M., et al. (2010). The gut microbiota modulates host energy and lipid metabolism in mice. J. Lipid Res. 51, 1101–1112.

Vieira, S.M., Lemos, H.P., Grespan, R., Napimoga, M.H., Dal-Secco, D., Freitas, A., Cunha, T.M., Verri, W.A., Souza-Junior, D.A., Jamur, M.C., et al. (2009). A crucial role for TNF-alpha in mediating neutrophil influx induced by endogenously generated or exogenous chemokines, KC/CXCL1 and LIX/CXCL5. Br. J. Pharmacol. 158, 779–789.

Vijay-Kumar, M., Aitken, J.D., Carvalho, F.A., Cullender, T.C., Mwangi, S., Srinivasan, S., Sitaraman, S.V., Knight, R., Ley, R.E., and Gewirtz, A.T. (2010). Metabolic Syndrome and Altered Gut Microbiota in Mice Lacking Toll-Like Receptor 5. Science 328, 228–231.

Villena, J., Racedo, S., Agüero, G., Bru, E., Medina, M., and Alvarez, S. (2005). Lactobacillus casei improves resistance to pneumococcal respiratory infection in malnourished mice. J. Nutr. 135, 1462–1469.

Villena, J., Salva, S., Agüero, G., and Alvarez, S. (2011). Immunomodulatory and protective effect of probiotic Lactobacillus casei against Candida albicans infection in malnourished mice. Microbiol. Immunol. 55, 434–445.

Villena, J., Suzuki, R., Fujie, H., Chiba, E., Takahashi, T., Tomosada, Y., Shimazu, T., Aso, H., Ohwada, S., Suda, Y., et al. (2012). Immunobiotic Lactobacillus jensenii Modulates the Toll-Like Receptor 4-Induced Inflammatory Response via Negative Regulation in Porcine Antigen-Presenting Cells. Clin. Vaccine Immunol. 19, 1038–1053.

Bibliografia

191

W

Wang, C.-Y., and Liao, J.K. (2012). A Mouse Model of Diet-Induced Obesity and Insulin Resistance. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 821, 421–433.

Wauters, M., Considine, R.V., and Van Gaal, L.F. (2000). Human leptin: from an adipocyte hormone to an endocrine mediator. Eur. J. Endocrinol. 143, 293–311.

Weigle, D.S., Breen, P.A., Matthys, C.C., Callahan, H.S., Meeuws, K.E., Burden, V.R., and Purnell, J.Q. (2005). A high-protein diet induces sustained reductions in appetite, ad libitum caloric intake, and body weight despite compensatory changes in diurnal plasma leptin and ghrelin concentrations. Am. J. Clin. Nutr. 82, 41–48.

Weisberg, S.P., McCann, D., Desai, M., Rosenbaum, M., Leibel, R.L., and Ferrante, A.W. (2003a). Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J. Clin. Invest. 112, 1796–1808.

Weisberg, S.P., Hunter, D., Huber, R., Lemieux, J., Slaymaker, S., Vaddi, K., Charo, I., Leibel, R.L., and Ferrante, A.W. (2006). CCR2 modulates inflammatory and metabolic effects of high-fat feeding. J. Clin. Invest. 116, 115–124.

Wichmann, A., Allahyar, A., Greiner, T.U., Plovier, H., Lundén, G.Ö., Larsson, T., Drucker, D.J., Delzenne, N.M., Cani, P.D., and Bäckhed, F. (2013). Microbial Modulation of Energy Availability in the Colon Regulates Intestinal Transit. Cell Host Microbe 14, 582–590.

Wilson, T.A., Nicolosi, R.J., Saati, A., Kotyla, T., and Kritchevsky, D. (2006). Conjugated linoleic acid isomers reduce blood cholesterol levels but not aortic cholesterol accumulation in hypercholesterolemic hamsters. Lipids 41, 41–48.

Wing, R.R., Lang, W., Wadden, T.A., Safford, M., Knowler, W.C., Bertoni, A.G., Hill, J.O., Brancati, F.L., Peters, A., and Wagenknecht, L. (2011). Benefits of Modest Weight Loss in Improving Cardiovascular Risk Factors in Overweight and Obese Individuals With Type 2 Diabetes. Diabetes Care 34, 1481–1486.

Wit, N.J. de, Bosch-Vermeulen, H., Groot, P.J. de, Hooiveld, G.J., Bromhaar, M.M., Jansen, J., Müller, M., and Meer, R. van der (2008). The role of the small intestine in the development of dietary fat-induced obesity and insulin resistance in C57BL/6J mice. BMC Med. Genomics 1, 14.

Wolowczuk, I., Verwaerde, C., Viltart, O., Delanoye, A., Delacre, M., Pot, B., and Grangette, C. (2008a). Feeding Our Immune System: Impact on Metabolism. Clin. Dev. Immunol. 2008.

Wolowczuk, I., Verwaerde, C., Viltart, O., Delanoye, A., Delacre, M., Pot, B., and Grangette, C. (2008b). Feeding our immune system: impact on metabolism. Clin. Dev. Immunol. 2008, 639803.

Bibliografia

192

Won, T.J., Kim, B., Song, D.S., Lim, Y.T., Oh, E.S., Lee, D.I., Park, E.S., Min, H., Park, S.-Y., and Hwang, K.W. (2011). Modulation of Th1/Th2 balance by Lactobacillus strains isolated from Kimchi via stimulation of macrophage cell line J774A.1 in vitro. J. Food Sci. 76, H55-61.

Wu, G.D., Chen, J., Hoffmann, C., Bittinger, K., Chen, Y.-Y., Keilbaugh, S.A., Bewtra, M., Knights, D., Walters, W.A., Knight, R., et al. (2011). Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 334, 105–108.

Wu, H., Tremaroli, V., and Bäckhed, F. (2015). Linking Microbiota to Human Diseases: A Systems Biology Perspective. Trends Endocrinol. Metab.

WHO | Nutrition.

WHO | What is malnutrition?

WHO | Obesity and overweight.

WebINDEC - Sociedad / Salud / Factores de riesgo.

WHO | Obesity and overweight.

X

Xu, J., and Gordon, J.I. (2003). Honor thy symbionts. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10452–10459.

Xu, H., Barnes, G.T., Yang, Q., Tan, G., Yang, D., Chou, C.J., Sole, J., Nichols, A., Ross, J.S., Tartaglia, L.A., et al. (2003). Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. J. Clin. Invest. 112, 1821–1830.

Y

Yin, Y.-N., Yu, Q.-F., Fu, N., Liu, X.-W., and Lu, F.-G. (2010). Effects of four Bifidobacteria on obesity in high-fat diet induced rats. World J. Gastroenterol. WJG 16, 3394–3401.

Yoo, S.-R., Kim, Y.-J., Park, D.-Y., Jung, U.-J., Jeon, S.-M., Ahn, Y.-T., Huh, C.-S., McGregor, R., and Choi, M.S. (2013). Probiotics L. plantarum and L. curvatus in Combination Alter Hepatic Lipid Metabolism and Suppress Diet-Induced Obesity. Obesity 21, 2571–2578.

Younce, C.W., Azfer, A., and Kolattukudy, P.E. (2009). MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1)-induced protein, a recently identified zinc finger protein, induces adipogenesis in 3T3-L1 pre-adipocytes without peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J. Biol. Chem. 284, 27620–27628.

Z

Bibliografia

193

Zareie, M., Johnson-Henry, K., Jury, J., Yang, P., Ngan, B., McKay, D.M., Soderholm, J.D., Perdue, M.H., and Sherman, P.M. (2006). Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress. Gut 55, 1553–1560.

Zarkesh-Esfahani, H., Pockley, G., Metcalfe, R.A., Bidlingmaier, M., Wu, Z., Ajami, A., Weetman, A.P., Strasburger, C.J., and Ross, R.J.M. (2001). High-Dose Leptin Activates Human Leukocytes Via Receptor Expression on Monocytes. J. Immunol. 167, 4593–4599.

Zelaya, H., Haro, C., Laiño, J., Alvarez, S., and Agüero, G. (2012). Inflammation–hemostasis relationship in infected malnourished mice: modulatory effect of Lactobacillus casei CRL 431. Inflamm. Res. 61, 775–785.

Zhang, C., Li, S., Yang, L., Huang, P., Li, W., Wang, S., Zhao, G., Zhang, M., Pang, X., Yan, Z., et al. (2013). Structural modulation of gut microbiota in life-long calorie-restricted mice. Nat. Commun. 4, 2163.

Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M., Barone, M., Leopold, L., and Friedman, J.M. (1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425–432.

Zhao, Y., Sun, R., You, L., Gao, C., and Tian, Z. (2003). Expression of leptin receptors and response to leptin stimulation of human natural killer cell lines. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300, 247–252.

Zhou, Y., and Rui, L. (2013). Leptin signaling and leptin resistance. Front. Med. 7, 207–222.

influencia de bacterias lacticas sobre la secrecion de

Documents