Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Ciencias BiológicasE.A.P. Microbiología y Parasitología

Microbiología industrial

Tema : Aislamiento de bacterias lácticas

Integrantes Bocangel Rodríguez, CarmenCisneros Moscol, JessicaDelgado Escalante, AbrahamTorres Santillán, MargaretMateo Tuesta, Claudia

Profesor(a) : Magister ELENA QUILLAMA POLO.

Grupo: 2 Mesa2

2013

INTRODUCCION

Las bacterias del ácido láctico (BAL) tienen requerimientos nutricionales complejos debido a su

limitada habilidad para sintetizar aminoácidos y vitamina B. La mayoría de BAL producen

únicamente una forma isomérica de ácido láctico. Las especies de los géneros Aerococcus,

Carnobacterium, producen únicamente isómeros L, mientras las especies del género Leuconostc

producen únicamente isómeros D. Sin embargo, algunas BAL producen formas racémicas donde el

isómero predominante depende de cambios en la aireación, cantidad de NaCl, tipo de

fermentación, incrementos en el pH y concentración de sustrato.

Acorde con los productos finales de la fermentación de los hidratos de carbono las BAL se dividen

en homofermentativas y heterofermentativas. En el metabolismo homofermentativo, se produce

predominantemente ácido láctico y las bacterias usan la hexosa. En la fermentación heteroláctica

hay formación de xilulosa-5 fosfato por el sistema de la glucosa-6 fosfato deshidrogenada.

El objetivo de este trabajo practico fue el aislamiento y selección de bacterias lácticas a partir de

leche agria y obtener un cultivo puro de un microorganismo de interés aislándolo de una mezcla

de microorganismos para finalmente caracterizarlo a través de pruebas bioquímicas.

Generalmente, la selección de cepas lácticas autóctonas ha ayudado a obtener productos lácteos

con características similares a los productos elaborados con leche cruda (Centeno et al. 1996;

Méndez et al.1998).

MARCO TEÓRICO

Las bacterias acido lácticas (BAL) son utilizadas en

fermentaciones y están recibiendo gran atención al ser

empleadas por la industria farmacéutica, de alimentos y

bebidas principalmente por la producción de acido

láctico (producto de la fermentación de los azúcares),

componentes, saborizantes, espesantes y bacteriocinas.

Se encuentran en grandes cantidades en la naturaleza,

así como en nuestro aparato digestivo. Aunque se las conoce sobre todo por su labor de

fermentación de productos lácteos, se emplean asimismo para encurtir vegetales en el

horneado, en la panificación del vino, y para curar pescado, carne y embutidos.

Las bacterias lácticas están conformada por géneros como: Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus y son usados en industria como agentes

biocontroladores y probióticos. Las BAL se clasifican en homofermentativas y

heterofermentativas dependiendo de los productos formados a partir de la glucosa. Las

bacterias homofermentativas sintetizan sólo ácido láctico sin liberar CO2. Entre ellas está

Lactobacillu splantarum, utilizado para fabricación de masas ácidas, leches ácidas,

cárnicos madurados y vegetales fermentados. Las bacterias heterofermentativas generan,

además de ácido láctico, una cantidad equimolar de etanol, acetato y CO2, como

Lactobacillus brevis y Leuconostoc sp.

Las bacterias lácticas se caracterizan por ser Gram positivas y tienen morfología bacilar,

cocobacilar o esférica inmóviles.Son anaerobios facultativos. Sin embargo no son capaces

de sintetizar ATP en aerobiosis debido a que no posee citocromos y enzimas. Una prueba

la cual confirma esta incapacidad es la de la catalasa, estas bacterias lácticas son de

catalasa negativa por ende no pueden descomponer el H2O2, utilizando una peroxidasa

para catalizar la oxidación del NADH a partir del H2O2 que se reducirá a H2O.

Estas bacterias se caracterizan por ser exigentes metabólicamente, especialmente con

respecto a fuentes de nitrógeno, ha sido demostrado que el crecimiento es limitado por la

disponibilidad de nutrientes esenciales, por ello el crecimiento es estimulado

implementando al medio con extracto de levadura, peptona y aminoácidos. Un medio

complejo que es ideal para el crecimiento de las bacterias acido lácticas es el Man Rogosa

Sharpe(MRS).

Medio Man Rogosa Sharpe (MRS)

El Agar M.R.S. fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe donde se evidencia un buen

crecimiento de bacterias ácidos lácticos como lactobacilos. Este medio permite un

abundante desarrollo de todas las especies de lactobacilos. La peptona y glucosa

constituyen la fuente de nitrógeno, carbono y de otros elementos necesarios para el

crecimiento bacteriano. El monoleato de sorbitán, magnesio, manganeso y acetato,

aportan cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato

de amonio actúa como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesProteosa peptona Nº 3 10.0

Suspender 64 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 ó 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

Extracto de carne 8.0Extracto de levadura 4.0Glucosa 20.0Monoleato de sorbitán 1 mlFosfato dipotásico 2.0Acetato de sodio 5.0Citrato de amonio 2.0Sulfato de magnesio 0.2Sulfato de manganeso 0.05Agar 13.0pH final: 6.4 ± 0.2

Para determinar si las bacterias acido lácticas son homofermentativas o

heterofermentativas se realizan pruebas bioquímicas como MR-VP, gluconato de potasio y

asimlación de la ribosa. En esta ocasión se realizaron las pruebas de MR-VP y la de

gluconato de potasio.

Pueba Rojo Metilo- Voges Proskauer (MR-VP)

Leche agria (LA.3)

Esta reacción depende de la producción de acetil

metil carbinol (acetoína) que se forma a partir del

acido pirúvico donde se condensa una o dos

moléculas de acido pirúvico con una molécula de

acetaldehído formándose como producto

intermediario el acido acetoláctico que por

descarboxilación forma un acetil metil carbinol. Este

compuesto al oxidarse forma diacetilo que en presencia de un álcali como KOH, da

positivo dando una coloración rosada. Esta reacción se realiza en presencia de oxígeno.

Para el caso de las bacterias lácticas debe resultar positiva para esta prueba lo que indica

que se trata de bacterias heterofermentativas.

Caldo Gluconato de Potasio

Prueba para determinar la capacidad metabólica homofermentativa o heterofermentativa

de un organismo. El gluconato es una sal ácido glucónico que es usado por lo

microorganismos como su única fuente de carbono. Producto de la degradación de este

compuesto se forma una mezcla equimolar de lactosa, etanol o acetato y CO2. La prueba

resultará positiva si hay producción de CO2, esto se evidencia debido a la formación de gas

que levantará la capa de vaspar que se le adicionó al caldo cultivado. La incubación se

realiza en condiciones microaerofilia.

Los componentes del caldo son los siguientes:

Fórmula (en gramos por litro)Extracto de levadura 1.0

Peptona de carne 1.0K2PO4 1.0

Gluconato de potasio 40.0Agua destilada 1000 ml

METODOLOGÍA

RESULTADOS

RESULTADOS

Vista microscópica de la leche agria antes del cultivo

AISLAMIENTO PRIMARIO

CARACTERISTICAS

Gram +

Bacilos

No esporulados

DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO

M 17 10-5 MRS 10-5

MRS + Jugo de tomate 10-5

MRS 10-4

M 17 10-5MRS 10-5

MRS + Jugo de tomate 10-5

MRS 10-4

MEDIO: MRS + jugo de tomate

DESCRIPCION DE LAS COLONIAS

Colonias pequeñas, redondas, opacas, y lisa .

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Asimilación de carbohidratos

Manitol Almidón Rafinosa Arabinosa Sacarosa Glucosa Galactosa Lactosa Malato Ribosa

- - - - + + + + + +

Gluconato de potasio

Caldo MRS VP catalasa

- (No CO2) + (botón) - -Caldo MRS Formación de CO2

CRECIMIENTO: solo botón

Negativo

Voges proskauer

CATALASA

Vista microscópica del caldo MRS

RESULTADO FINAL

A través de las pruebas de asimilación de carbohidrato, además de observar que metaboliza la ribosa, es decir es heterofermentativo, se puede determinar que la especie aislada se identifica a partir del “patrón de carbohidratos fermentados de especies heterofermentativas facultativas del género Lactobacillus” como Lactobacillus bavaricus.

Negativo

RESUMEN

Manitol Almidón Rafinosa Arabinosa Sacarosa Glucosa Galactosa Lactosa Malato Ribosa

- - - - + + + + + +

Gluconato de potasio

Caldo MRS Caldo MRS VP catalasa

- (No CO2) + ( botón) + (botón) - -

DISCUSION DE RESULTADOS

Las bacterias ácido lácticas presentan en la actualidad un inmenso potencial

biotecnológico, dada su presencia en multitud de procesos fermentativos de alimentos

destinados al consumo humano y animal. Estas bacterias no sólo contribuyen al desarrollo

de las características organolépticas de los alimentos, sino que generan en los mismos

ambientes poco favorables para el desarrollo de microorganismos patógenos debido a su

marcada capacidad antagonista, la cual favorece su proliferación en el alimento, en

detrimento de cualquier otro grupo microbiano presente en la materia prima (alimento

crudo) o que contamine el producto posteriormente. Además de este importante papel en

procesos de bioconservación, se ha podido comprobar que algunas cepas de bacterias

lácticas, entre ellas las del género Lactobacillus, son beneficiosas para la salud, tanto

humana como animal (probióticos).

Las colonias de Lactobacillus en medios solidos son pequeñas, convexas, suaves, con

márgenes enteros, opacas sin pigmentación. En el comportamiento en medio liquido por

su parte, se observo la presencia de botón y sin turbidez a diferencia de las levaduras cuyo

comportamiento es pulvurulento.

Al realizar la coloración Gram, se observaron bacilos Gram positivos no esporulados, estos

organismos son los responsables de la formación de acido láctico a partir de la

degradación de azucares. Teniendo en cuenta que estos microorganismos crecerán en

condiciones de microaerofília y en un medio rico en nutrientes como es el caso del medio

MRS.

La identificación bioquímica de una cepa elegida procedente de un cultivo activo se realizó

mediante las siguientes pruebas: fermentación de carbohidratos, gluconato de potasio y

prueba de Vogues Proskauer. En la primera prueba; se obtuvo que la cepa elegida es capaz

de fermentar glucosa, galactosa, lactosa, maltosa y ribosa; por el contrario no fue capaz de

hacerlo para los carbohidratos como manitol, almidón, rafinosa y arabinosa. Mediante la

segunda prueba realizada se obtuvo que la vía glucolítica tomada por esta cepa es la

homofermentativa., debido a que no se mostró producción de gas. Al tomar esta vía la

glucosa se convierte en ácido láctico. En la última prueba de Vogues Proskauer se

determinó que la cepa no produce acetilcarbinol o acetoína como intermediario del

metabolismo de la glucosa en presencia de un Hidroxido de potasio KOH y del oxígeno

atmosférico.

Mediante las características bioquímicas y la comparación con la tabla (Anexo) se

determinó que las bacterias lácticas probablemente presentes en la muestra de leche

agria procesada es Lactobacillus acidophilus.

Esto se justifica Investigadores como Zong y colaboradores, expresan en su artículo

“Differentiation of Lactobacillus species by molecular typing” que la caracterización de

bacterias ácido láctico mediante morfología celular, colonial y por pruebas bioquímicas

resulta poco exacta y con una alta probabilidad se pueden encontrar cepas que presentan

características intermedias o que son incapaces de expresar algunas de sus características

en determinados ambientes o condiciones de cultivo. Esto coincide con los resultados

obtenidos en general, ya que fueron poco exactos en la determinación de si las bacterias

lácticas presentes en la leche agria eran homofermentativas o heterofermentativas, de

igual manera sucedió con la degradación de la ribosa.

BIBLIOGRAFÍA

Zong W, Millsap K, Bialkowska H & Reid G. Differentiation of Lactobacillus species by

molecular typing. Appl Envirom Microbiol.1998;64: 2418- 2423

www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mrsagar.htm

Sedano, J. 2006. Selección de cepas nativas de Lactobacillus con actividad

inhibitoria y tolerantes al etanol aisladas del masato. Tesis para optar el título de

biólogo con mención en Microbiología y Parasitología

www.eufic.org/article/es/nutricion/alimentos-funcionales/artid/bacterias-acido-

lacticas/

ANEXO