extraccion de adn plasmidico

8/18/2019 Extraccion de Adn Plasmidico

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UNIVERSIDAD POLITECNICA DE TLAXCALA.

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA.

GENETICA MOLECULAR

“EXTRACCION DE ADN PLASMIDICO”

FACILITADOR

M.B.A. AMADO ISRAEL GRANDES BLANCO

ALUMNOS:

CRUZ CERVANTES EDITH

SANDOVAL SOSA FAVIAN SALVADOR

5 DE MARZO DE 2016

OBJETIVO


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EL OBJETIVO DE ESTE EXPERIMENTO ES INTRODUCIR LOS PRINCIPIOS DE LA EXTRACCINDE ADN PLASM!DICO A PARTIR DE C"LULAS BACTERIANAS.

LOS ESTUDIANTES APRENDER#N LA ESTRUCTURA $ FUNCIN DE LOS PL#SMIDOS DEADN.

%UE LOS ALUMNOS DE LA INGENIER!A APRENDAN A ANALIZAR MICROBIOLGICAMENTEUNA MUESTRA.

CONOCER LA METODOLOG!A B#SICA PARA EXTRACCIN DE ADN PLASM!DICO DEBACTERIAS.

DETERMINAR LA INTEGRIDAD DEL ADN PLASM!DICO POR ELECTROFORESIS EN GEL DEAGAROSA.

INTRODUCCION.

LOS PL#SMIDOS SON MOL"CULAS DE DNA EXTRACROMOSOMAL LOS CUALES EST#NPRESENTES EN ALGUNAS C"LULAS BACTERIANAS& LEVADURAS $ HONGOS. LOS MISMOSPOSEEN DNA DE DOBLE HEBRA& MA$ORMENTE SON CIRCULARES PERO TAMBI"N SE HANENCONTRADO PL#SMIDOS LINEALES. LA REPLICACIN DE LOS PL#SMIDOS ESINDEPENDIENTE DE LA REPLICACIN DEL CROMOSOMA DEL HU"SPED $A %UE LOSPL#SMIDOS POSEEN SU PROPIO ORIGEN DE REPLICACIN. EL N'MERO DE COPIAS DE UNPL#SMIDO EN LA C"LULA ES VARIABLE& TODO DEPENDE DEL ORIGEN DE REPLICACINDEL %UE POSEA EL MISMO $ SU REGULACIN. LOS PL#SMIDOS NO SON ESENCIALESPARA EL DESARROLLO O SUPERVIVENCIA DE LA C"LULA PERO LE PROVEEN UNA VENTAJACOMPETITIVA A LAS C"LULAS %UE LOS POSEEN& DADO A %UE LOS PL#SMIDOS POSEENGENES %UE LE CONFIEREN CARACTER!STICAS SELECTIVAS A SU HU"SPED TALES COMO

RESISTENCIA A ANTIBITICOS& NUEVAS HABILIDADES METABLICAS COMODEGRADACIN DE CARBOHIDRATOS& FACTORES DE VIRULENCIA $ PRODUCCIN DE TOXINAS ENTRE OTROS. LOS PL#SMIDOS POSEEN UN INTER"S SINGULAR EN INGENIER!AGEN"TICA POR SER UNO DE LOS SISTEMAS VECTORES M#S SENCILLOS DE USAR. UNVECTOR DE CLONACIN ES UN SISTEMA %UE PERMITE INTRODUCIR EN UNA C"LULAHOSPEDADORA UN FRAGMENTO DE DNA %UE SE PRETENDE CLONAR( EN ESTA C"LULAHOSPEDADORA EL VECTOR SE REPLICA $ EXPRESA& EN SU CASO. LA MOL"CULA %UERESULTA DE LA UNIN DE UN DNA VECTOR CON EL DNA DE INTER"S )DENOMINADOENTONCES *INSERTO*+ SE DENOMINA MOL"CULA DE VECTOR RECOMBINANTE. EXISTENUNOS RE%UERIMIENTOS B#SICOS %UE UN PL#SMIDO DEBE POSEER PARA %UE SEA UNBUEN VECTOR AL APLICAR SU USO EN LA BIOLOG!A MOLECULAR.

DEBE POSEER UN ORIGEN DE REPLICACIN& UN GEN PARA UN MARCADOR DE SELECCIN)$A SEA RESISTENCIA A ALG'N ANTIBITICO+ $ UN LUGAR DE CLONAJE M'LTIPLE )MCS+.

EL MCS ES UNA REGIN DONDE PUEDEN DIGERIR VARIAS ENZIMAS DE RESTRICCINPERO SOLAMENTE UNA VEZ. EXISTEN DIVERSOS M"TODOS PARA EL AISLAMIENTO DEPL#SMIDOS.


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LAS T"CNICAS DE MINIPREPS O MINI PREPARACIONES DE PL#SMIDOS& PERMITEN LARECUPERACIN DE PL#SMIDOS DE DNA CIRCULAR SOBRE EL DNA CROMOSOMAL. EL TRATAMIENTO DE LAS C"LULAS CON UNA BASE DE PH ALTO O UN DETERGENTEINTERRUMPE EL APAREAMIENTO DE LAS BASES NITROGENADAS& OCASIONANDO %UE ELDNA CROMOSOMAL SE DESNATURALICE $ SE SEPARE. POR EL CONTRARIO LACONFIGURACIN SUPERENRROLLADA DEL PL#SMIDO SE MANTIENE ESTABLE.

METODOLOGIA

EXISTEN DIVERSOS PROTOCOLOS PARA REALIZAR LISIS ALCALINA PERO TODOS SE RIGENPOR LOS SIGUIENTES PASOS B#SICOS.

A. REMOVER LAS C"LULAS DEL MEDIO DE CULTIVO EN CALDO MEDIANTECENTRIFUGACIN.B. DESCARTAR EL SOBRENADANTE PARA REDUCIR CONTAMINACIN MEDIANTEFRAGMENTOS DE LA PARED CELULAR DEL HU"SPED.

C. RESUSPENDER LAS C"LULAS EN UN AMORTIGUADOR %UE CONTENGA TRIS& EDTA $GLUCOSA.D. LISAR LAS C"LULAS CON NAOH $ SDS.E. UNIN DE LAS HEBRAS DE DNA $ REMOCIN DE CONTAMINACIN MEDIANTE ELACETATO DE POTASIO.F. PRECIPITACIN DEL DNA DE PL#SMIDO MEDIANTE ALCOHOL )ETANOL OISOPROPANOL+ $ UNA SAL )ACETATO DE AMONIO& CLORURO DE LITIO& CLORURO DESODIO O ACETATO DE SODIO+. G. ENJUAGUE DEL MATERIAL GEN"TICO CON ETOH AL ,0-. H. RESUSPENDER ELMATERIAL GEN"TICO.

EQUIPO.CENTRIFUGA CON ROTOR PARA TUBOS EPENDORFC#MARA DE ELECTROFORESIS HORIZONTALINCUBADORAREFRIGERADOR

MATERIAL.PUNTAS BLANCAS NUEVAS $ EST"RILESMICROPIPETA DE 1001000 ULMICROPIPETA DE 20200 ULMICROPIPETA DE 0.5 10

PUNTAS AMARILLAS NUEVAS $ EST"RILESMECHEROS TUBOS EPENDORF DE NUEVOS $ EST"RILESPUNTAS AZULES NUEVAS $ EST"RILESGRADILLA PARA TUBOS EPENDORF

REACTIVOS.SOLUCIN DE LISIS ALCALINA 1&2 $ /AGUA LIBRE DE DNASASISOPROPANOLETANOL AL ,0-


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AGAROSA S$BR GREENHIELO

DIAGRAMA DE DESARROLLO.

PASO 3 RETIRAR ELCALDO DEL TUBO SIN

DESHACER EL

PASO 2 RETIRAR EL TUVE DE

REFRIGERACIN $

PASO 1PREPARACIN DEAGAR& INOCULAR

ESCHERICHIA COLIDEJANDO REPOSAR A

/, EN UN TUBOFALCN POR 1 HRS&

POSTERIORMENTE

PASO 4 EN ZONAEST"RIL EXTRAER EL

SEDIMENTO $COLOCARLO DENTRO

DE UN TUBO

PASO 6 AGREGAR /00ML DEDETERGENTE $ 200ML DE

SOLUCIN 2 AL TUBO EPENDORF

PASO 5 MANTENERSOLUCIONES A EN

PASO 7 AGREGAR/50ML DE SOLUCIN/ $ CENTRIFUGAR A

1200 REVOLUCIONESPASO INSERTAR LOOBTENIDO EN UN TUBO

EPENDORF CONCOLUMNA $ AGREGAR

SOLUCIN $ 5CENTRIFUGANDO DE

PASO ! ENCUBAR A 55 POR5 MIN $ CENTRIFUGAR


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RESULTADOS.

CARRIL 13 EXTRACCIN CORRECTA DE ADN.

CARRIL 23 EXTRACCIN CORRECTA DE ADN.CARRIL /3 EXTRACCIN CORRECTA DE ADN.



CARRIL 63 EXTRACCIN INCORRECTA DE ADN.

PASO 1" EXTRAER ELSEDIMENTO OBTENIDOPARA CORRER EL GEL.

PASO 11 OBTENCIN DE


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DISCUSION.

LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA EXTRACCIN DE ADN FUE FAVORABLE $A %UE SEUTILIZARON DISTINTAS SOLUCIONES %UE PERMITIERON HACER DIFERENTES FUNCINESSOBRE EL ADN %UE SE EXTRAJO.

LA PURIFICACIN DEL DNA PL#SMIDICO SE COMPLETA ENTONCES POR PRECIPITACINCON ETANOL. LO CUAL FUE POSIBLE OBTENER DNA PLASM!DICO CON DIFERENTE GRADODE SUPERENRROLLAMIENTO %UE SE PUEDE VISUALIZAR TRAS LA SEPARACIN PORELECTROFORESIS.

ARTICULO 1. LA SOCIEDAD ESPA4OLA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS $MICROBIOLOG!A CL!NICA

PERE COLL M. TERESA CO%UE& M. ANGELES DOM!NGUEZ& JULIO V#Z%UEZ JORDI

SE REALIZ UN ESTUDIO CIENT!FICO SOBRE3

LA T"CNICA DE MLST CONSISTE EN EL AN#LISIS MEDIANTE SECUENCIACIN DEL ADN DEFRAGMENTOS INTERNOS DE UN N'MERO DETERMINADO DE GENES CODIFICANTES DEDISTINTOS ENZIMAS METABLICOS BACTERIANOS )HOUSEEEPING GENES+. LACOMPARACIN DE ESTAS SECUENCIAS ENTRE DISTINTOS AISLADOS PERMITEESTABLECER IDENTIDADES O DIFERENCIAS CLONALES DE UTILIDAD EN EL AN#LISISEPIDEMIOLGICO BACTERIANO. EL HECHO DE UTILIZAR ENZIMAS METABLICOS& NOSOMETIDOS A PRESIN SELECTIVA& PERMITE DETECTAR VARIACIONES NEUTRAS %UE

DEFINEN L!NEAS CLONALES RELATIVAMENTE ESTABLES. POR LO TANTO& MLST ES UNMARCADOR MOLECULAR DE APLICACIN EN EPIDEMIOLOG!A GLOBAL O A LARGO PLAZO.PARA CADA ESPECIE BACTERIANA& ES PRECISO ESTABLECER UN GRUPO DE GENESMETABLICOS A ESTUDIAR. EL ES%UEMA DE MLST DESARROLLADO PARA CEPAS DEMENINGOCOCO UTILIZA FRAGMENTOS INTERNOS DE LOS SIGUIENTES GENES3 ABCZ)TRANSPORTADOR ABC+& AD )ADENILATO INASA+& AROE )SIIMATO DESHIDROGENASA+&FUMC )FUMARATO HIDRATASA+& GDH )GLUCOSA6FOSFATO DESHIDROGENASA+& PDHC)PIRUVATO DESHIDROGENASA+& PGM )FOSFOGLUCOMUTASA+. EL PROCEDIMIENTOCONSTA DE LAS SIGUIENTES FASES3 I+ EXTRACCIN ADN II+ AMPLIFICACIN DE LOS

GENES METABLICOS III+ REACCIN DE SECUENCIACIN EN EL CASO DE NMENINGITIDIS& LOS INICIADORES %UE SE UTILIZAN PARA LA AMPLIFICACIN SONDIFERENTES A LOS %UE SE UTILIZAN EN LA SECUENCIACIN. EN OTROS CASOS& COMONEUMOCOCO O ESTAFILOCOCOS& LOS INICIADORES SON LOS MISMOS EN AMBOSPROCESOS.


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LA IMAGEN MUESTRA EL AN#LISIS DE POLIMORFISMOS PL#SM!DICOS.)M"TODO DEBIRNBOIM DOL$ $ PURIFICACIN POSTERIOR CON RESINAS DE INTERCAMBIO INICO+.ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA DE LOS PATRONES DE BANDASCORRESPONDIENTES A PL#SMIDOS DE DIFERENTES CLONES DE LEBSIELLAPNEUMONIAE PRODUCTORES DE TEM TRAS DIGESTIN ENZIM#TICA CON ECORI $

PSTI. ESTE ENSA$O PERMITI DEMOSTRAR UNA EPIDEMIA PLASM!DICA EN NUESTRAINSTITUCIN. EL ADN PLASM!DICO FUE OBTENIDO A PARTIR DE TRANSCONJUGANTESUTILIZANDO COMO CEPA RECEPTORA E. COLI BM21( L!NEA A1A& ADN PLASM!DICOOBTENIDO DE CUATRO CLONES DE . PNEUMONIAE TRAS DIGESTIN ENZIM#TICA CONPSTI( L!NEA A5 & ADN PLASM!DICO OBTENIDO DE CUATRO CLONES DE . PNEUMONIAE TRAS DIGESTIN ENZIM#TICA CON ECORI( L!NEA M1& MARCADOR DE PESO MOLECULAR I)ROCHE DIAGNOSTICS+ $ L!NEA M2& ADN MARCADOR DE PESO MOLECULAR III )ROCHEDIAGNOSTICS+. TRES DE LOS PL#SMIDOS TEN!AN PERFILES ID"NTICOS $ EL OTRODIFER!A EN 2 BANDAS CON RESPECTO A ESTE PERFIL UTILIZANDO DIFERENTES ENZIMASDE RESTRICCIN& LO CUAL PERMITI ESTABLECER LA RELACIN EPIDEMIOLGICA DE

"STE CON EL PERFIL DE LOS PL#SMIDOS ANTERIORES. )IMAGEN TOMADA DE CO%UE ETAL& ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER 2002( 63500+.

CONCLUSION.

LOS PL#SMIDOS SE UTILIZAN EN INGENIER!A GEN"TICA POR SU CAPACIDAD DEREPRODUCIRSE DE MANERA INDEPENDIENTE DEL ADN CROMOSOMAL COMO AS TAMBI"N POR%UE ES RELATIVAMENTE F#CIL MANIPULARLOS E INSERTAR NUEVASSECUENCIAS GEN"TICAS. LOS PL#SMIDOS USADOS EN INGENIER!A GEN"TICA SUELENCONTENER UNO O DOS GENES %UE LES CONFIEREN RESISTENCIA A ANTIBITICOS $

PERMITEN SELECCIONAR CLONES RECOMBINANTES LOS CUALES EST#N BASADOS ENFLUORESCENCIA O EN PROTE!NAS %UE DESTRU$EN LAS C"LULAS SIN USO DEANTIBITICOS.

LOS PL#SMIDOS A MENUDO CONTIENEN GENES O PA%UETES DE GENES %UE CONFIERENUNA VENTAJA SELECTIVA LO CUAL LES DA LA HABILIDAD DE HACER A LA BACTERIARESISTENTE A LOS ANTIBITICOS. CADA PL#SMIDO CONTIENE AL MENOS UNASECUENCIA DE ADN %UE SIRVE COMO UN ORIGEN DE REPLICACIN LO CUAL HABILITA ALADN PARA SER DUPLICADO INDEPENDIENTEMENTE DEL ADN CROMOSOMAL.

BIBLIOGRAFIA.

SAMBROO& J. AND D. RUSSELL. 2001. MOLECULAR CLONING3 A LABORATOR$ MANUAL&/RD EDITION. COLD SPRING HARBOR& N$. PP 5.& 5.,6.

CURRENT PROTOCOLS AND MOLECULAR BIOLOG$. JOHN ILE$ AND SONS& INC. 1777.


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SUPLEMENTO 5. BRON& T. A. )2006+. GENE CLONING AND DNA ANAL$SIS 3 ANINTRODUCTION. OXFORD& U ( MALDEN& MA& BLACELL PUB.IMPRESO.

ALBERTS B.& BRA$ D.& LEIS J.& RAFF M.& ROBERTS .& ATSON J.D. BIOLOG!A MOLECULARDE LA C"LULA )1776+ OMEGA.

GLIC B. AND PASTERNA. MOLECULAR BIOTECHNOLOG$ )177+ ASM PRESS.

LODISH H& BALTIMORE D.& BER A.& ZIPURS$ S.L.& MATSUDARIA P.& DARNELL JMOLECULAR CELL BIOLOG$ )1775+ SCIENTIFIC AMERICAN BOOS.

OLD R..& PRIMROSE S.B. PRINCIPIOS DE MANIPULACIN GEN"TICA )17,+ EDITORIALACRIBA S.A.

HARD$& .G. PLASMIDS& A PRACTICAL APPROACH )17,+ IRL PRESS.

MANIATIS& T.& FRITSCH& E.F. 8 SAMBROO& J. MOLECULAR CLONING& A LABORATOR$MANUAL )172+ COLD SPRING HARBOR LABORATOR$.

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