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Il Laboratorio di tossicologia clinica
Alcune tecniche di Laboratorio
Spettrofotometria
Immunometria
Sostanze ad uso voluttuario
Analisi finalità
Matrici biologiche: sangue, urine, altre
Alcol
tecnica analitica
basata sull‟ interazione tra la materia e le
radiazioni elettromagnetiche.
Tecniche di Laboratorio
SPETTROFOTOMETRIA:
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Esistono vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro
lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia)
Tipi di radiazione elettromagnetica
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Atomi o molecole possono assorbire quantità definite e
caratteristiche di energia:
• quando vengono eccitati da adatte radiazioni elettromagnetiche
passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di
ASSORBIMENTO.
• quando dagli stati eccitati, ritornano allo stato fondamentale, gli
atomi e le molecole emettono quanti di energia sotto forma di
radiazioni elettromagnetiche, si ha il fenomeno di EMISSIONE
(fluorescenza).
Analisi spettrofotometrica: principio
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I componenti essenziali sono:
Lo spettrofotometro
• Cella o cuvetta
• Fessura d‟ingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e rendere paralleli
i raggi della sorgente)
• Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio per l‟UV)
• Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di l definita)
• Fessura d‟uscita
• Fotomoltiplicatore (che trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico)
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Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una
radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente
a seconda della concentrazione.
Definendo A (Assorbanza) = log I0/I
I0 = intensità della radiazione incidente
I = intensità della radiazione trasmessa.
Legge di Lambert-Beer
A = eCi
Legge di Lambert-Beer
e = coefficiente di estinzione molare (ovvero l‟assorbimento che subisce un raggio di luce monocromatica
nell‟attraversare una soluzione a concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm)
C = concentrazione della soluzione.i = cammino ottico (ovvero spessore dello strato attraversato dalla radiazione incidente)
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• analisi quantitativa indiretta tramite reazione colorimetrica; molte sostanze
possono reagire con altre a dare un prodotto colorato.
• analisi quantitativa diretta per sostanze che assorbono ad una data
lunghezza d‟onda, tipo le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa
principalmente sul contenuto di aa aromatici
• attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di
una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento, che partecipa come
substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame
• analisi qualitativa: spettro d‟assorbimento.
APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA
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SCOPO:
1. dosare la quantità di un substrato che prende
parte ad una reazione catalizzata da un
enzima,
2. dosare l‟attività di un enzima, cioè la velocità di
una reazione catalizzata da un enzima.
Dosaggio enzimatico
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Enzimi plasmatici
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• Il dosaggio degli enzimi nel plasma può essere
utilizzato per diagnosticare il danno di un tessuto od
organo particolarmente ricco in alcuni enzimi.
L‟entità del rilascio enzimatico fornirà un indice del
grado del danno cellulare.
• Carenze/difetti enzimatici sono responsabili di
sindromi biochimiche
Si misura la variazione nel tempo di
una qualsiasi grandezza correlata alla
concentrazione del substrato o del
prodotto.
Come si misura l’attività di un enzima ?
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Dosaggio dell’ attività enzimatica (metodo diretto)
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Un esempio è il dosaggio della LDH (latticodeidrogenasi) che catalizza la reazione:
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Il Laboratorio di tossicologia clinica
Alcune tecniche di Laboratorio
Spettrofotometria
Immunometria
Sostanze ad uso voluttuario
Analisi finalità
Matrici biologiche: sangue, urine, altre
Alcol
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Molte tecniche di Laboratorio si avvalgono dellegame specifico antigene-anticorpo.
Dal momento che è possibile produrre anticorpi neiconfronti di qualunque tipo di macromolecola osostanza chimica di piccole dimensioni, le tecnichebasate sul loro impiego sono utili per rilevare epurificare i composti.
.
Legame antigene-anticorpo
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Le Immunoglobuline o Anticorpi (Ab)sono proteine nelle quali sonoindividuabili due regioni diverse perstruttura e funzione:
-regione Fab: regione variabile.Contiene la zona specifica per l'antigene;
-regione Fc: regione a strutturacostante presente all'interno della classee sottoclasse di Ab.
Gli anticorpi che vengono utilizzatinelle analisi di Laboratorio appartengonoalla classe delle Immunoglobuline G.
Le forze che intervengono nel legameAb-Ag sono: forze elettrostatiche, forzeidrofobiche, legami idrogeno e forze diVan der Waals
IMMUNOGLOBULINE
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Schema di una metodica immunochimica (immunoenzimatica – EIA)
„ATTORI‟
substrato
Quando l‟Ag marcato con enzima non è legato all‟anticorpo,
avviene la reazione tra enzima e substrato , con sviluppo di colore.
Ag-enzima-substrato
anticorpo in grado di legarsi alla sostanza (Ag)
Il reattivo è costituito da :
• la stessa sostanza coniugata ad un enzima
• anticorpi specifici in grado di legarsi alla
sostanza (Ag) presente nel campione.
L‟ Ag coniugato con l‟enzima compete con la
sostanza eventualmente presente nel campione per
una quantità fissa di siti leganti dell‟anticorpo.
Viene quindi aggiunto il substrato specifico
dell‟enzima.
Se il campione contiene la sostanza (Ag), l‟Ag
coniugato non viene legato dall‟anticorpo e la
reazione enzimatica può avvenire.
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Il campione da analizzare contiene la sostanza (Ag)
da dosare.
Questa reazione stabilisce una diretta relazione tra la presenza dell’analita e l’attività enzimatica.
Schema di una metodica immunochimica (immunoenzimatica – EIA)
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Il Laboratorio di tossicologia clinica
Alcune tecniche di Laboratorio
Spettrofotometria
Immunometria
Sostanze ad uso voluttuario
Analisi finalità
Matrici biologiche: sangue, urine, altre
Alcol
Ogni società accetta alcune sostanze come
lecite e ne condanna altre perché illecite.
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Nel Medio Oriente la Cannabis può essere
compresa fra le sostanze lecite, mentre
l‟alcool viene proibito.
In USA e nella gran parte dell’Europa Occidentale sostanze ad uso voluttuario
‘lecite’ sono:
Caffeina
Nicotina
Alcool
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Illeciti
Oppioidi
Cannabinoidi
Allucinogeni
Psicostimolanti
Sedativo-ipnotici
Agenti inalanti
Ormoni steroidi
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Oppioidi
Morfina, eroina, codeina, oxicodone, petidina, metadone, buprenorfina sono derivati dalla resina del papavero dell’oppio.
L’incisione della capsula del Papaver somniferumevidenzia un lattice bianco che si addensa lungo le incisioni e diventa scuro e gommoso, l’oppio, cioè la droga bruta. Nell’oppio sono contenuti diversi alcaloidi, il principale dei quali è la morfina.
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Papaversomniferum
Abitudine e dipendenza
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Alcaloidi attivi dell’oppioFumare oppio è stata una pratica largamente diffusa in Cina e nel
vicino Oriente.
La somministrazione endovenosa è quella più comune, perché è la
via più efficace e perche molto rapidamente si raggiunge nel cervello
un’alta concentrazione di droga che produce il “rush” (sensazione
simile all’orgasmo).
Abitudine (tolerance nella terminologia anglosassone). Progressiva
riduzione dell’efficacia (farmacologica) a seguito di ripetute
somministrazioni: per ottenere la risposta originaria è necessario
aumentare la dose.
Dipendenza fisica, comparsa di una caratteristica sindrome di privazione
o sindrome di astinenza quando viene sospesa l’assunzione del farmaco
Eroina
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. L‟Eroina e la Codeina vengono velocemente metabolizzati in Morfina.
Perciò, la Morfina (o i suoi metaboliti ) può essere trovata nelle urine di un
soggetto che ha fatto uso solo di Eroina e/o Codeina..
Cut-off (test di screening) = 300 ng/ml.
L'eroina, il cui nome scientifico è diacetilmorfina è una sostanza semisintetica,
vale a dire ottenuta in parte in laboratorio a partire dalla morfina estratta
dall'oppio mediante trattamento con anidride acetica.
Metadone
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È una droga analgesica sintetica usata nel trattamento delle
tossicodipendenze.
Tra gli effetti psicologici indotti dall‟uso del Metadone vi è analgesia,
sedazione e depressione respiratoria.
Il sovradosaggio di Metadone può portare al coma e anche alla morte.
Viene somministrato oralmente o mediante iniezione intravenosa e
viene metabolizzato dal fegato.
I reni hanno il ruolo principale nell‟escrezione del Metadone.
Viene metabolizzato in 15 - 60 ore.
Buprenorfina
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La buprenorfina è un agonista oppioide provvisto di alta affinità di
legame, ma bassa attività intrinseca per il recettore μ dei neuroni che
trasmettono il dolore.
La rende perciò un‟interessante alternativa al metadone per il trattamento
del‟astinenza da oppioidi. Il metadone è anch‟esso un oppioide ma è dotato
di proprietà utili nel trattamento dell‟abuso di oppiodi (disintossicazione e
terapia di mantenimento dell‟eroinomane recidivo):
• tolleranza e dipendenza fisica si sviluppano più lentamente che con gli
altri oppioidi,
• la sintomatologia della sindrome da astinenza è più lieve anche se più
prolungata
Cannabinoidi
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Cannabis sativa
• Marijuana
• Hashish
Principio attivo:
Δ9 Tetraidrocannabinolo (Δ9 -THC)
Cannabinoidi: Marijuana e hascisc
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La Marijuana è un agente allucinogeno derivato dal fiore della pianta dell‟hascisc.
La modalità principale per l‟assunzione della Marijuana/Cannabis è il fumo.
Ad alte dosi provoca effetti sul sistema nervoso centrale, alterazione dell‟umore
e delle percezioni sensoriali, perdita di coordinazione, riduzione della
memoria a breve termine, ansietà, paranoia, depressione, stato confusionale,
allucinazioni ed aumento della frequenza del battito cardiaco.
Si può avere una tolleranza agli effetti cardiaci e psicotropi.
La mancata assunzione provoca irrequietezza, insonnia, anoressia e nausea.
Quando la Marijuana viene ingerita, essa viene metabolizzata dal fegato.
Il principale metabolita della Marijuana nelle urine è il
9 Tetraidrocannabinolo (9 THC)
Questo significa che la presenza di Cannabinoidi, compreso il principale
metabolita carbossilico, nelle urine indica l‟uso di Marijuana/Cannabis.
Cut-off (test di screening) del Δ9 -THC = di 50 ng/ml
Psico-stimolanti: Cocaina
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Derivata dalle foglie di pianta di coca, è un potente stimolante del sistema
nervoso centrale e un anestetico locale.
Tra gli effetti psicologici indotti dall‟uso della cocaina vi sono euforia,
sicurezza di sé ed un senso di aumentata energia, accompagnato da
aumento del battito cardiaco, dilatazione delle pupille, febbre,
tremore e sudorazione.
La Cocaina viene escreta primariamente nelle urine principalmente come
Benzoilecgonina in un breve periodo di tempo.
Cut-off (test di screening) = 300 ng/ml
Psico-stimolanti: Amfetamina (Ectasy)
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Metamfetamine
Le Metamfetamine, le Amfetamine e i loro metaboliti sono potenti
agenti simpatomimetici.
Alti dosaggi stimolano il sistema nervoso centrale e danno luogo a euforia,
stato di allerta, e un senso di aumentata energia e potenza.
Risposte più acute danno luogo ad ansietà, paranoia,
comportamento psicotico e aritmia cardiaca.
Il tipo di psicosi che si può manifestare ad alti dosaggi può non essere
distinguibile da fenomeni di schizofrenia.
Il 40% delle Matamfetamine viene escreto nella forma originale.
Perciò la presenza di composti derivati nelle urine indica l‟uso di Metamfetamine.
Cut-off (test di screening) = 500 ng/ml.
Sedativo-ipnotici
• Barbiturici (secobarbital, pentobarbital)
• Acido γ-idrossibutirrico (GHB )
• Altri (benzodiazepine, etc...)
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In rapporto alle dose utilizzate, possono indurre:
• sedazione
• stato ipnotico, ipno-narcotico
• anestesia
• coma e morte
Agenti inalanti
• Gas anestetici
• Solventi industriali
• Sostanze ad azione propellente per aerosol
• Nitriti organici
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Steroidi
• Ormoni anabolizzanti:
• Testosterone e i suoi esteri
• Metil-testosterone
• Nandrolone
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Consumo
TIPI DI DROGHE NUMERO CONSUMATORI
Eroina 8 milioni
Cocaina 13 milioni 300 mila
Cannabis 141 milioni 200 mila
Allucinogeni 25 milioni 500 mila
Anfetamine 30 milioni 200 mila
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Il Laboratorio di tossicologia clinica
Alcune tecniche di Laboratorio
Spettrofotometria
Immunometria
Sostanze ad uso voluttuario
Analisi finalità
Matrici biologiche: sangue, urine, altre
Alcol
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- LOCALI:
Un laboratorio che analizza sostanze d’abuso deve essere separato dagli altri reparti del laboratorio di analisi
- RACCOLTA CAMPIONI URINA:
I campioni di urina possono essere raccolti presso il laboratorio di analisi o presso altre strutture o enti
- CAMPIONI RACCOLTI NEL LABORATORIO ANALISI:
Il prelievo verrà effettuato in locali idonei e secondo procedure che pur salvaguardando il riserbo individuale, assicurino l’identità l’integrità el’autenticità del campione
Struttura oraganizzativa
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Metodi analitici
TEST DI SCREENING (iniziali o di
primo livello)
TEST DI CONFERMA (o di secondo
livello
Metodi analitici
RICHIAMI DI CONCETTI BASE
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Affidabilità e validità di un test di Laboratorio
Un test ideale (clinico, strumentale, di laboratorio) DOVREBBE essere
affidabile e valido.
Affidabilità di un test: capacità del test di offrire sempre lo
stesso risultato nel corso di ripetute misurazioni.
Validità di un test: capacità del test di distinguere in una
popolazione i soggetti sani da quelli malati.
Utilizzando un test ideale, tutti i soggetti sani dovrebbero risultare
negativi al test ed analogamente tutti i i malati dovrebbero risultare
positivi.
sanimalati
il test ideale...
cut-off
Sfortunatamente in medicina la realtà è notevolmente differente....
sanimalati
....il test reale
cut-off
FPFN
RICHIAMI DI CONCETTI BASE
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Il test di screening
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Sottoponendo una popolazione qualsiasi ad un test di screening, dato un certo valore di cut-off, purtroppo avremo sempre un certo numero di soggetti sani che risulteranno positivi al test e.....
... simmetricamente, un certo numero di soggettimalati che il test non riuscirà ad identificare come tali.
sanimalati
....il test reale
cut-off
Falsi
PositiviFalsi
Negativi
negativo positivo
FN = Falsi NegativiFP = Falsi Positivi
Specificità e sensibilità di un test
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Veri
Negativi
Veri
Positivi
Specificità: capacità del test di
individuare in una popolazione i
soggetti sani (o NEGATIVI)..
Sensibilità: capacità del test di individuare
in una popolazione i soggetti malati (o
POSITIVI).
Obiettivi:1. GIUSTA DIAGNOSI (intossicazione ?, tossicodipendenza?)
2. TRATTARE IL PAZIENTE IN MANIERA CORRETTA
3. SALVARE IL PAZIENTE
4. PREVENIRE LA RECIDIVA
TOSSICOLOGIA CLINICA
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Esami di laboratorio:• Test di screening (o di primo livello)• ANALISI QUALITATIVA: fornisce soltanto un risultato in termini di
presenza/assenza di una sostanza.
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*Limite operativo, scelto in base alle caratteristiche analitiche del metodo, per stabilire la positività o negatività del campione, permettendo di escludere i campioni negativi da ulteriori approfondimenti diagnostici (test di conferma). I campioni positivi, in ambito medico-legale, devono essere confermati con test di secondo livello.
Requisiti: economicità, rapidità, standardizzazione
Metodiche: immunochimiche
Risultati analitici:
negativi, risultato < valore soglia (cut-off)*
positivi, risultato ≥ valore soglia (cut-off)*
Test di screening o di primo livello
CLASSE DI SOSTANZE Concentrazione (ng/ml)
Oppiacei 300
Morfina libera 25
Cocaina metaboliti 300
Cannabinoidi - Δ9 THC (Δ9TetraHidroCannabinolo)50
Amfetamine ed analoghi 1.000
MDMA (MetilenDiossietilMetaAmfetamina)MDA (MetilenDiossiAmfetamina)
300
Benzodiazepine 500
Metadone 300
Bubrenorfina 10
Barbiturici 200
LSD (Dietilamide dell'acido lisergico) 0.5
PCP (Fenilciclidina) 25
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Cut-off (concentrazione soglia) per la positività nei test di screening (iniziali) – URINE
Tossicologia forense
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Obiettivi:AMMINISTRATITIVI O MEDICO-LEGALI
1. Commissioni medico-legali: disabilità alla guida
2. Determinazione requisiti psicofisici per il rilascio del porto d‟armi
3. Forze dell‟ordine: accertamento stato ebbrezza o assunzione
stupefacenti nella guida.
4. Fornire alla magistratura tutti gli elementi per un giusto giudizio.
DEVONO
− identificare i singoli analiti
− avere sensibilita e specificità maggiore
rispetto ai test iniziali
− basarsi su principi fisici e chimici diversi
da quelli dei test iniziali
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Requisiti: specificità, sensibilità superiore al valore soglia stabilito per il test di I livello
Metodiche: cromatografiche (GC, GC/MS, HPLC)
Utilizzo:
conferma della positività verifica di eventuali falsi positivi ai test di screening.
Test di conferma o di secondo livello
DEVONO
identificare i singoli analiti (risultato quantitativo per singola sostanza). basarsi su principi fisici e chimici diversi da quelli dei test iniziali
CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI
• Laboratorio di base nell’ambito della Biochimica Tossicologica
LABORATORIO DI 1° LIVELLO CHE ESEGUE SOLO TEST INIZIALI (o di screening)
• Laboratorio SPECIALIZZATO nell’ambito della Biochimica Tossicologica
LABORATORIODI II° LIVELLO CHE ESEGUE SIA LE ANALISI INIZIALI CHE DI CONFERMA
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ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
EIA (Immuno Enzimatiche)
CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay)
EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)
FPIA (Immunofluorescenza a luce polarizzata)
KIMS (Interazione Cinetica di Microparticelle in Soluzione)
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Metodiche immunochimiche, applicate su
analizzatori automatici, attualmente più utilizzate per i test di screening
Immunodosaggi
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Il Laboratorio di tossicologia clinica
Alcune tecniche di Laboratorio
Spettrofotometria
Immunometria
Sostanze ad uso voluttuario
Analisi finalità
Matrici biologiche: sangue, urine, altre
Alcol
MATRICI BIOLOGICHE
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Sangue
• La concentrazione ematica della sostanza ricercata consente di stabilire o di escludere la recente assunzione .
• È direttamente correlabile allo status psicofisico del soggetto al momento del prelievo.
• Il prelievo è invasivo e deve essere effettuato con il consenso dell’interessato.
URINE
MATRICE BIOLOGICA DI PRIMA SCELTA NELL’ANALISI DELLE SOSTANZE D’ABUSO
VANTAGGI: PRELIEVO NON INVASIVO DEL CAMPIONE POSSIBILITA’ DI CAMPIONARE GRANDI VOLUMI POSSIBILITA’ DI ANALIZZARE SIA LE SOSTANZE CHE I LORO METABOLITI DOPO
DIVERSI GIORNI.
SVANTAGGI: SCARSA RILEVANZA CLINICA DELL’ANALISI QUANTITATIVA POICHE’ LE
CONCENTRAZIONI DEGLI ANALITI VARIANO CON:• dose• via di somministrazione• tempo di latenza tra l’assunzione e l’analisi• stato fisiologico dell’individuo• aggiunta di sostanze adulteranti
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MATRICI BIOLOGICHE
Droghe d’abuso:dimezzamento e periodo approssimativo di rilevabilità nelle urine.
Droga Emivita nel plasma Durata del periodo di rilevabilità nelle urine (*)
Eroina Circa 3 min. Pochi minuti
Metaboliti della morfina Circa 6-25 min. Poche ore
Morfina 2-3 ore giorni
Cocaina 0,7-1,5 ore Poche ore
Alcuni metaboliti della cocaina
1-7 ore Da poche ore a 3-5 giorni
ATS (Amphetamine TypeSubstances)
7-34 ore 2-3 giorni
THC (Δ9 Tetra-idro-
cannabinolo) - metaboliti120 – 150 ore Da pochi giorni ad alcune
settimane.
Etanolo I livelli ematici decadono in media di 15-18 mg/dl/ora
1,5-12 ore a seconda del picco ematico; le urine rimangono positive per altre 1-2 ore
(*) Il periodo di rilevazione è dose dipendente. Maggiore è la dose, più lungo è il periodo durante il quale la droga o il suo metabolita significativo può
essere trovato nelle urine. 60
MATRICI BIOLOGICHE NON CONVENZIONALI PER L’ANALISI DELLE SOSTANZE D’ABUSO
• SALIVA
• SUDORE
• CAPELLI
• PELI PUBICI
• PELI ASCELLARI
• UNGHIE
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PERCHE’ UTILIZZARE MATRICI NON CONVENZIONALI NELLEANALISI FARMACO-TOSSICOLOGICHE?
PER INCREMENTARE IL TEMPO DI DETERMINAZIONE
Dopo somministrazione, ed in funzione dellecaratteristiche farmacocinetiche, una droga e/o i suoimetaboliti possono essere rilevati:
»Sangue h
»Saliva h
»Urina giorni
»Capelli mesi
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La maggior parte delle droghe d’abuso (oppioidi, anfetamine, cocaina, ecc...) diffondono nel fluido orale per trasferimento passivo dal torrente circolatorio.Le concentrazioni salivari correlano con quelle ematiche.
Fa eccezione il principio attivo della Cannabis (THC - Δ9 Tetra-idro-cannabinolo) che non diffonde dal sangue alla saliva a causa della sua scarsa idrosolubilità e basicità
Fluido orale o saliva
Formazioni pilifere(matrice cheratinica)
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I capelli hanno velocità di crescita variabile tra 0,8 e 1,4 cm/mese. Possono essere considerati come “memoria” delle sostanze tossiche presenti nell’organismo.Le droghe d’abuso si legano alla matrice cheratinica attraverso il flusso ematico, la secrezione delle ghiandole sebacee e sudoripare.Un risultato positivo può essere indice di un consumo abitudinario di sostanze d’abuso.
LIMITI
Un risultato negativo non può escludere l’assunzione occasionale.
Variabilità di risultati legata al colore dei capelli e l’origine etnica: i capelli più scuri fissano più metaboliti rispetto a quelli chiari.
I capelli possono essere adulterati mediante trattamenti cosmetici di decolorazione, tinture e permanente.
LA DETERMINAZIONE NEI CAPELLI DEI FARMACIE SOSTANZE STUPEFACENTI PUO’ ESSERE
RICHIESTA IN CASO DI:
• Morti correlate all’uso di farmaci e/o sostanze d’abuso;
• Valutazione di inidoneità alla guida;
• Responsabilità criminale;
• Affidamento, custodia minori;
• Esposizione prenatale a farmaci e sostanze d’abuso
65˜
ACCORGIMENTI NELLA RACCOLTA DEL CAMPIONE
Il prelievo deve avvenire in locali noncomunicanti con l’esterno e sotto controllo.
Non devono essere disponibili prodottidetergenti nel locale dove avviene laraccolta.
E’ consiglibile aggiungere opportunocolorante nell’acqua di scarico
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Principali test per indagare l’autenticità del campione di urine
pH •Valori di riferimento: 4,5 – 9• cut-off: 3 – 10Valori < 3 e >10 : campione sicuramente adulterato
Peso specifico •Valori di riferimento: 1,003 – 1,030• cut-off: 1,003Valori < 1,003 : campione sicuramente adulterato
Creatininuria •Valori di riferimento: 25 – 300 mg/dl• cut-off: 20 mg/dl - Valori inferiori : campione sicuramente adulterato
Concentrazioni fra 20 e 40 mg/dl sono fortemente sospette di adulterazione
Nitriti Possono essere presenti nelle urine in conseguenza di crescita batterica ma a concentrazioni massime di 5 mg/dl. Possono essere indice di adulterazione per aggiunta di sostanze attualmente in commercio.
Gluteraldeide • Cut-off: zero
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La catena di custodia - PREMESSA
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La validita’ dei risultati di laboratorio
non dipende solo dall’adeguatezza del
processo analitico ma anche dalla prova
dell’autenticità e integrità del campione
dal momento in cui e’ stato raccolto fino a
quando l’analisi viene completata
Catena di custodia, cos’è?
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Procedura documentata atta a ricostruire l‟iter di ogni
campione biologico all‟interno del laboratorio.
Obiettivi dellaCATENA DI CUSTODIA
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definire l‟attuale ubicazione nel laboratorio del campione,
individuare tutti i soggetti che lo hanno manipolato,
conoscere tutte le date del processo:
• entrata/consegna in laboratorio
• eventuale movimentazione e/o smaltimento secondo le procedure vigenti.
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La vita è un'opportunità, coglila.
La vita è bellezza, ammirala.
La vita è beatitudine, assaporala.
La vita è un sogno, fanne realtà.
La vita è una sfida, affrontala.
La vita è un dovere, compilo.
La vita è un gioco, giocalo.
La vita è preziosa, abbine cura.
La vita è ricchezza, valorizzala.
La vita è amore, vivilo.
La vita è un mistero, scoprilo.
La vita è promessa, adempila.
La vita è tristezza, superala.
La via è un inno, cantalo.
La vita è una lotta, accettala.
La vita è un'avventura, rischiala.
La vita è la vita, difendila.
Inno alla vita
(Santa M.Teresa di Calcutta)
La vita è un'opportunità, coglila.
La vita è bellezza, ammirala.
La vita è beatitudine, assaporala.
La vita è un sogno, fanne realtà.
La vita è una sfida, affrontala.
La vita è un dovere, compilo.
La vita è un gioco, giocalo.
La vita è preziosa, abbine cura.
La vita è ricchezza, valorizzala.
La vita è amore, vivilo.
La vita è un mistero, scoprilo.
La vita è promessa, adempila.
La vita è tristezza, superala.
La via è un inno, cantalo.
La vita è una lotta, accettala.
La vita è un'avventura, rischiala.
La vita è la vita, difendila.
Inno alla vita
(Santa M.Teresa di Calcutta)
ALCOLUn problema clinico e sociale di grande rilevanza.
L‟etanolo, pur rientrando tra le sostanze d‟abuso, è trattato separatamente in quanto:
sostanza lecita e liberamente in commercio;
possiede aspetti normativi (limiti di concentrazione, matrici biologiche) ben definiti;
per struttura chimica e per livelli di concentrazione (espressi in g/L), può essere
determinato anche con metodologie analitiche analoghe a quelle utilizzate in chimica
clinica.
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Biochimica e metabolismo dell’alcol etilico
Viene assorbito rapidamente (da 2 a 6 ore), in funzione di fattori quali:
•presenza di cibo e di altri liquidi
•tempo impiegato per l’ingestione della bevanda
•la variabilità biologica fra individui
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Biochimica e metabolismo dell’alcol etilico
Appena assorbito, si distribuisce rapidamente in tutti i tessuti e fluidi del
corpo, superando anche la barriera encefalica e placentare.
Ciò è dovuto
alla sua solubilità in acqua.
al suo basso peso molecolare.
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Biochimica e metabolismo dell’alcol etilico
• La massima concentrazione nel sangue viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall’assunzione
• saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell’alcolemia
• le urine raggiungono un massimo con circa 2 ore di ritardo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80 100 120
Co
nc.
(m
g/d
l)
Tempo dall’assunzione (min.)
Espirato Sangue Urine
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Alcolemia (g/L) Effetti0,50 – 0,80 EBBREZZA iniziale, accentuata da stati di ipoglicemia.
•Guida veicolare più rischiosa.
0,8 – 2,00 INSTABILITÀ EMOTIVA:•diminuzione delle percezioni sensoriali• loquacità•sonnolenza•deambulazione incerta• incoerenza ideativa•compromissione della valutazione di percezioni visive simultanee.
2,0 – 4,0 CONFUSIONE:•disorientamento (100% soggetti)•nausea, vomito•vertigini•sudorazione e salivazione profuse• incoordinazione motoria e ideativa
3,0 – 6,0 STUPORE-COMA:• iporiflessia•paralisi incombente•coma con acidosi metabolica• insufficienza respiratoria e circolatoria• ipotermia marcata
Correlazione tra alcolemia ed effetti clinici
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Il maggior rischio di provocare un incidente grave o mortale correlato
all'assunzione di alcol:
comincia a manifestarsi a livelli di alcolemia tra 0.5 e 0.8 g/litro (0.5 g/litro
attuale limite legale)
cresce esponenzialmente per incrementi successivi dei livelli alcolemici:
per alcolemia intorno a 1 g/litro si ha un rischio relativo pari a circa 10
per alcolemia di 1.3 g/litro corrisponde un rischio relativo tra 25 e 30
A parità di alcolemia i rischi sono notevolmente maggiori per i conducenti
neo-patentati e più giovani.
A parità di alcolemia i rischi sono notevolmente maggiori per i conducenti
che bevono meno frequentemente (es. giovani che assumono bevande
alcoliche esclusivamente nel fine settimana).
Il rischio di incidente stradale in soggetti che guidano nelle ore notturne
del fine settimana con alcolemia superiore a 1.5 g/litro è di circa 380 volte
maggiore rispetto al rischio relativo ai soggetti sobri.
Alcol e guida
78
Interazione alcol-sostanze d'abuso
• L'alcol interagisce con molti farmaci e sostanze d'abuso potenziandone gli effetti anche a distanza di diverse ore.
79
Interazione alcol-sostanze d'abuso
• alcol - marijuana
• alcol - oppiacei
• alcol – stimolanti (cocaina, anfetamine, ectasy)
La frequenza del poli-abuso induce a pensare che le diverse dipendenze
condividano processi patogenetici psicologici e biologici.
Le diverse sostanze, attivando i medesimi circuiti cerebrali (via dopaminergica
mesencefalo-limbica), possono svolgere una funzione vicariante, sostituirsi a
vicenda e sommare i propri effetti per produrre stati di
euforia/gratificazione.
80
Ruolo del Laboratorio di Analisi di Biochimica clinica e Tossicologia
81
Accertare l‟avvenuta assunzione di etanolo
Stabilire se il paziente è un etilista
Valutare gli eventuali danni prodotti all‟organismo del bevitore
Intossicazione acuta
• Alcolemia Abuso cronico
• Alcoluria
• Biomarcatori
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I Marcatori dell’abuso alcolico
Acuto Recente Cronico
Alcool Etilglucuronide (EtG) GammaGT
Alcool espirato Volume Corpuscolare Medio (MCV)
Transaminasi (AST/ALT)
Trasferrina carboidrato Depleta (CDT)
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I Marcatori dell’abuso alcolico
DIRETTI
Sostanze legate alla eliminazione/metabolismo alcool
INDIRETTI
Sostanze modificate dall’abuso recente o cronico dell’alcool
Alcool (sangue-urine-espirato) GammaGT
Etilglucuronide (EtG) Transaminasi (AST/ALT)
Volume Corpuscolare Medio (MCV)
Trasferrina carboidrato Depleta (CDT)
ACIDO URICO, TRIGLICERIDI, UREA
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata (CDT)
84
Etilometro
85
La misura dell‟alcol nell‟area alveolare è alla base del test.
I risultati ottenuti con l‟etilometro correlano con quelli gascromatografici
ottenuti nel sangue perché dopo 15 minuti dall‟assunzione l‟etanolo dell‟area
alveolare è in equilibrio con quello ematico.
Il principio analitico usato nello strumento si basa su un rivelatore posto sul
cammino dell‟aria espirata. Il rivelatore può essere elettrochimico,
all‟infrarosso, a semiconduttore o amperometrico. La misura fatta
sull‟espirato, moltiplicata per 2.300, dà con ottima approssimazione il valore
dell‟alcolemia.
Etilometro
In base al regolamento applicativo del nuovo codice della strada questo è
l‟unico strumento legale per controllare lo stato di ebbrezza dei guidatori.
Alcuni modelli sono studiati appositamente per le Forze dell‟ordine: fanno riferimento al limite
consentito dal Codice della Strada per la guida di autoveicoli (0,50 g/l), rendendo sicura ed
immediata l‟interpretazione del risultato.
È sufficiente soffiare per pochi secondi nel boccaglio. Il valore alcolemico appare sul display dopo alcuni
secondi.
Per legge si devono fare due misure, separate da almeno 5 minuti (per evitare sopra-valutazioni dovute alla
presenza di alcol buccale) e i due valori devono essere concordi .
Impieghi: Screening, Forze di Polizia, Prevenzione, Ser.T, Comunità terapeutiche, Discoteche, Pronto
Soccorso, Trasporti, Industria, Lavoro.
86
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata (CDT)
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Le metodiche enzimatiche
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Le metodiche enzimatiche, seppur dotate di un buon livello di
precisione e di accuratezza risultano dotate di sensibilità e specificità
sufficienti per fini clinici, ma non per fini giuridici.
Il rischio di ottenere “falsi positivi” (per limiti di specificità) o “falsi
negativi” (per limiti di sensibilità) comporta la necessità, per le analisi
con valenza medico-legale, di confermare sia i risultati positivi che
quelli dubbi con metodiche gas-cromatografiche.
La reazione enzimatica
89
Principio della procedura: colorimetrico (metodo con lastrina ).
La lastrina è caratterizzata da una struttura multistrato su supporto in poliestere.
Sulla lastrina viene depositata una goccia di campione del paziente.
L‟etanolo nel campione viene ossidato tramite alcool deidrogenasi (ADH) in acetaldeide.
Il coenzima (NAD+) è trasformato nella forma ridotta (NADH). Il tampone
(idrossimetil)amminometano (TRIS) negli strati di reazione trattiene l‟acetaldeide per portare la
reazione a compimento.
La densità di riflettanza del NADH viene misurata ed è proporzionale alla concentrazione di
etanolo nel campione.
NADH ha un picco di assorbimento a 340 nm (UV)
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata(CDT)
90
HPLC (High Performance Liquid Chromatografy)
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Nell‟HPLC campione e l‟eluente sono spinti a scorrere all‟interno della
fase stazionaria applicando notevoli pressioni (dell‟ordine di centinaia di
atmosfere).
Vantaggi:
• la dimensione ridotta della colonna che evita problemi di deviazioni
longitudinali (movimenti della fase mobile longitudinali) e di percorsi
alternativi;
• velocità di eluizione (passaggio della fase mobile attraverso la
colonna) costante e regolabile;
• velocità di esecuzione ridotta;
• piccole quantità di composto necessaria all'analisi (nell'ordine dei 5-10
microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente)
• elevata accuratezza e precisione.
Deriva dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi.Nella cromatografia classica il componente principale è la colonna che contiene la fase stazionaria all‟interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall‟eluente.
CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI
• Laboratorio di base nell’ambito della Biochimica Tossicologica
LABORATORIO DI 1° LIVELLO CHE ESEGUE SOLO TEST INIZIALI (o di screening)
• Laboratorio SPECIALIZZATO nell’ambito della Biochimica Tossicologica
LABORATORIODI II° LIVELLO CHE ESEGUE SIA LE ANALISI INIZIALI CHE DI CONFERMA
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Gas-cromatografia dello spazio di testa
• Quando si devono analizzare tracce di composti volatili in campioni solidi la tecnica più adatta a questo scopo è la gascromatografia dello spazio di testa.
• Essa consiste nell’iniettare nella colonna del cromatografo il vapore che si trova in equilibrio termodinamico con il campione da analizzare.
94
• Ciò permette di lavorare su una frazione arricchita delle specie chimiche ad elevate pressioni di vapore, senza gli inconvenienti che possono scaturire dalla iniezione di sostanze non volatili.
• Si realizzano così analisi molto precise e riproducibili, a patto però di controllare rigorosamente le condizioni operative.
95
• Procedendo all’analisi gascromatograficadello spazio di testa si otterrà un cromatogramma il cui picco che ci interessa avrà una superficie S, proporzionale alla concentrazione della sostanza nel vapore e quindi nella fase liquida.
La tecnica dello spazio di testa consente di individuare tracce di composti volatili a livello di di ppt (parti per trilione), perché la fase di vapore è ovviamente più ricca, nel composto volatile del della soluzione originaria. In sostanza, lo spazio di testa può essere visto dunque come un metodo di preconcentrazione.
96
analita
Camera di ionizazione
fascio ionico
Campo elettrico acceleratore
Campo magnetico analizzatore
Spettrometria di massa• In uno spettrometro di massa il campione viene portato in fase gassosa e le
molecole vengono frammentate per bombardamento con elettroni.
• Gli ioni che si formano , accelerati da un campo elettrico posto in un campo magnetico, percorrrono traiettorie diverse secondo il rispettivo rapporto carica/massa e perciò si separano tra di loro.
Lo spettro (così chiamato solo perché è a righe, non perché si tratti di una spettroscopia) ottenuto, consente, dall’identificazione dei frammenti in base alla loro massa atomica, di ricostruire la formula della molecola presente.
Molto più semplicemente, negli strumenti moderni lo spettro viene confrontato dal computer con i numerosi spettri memorizzati nella banca dati.
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50 100 150 200 massa relativa
Ab
bo
nd
anza
rel
ativ
a
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• Lo spettrometro di massa rappresenta il rivelatore ideale per la gascromatografia, perchè permette di analizzare in tempo reale i singoli picchi in uscita dalla colonna, effettuando sia un’analisi qualitativa che quantitativa, mediante il confronto dello spettro ottenuto con uno dei numerosi spettri memorizzati nella banca dati.
Accoppiamento GC-MS.
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata(CDT)
99
ALCOLURIA /1
100
L‟etanolo urinario non è un buon indicatore per valutare lo stato di ebbrezza,
data l‟estrema variabilità della concentrazione, a parità di assunzione.
Tuttavia, la maggiore permanenza dell‟etanolo nelle urine, rispetto al sangue,
lo rende utile per monitorare l‟astinenza: a questo scopo occorre che l‟esame
venga richiesto quasi giornalmente, a causa del basso tempo di emivita
dell‟etanolo.
L‟etanolo, persiste in circolo per circa 6 ore e si ritrova nelle urine fino a 12
ore dopo l‟assunzione. Per monitorare assunzioni precedenti tale intervallo,
sono indicati altri marcatori.
Rispetto al sangue, le urine hanno il grosso vantaggio di non richiedere
prelievi invasivi.
ALCOLURIA /2
101
La presenza di etanolo nelle urine va valutata caso per caso.
La positività a bassi valori di concentrazione (30-50 mg/dL) in urine prelevate
dopo pranzo è poco significativa mentre è preoccupante se il prelievo è fatto
di mattina.
Un solo valore positivo non significa nulla mentre più valori positivi indicano
evidentemente l‟assunzione cronica di alcol.
Valori positivi in persone che dovrebbero essere astinenti sono ovviamente
indice di interruzione dello stato di sobrietà.
Le metodiche analitiche sono le stesse che per l‟alcolemia.
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata(CDT)
102
γ-GT: GAMMA-GLUTAMIL TRANSFERASI
• Risulta essere un test di primo livello nella diagnosi di consumo cronico di alcol. La γ-GT sierica aumenta per un meccanismo di induzione enzimatica indipendentemente dalla presenza o meno di danno epatico alcol-correlato.
• Emivita: 2-3 settimane dopo la completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.
• Falsi positivi: pancreatite, diabete, obesità; azione enzimoinducente di alcuni farmaci (barbiturici, antiepilettici, anticoagulanti).
• Sensibilità: 34-85 %. Specificità: 11-85 %.
103
MCV: VOLUME CELLULARE MEDIO
• L'aumento dell'MCV riscontrabile negli etilisti è secondario sia all'azione tossica diretta dell'acetaldeide sulla replicazione dei precursori degli eritrociti a livello midollare, sia all'interferenza esercitata dall'etanolo sull'assorbimento intestinale di acido folico e vit. B12.
• Emivita: circa 3 mesi dopo la completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.
• Falsi positivi: carenza di folati, vit. B12, patologie epatiche non alcol-correlate, ipotiroidismo, tabagismo.
• Sensibilità: 32 %. Specificità: 94 %.
GGT + MCV• L'incremento combinato di tali parametri garantisce una maggiore
specificità e sensibilità nell'identificazione del consumo eccessivo di bevande alcoliche.
• Sensibilità: 17-63 %. Specificità: 74-98 %.
104
TRANSAMINASI
AST: ASPARTATO AMINOTRANSFERASIALT: ALANINA AMINOTRANSFERASI
Tali enzimi sono più indicati per constatare un danno epatico piuttosto che un consumo di bevande alcoliche.
• Un maggiore incremento delle AST rispetto alle ALT fa propendere per un danno epatico alcol-correlato.
• Emivita (AST e ALT): 2-3 settimane dopo completa astensione dall'uso di bevande alcoliche.
• Falsi positivi: epatopatia non alcolica (incremento AST + ALT), disordini muscolari(incremento AST), infarto miocardico (incremento AST).
• Sensibilità (AST): 15-69 %. Specificità (AST): bassa.• Sensibilità (ALT): 26-58 %. Specificità (ALT): bassa.
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ALTRI MARKERS DI ALCOLISMO CRONICO
ACIDO URICO, TRIGLICERIDI, UREA In caso di consumo di bevande alcoliche possiamo ritrovare tali
parametri biochimici incrementati per i danni metabolici conseguenti.
5-HTLO (5-idrossi-triptololo ) urinario, Dolicolo urinario, Malonil-dialdeide, β-esosaminidasi, addotti proteici dell’Acetaldeide:
non vi sono evidenze significative che queste determinazioni apportino ulteriori elementi di specificità e sensibilità nella diagnosi di assunzione alcolica acuta e cronica
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Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata (CDT)
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Etil glucuronide: che cosa è?
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Che cosa è?
• E’ un metabolita diretto dell’alcool etilico (EtOH)
• Circa lo 0,02% dell’Alcool viene escreto come EtG
• Si forma per coniugazione dell’EtOH con l’acido glucuronico (nel fegato)
• La glucuronazione serve a rendere più solubili le sostanze che così vengono escrete più facilmente con le urine
Alcolemia, alcoluria e biomarcatori correlati
1) ALCOLEMIA
• Etilometro
• Metodiche enzimatiche (test di screening o di 1° livello)
• Metodiche Gas-Cromatografiche (GC) e Spettrometria di Massa (MS): test di conferma o di 2° livello
2) ALCOLURIA
3) BIOMARCATORI• γ-GT, MCV, Transaminasi
• Etil-glucuronato (EtG)
• Transferrina desialata (CDT)
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CDT: TRANSFERRINA DESIALATA
• Rappresenta uno dei più recenti marcatori biologici di consumo alcolico. L'aumento della CDT è secondario all'inibizione della glicosilazione proteica indotta dall'etanolo e dall'acetaldeide.
• I valori della CDT aumentano dopo almeno 7 giorni di assunzione di etanolo in quantità comprese tra 50-80 g/die e si mantengono elevati per almeno 15-20 giorni.
• È stato evidenziato che tale marker possiede una maggiore sensibilità (39%) nell'uomo rispetto alla donna, nella quale è stata riscontrata una maggiore sensibilità dell'MCV (40%).
• Nei pazienti giovani (tra 20 e 40 anni nell'uomo e tra 20 e 30 anni nella donna) la CDT aumenta più spesso rispetto ai restanti convenzionali marker di consumo alcolico (MCVe GGT).
111
Transferrina desialata /1
112
La transferrina è la più importante proteina di trasporto del ferro.
È sintetizzata principalmente dagli epatociti.
È una molecola estremamente eterogenea (isoforme della stessa molecola)
per la presenza di due catene glicosidiche con un numero variabile di
ramificazioni, ciascuna delle quali termina con un residuo di acido sialico (un
carboidrato).
La principale isoforma (64% - 80%) della transferrina contiene 4 residui di
acido sialico per cui è detta tetrasialo-trasferrina.
In conseguenza dell‟abuso cronico di alcol, è stato documentato un abnorme
aumento di isoforme desialate, normalmente presenti in piccole
concentrazioni nel siero di soggetti sani ed in particolare della disialo-
trasferrina ed in misura minore anche della asialo-trasferrina, indicate con il
termina di CDT (Carbohydrate Deficient Transferrin,Trasferrina carente di
carboidrati)
Transferrina desialata /2
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La CDT attualmente costituisce l‟indicatore più specifico dell‟abuso cronico di
alcol con una specificità che in diversi lavori risulta variabile dal 90 al 100%
Aumenti di CDT indipendenti dall‟assunzione di alcol sono stati riportati in
•Gravidanza
•Grave unsufficienza epatica causata da cirrosi biliare primitiva
•Epatite cronica attiva
•Carcinoma epatocellulare
•Galattosemia
•Fibrosi cistica
•Sindromi da deficienza glicoproteica (disordini del metabolismo delle
glicoproteine)
•Varianti genetiche della transferrina: variazioni del Punto Isoelettrico della
molecola (dovuti alla sostituzione – genetica - di alcuni aminoacidi nella catena
polipeptidica) possono interferire con la determinazione della CDT.
Valori di rif. (nel n/s laboratorio) = < 2%
N.B. Nelle donne sane le concentrazioni di CDT sono mediamente maggiori
rispetto a quelle della popolazione maschile.