EXTRACCION DE ADN EN SANGRE Y EN MOSQUITO Y

ELECTROFORESIS

Edin Arroyo, Leonardo Chamorro, José Martínez, Libardo caraballo

Universidad de Sucre. Facultad de Educación y Ciencias. Departamento de

Biología. Programa de Biología. Laboratorio de parasitología molecular.

RESUMEN

El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su

correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación

de proteínas. Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de

ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales

con el fin de extraer material genético de muestras de sangre y de mosquito.

Este método consiste en la utilización de altas concentraciones de sales

acetato de amonio para precipitar proteínas y posteriormente precipitar ADN

con alcohol absoluto, para comprobar los resultados de la extracción se realizo

un electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el

gel de agarosa. Este método resulta ser viable para la extracción de ADN en

ambas muestras.

Palabras claves: extracción de ADN, electroforesis, sangre, , mosquito,

acetato de amonio, gel de agarosa.

INTRODUCCION

El ácido desoxirribonucleico,

frecuentemente abreviado como

ADN o DNA, del inglés

DeoxyriboNucleic Acid, es una

macromolécula que forma parte de

todas las células. Contiene la

información genética usada en el

desarrollo y el funcionamiento de los

organismos vivos conocidos y de

algunos virus, siendo el responsable

de su transmisión hereditaria.

La extracción de ADN de una

muestra celular se basa en el hecho

de que los iones salinos son

atraídos hacia las cargas negativas

del ADN, permitiendo su disolución

y posterior extracción de la célula.

Se empieza por lisar (romper) las

células mediante un detergente o un

buffer de lisis, vaciándose su

contenido molecular en una

disolución tampón en la que se

disuelve el ADN. En ese momento,

el tampón contiene ADN y todo un

surtido de restos moleculares: ARN,

carbohidratos, proteínas y otras

sustancias en menor proporción.

Las proteínas asociadas al ADN, de

gran longitud, se habrán fraccionado

en cadenas más pequeñas y

separadas de él por acción del

buffer de lisis. Sólo queda, por

tanto, extraer el ADN de

esa mezcla tampón y detergente,

para lo cual se utiliza etanol frio.

MATERIALES Y METODO

Extracción de ADN en sangre

Para la extracción de ADN se tomo

una muestra de sangre (250 µL) a la

cual se le adiciono 250 µL de buffer

de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2

M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm pH

8,25; SDS 0,05 %).A esta solución

de le adiciono proteínas K a una

concentración de 10mg/ml. Se

incubó a 65 °C por una hora y luego

de le adicionó 500 µL de acetato de

potasio 8M se incubo durante 30

minutos en hielo y posteriormente

se centrifugo a 13000 rpm durante

15 minutos. Sele adiciona 100 µL

de etanol y se incubo a temperatura

ambiente por 10 minutos. Se vuelve

a centrifugar por 15 minutos y el

precipitado se lavo con etanol al

70% dos veces. Se seca a

temperatura ambiente y se

resuspende en 20 µL de buffer TE.

Extracción de ADN del mosquito.

El ejemplar de mosquito fue

triturado en 50ml de tampón de lisis.

Esta solución se incubo por 1hr a

65°C. Se adicionaron 14µl de

acetato de potasio 8M y se incubo

por 30min en hielo, posteriormente

se centrifugo a 13000 rpm durante

15min. Y se incubo a temperatura

ambiente por 10min en etanol

absoluto. Se volvió a centrifugar a

13000rpm y el precipitado se lavo

dos veces con etanol al 70%. Se

seco a temperatura ambiente y se

resuspendio en 20µl de buffer TE

Se lavó con 500µL de etanol al

70%, se centrifugó a 12000 rpm por

10 min y se descarto el

sobrenadante. El precipitado se dejó

secar a temperatura ambiente y por

último se re suspende con 100 µL

de agua.

ELECTROFORESISDespués de realizar la extracción de

ADN, tanto del vector como de la

muestra de sangre se procedió a

realizar la electroforesis, la cual se

realizo en gel de agarosa 1%. Las

muestras de DNA tanto de sangre

como de mosquito se disolvieron en

un buffer de carga (Green) en una

proporción 8:2µl respectivamente.

Posterior a esto se hizo la siembra

en los posos y se procedió a realizar

el corrido.

RESULTADOSFig.1 Corrido de las muestras de ADN en el gel de agarosa.

ANALISIS DE RESULTADO

En la práctica realizada se obtuvo

DNA de sangre y de mosquito

mediante el método de altas

concentraciones de sales. Se utilizo

buffer de lisis, cuya función es

romper la membrana celular y

nuclear, permitiendo esto la

liberación del ADN. Dicho buffer,

para la extracción de ADN de

sangre, contenía Proteinasa K, es

una proteasa que degrada las

proteínas de membrana y facilita su

lisis, liberando el ADN.

Químicamente la proteinasa K actúa

a nivel de los péptidos en los

grupos carboxílicos alifáticos y

aminoácidos aromáticos propios en

los lípidos de membrana. Este

proceso de lisis de membrana fue

complementado con el baño de

María que a 65 0c activa de forma

eficiente a la proteinasa K. La

remoción de proteína y

contaminantes se realiza por

centrifugación adicionando alcohol,

obteniendo un sobrenadante

compuesto por restos de

membrana, organelas celulares,

protoplasma y restos de

hemoglobina, esto para el caso del

ADN extraído de sangre, debido a

que la extracción de ADN de

mosquito no se utilizo la proteinasa

K.

Después de la ruptura celular y la

eliminación del pellet de restos

celulares, se añade una sal para

disminuir la solubilidad de las

proteínas por incremento de la

fuerza iónica del solvente, lo que se

conoce como precipitación por

salado. Después de la adición

de cierta cantidad de sal, se

establece una competencia entre

los grupos cargados y polares de la

proteína y los iones de la sal (en

mayor número) por las moléculas de

agua que disminuye la capa de

solvatación alrededor de la molécula

proteica, sus grupos hidrofóbicos

superficiales se exponen y se

favorece el establecimiento de

interacciones intermoleculares, la

agregación y por tanto, la

precipitación. Cuando se centrifuga

se obtiene un precipitado blanco. El

pH puede variar la solubilidad de las

proteínas ya que los grupos pueden

cargarse o descargarse haciendo la

superficie más o menos polar. A pH

isoeléctrico las repulsiones

intermoleculares son mínimas ya

que la carga neta es cero. Las

características del anión y del catión

también son importantes. Las sales

más efectivas son las que presentan

aniones polivalentes mientras que

los cationes son menos importantes,

no obstante se prefieren los

monovalentes. Con el sobrenadante

se procede de igual forma,

separando las proteínas con

solventes orgánicos y precipitando

el DNA de la fase acuosa con etanol

absoluto.

La muestra es lavada y precipitada

con alcohol al 70% del cual el 40%

es alcohol y el 30 % es agua. El

alcohol se encarga de precipitar el

ADN, pues este, es soluble en agua

(y, por tanto, invisible a nuestros

ojos, pues cada molécula está

rodeada de agua y nuestra vista no

percibe moléculas individuales de

ADN) pero insoluble en alcohol, lo

cual origina que en presencia de

éste se aglutine o "se precipite". Al

aglutinarse, el ADN forma partículas

macroscópicas y se hace visible.

Finalmente el ADN es resuspendido

en buffer TE, el cual es una solución

amortiguadora del pH comúnmente

empleada en biología molecular,

especialmente para procedimientos

que buscan proteger al DNA o RNA.

La capacidad amortiguadora del

buffer depende del Tris, mientras

que el EDTA es el responsable de

proteger a los ácidos nucleicos

inactivando a las DNAsas o

RNAsas. El EDTA logra esta

inactivación actuando como

quelante de cationes divalentes

como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales

son indispensables para el

funcionamiento de estas enzimas.

Dicha muestra de ADN se utilizo

para realiza la electroforesis en gel

de agarosa, la cual demostró que el

proceso de extracción de ADN se

dio de forma correcta e incluso se

dieron resultados en la muestras de

ADN mal tratadas. Tal como se

puede observar en la imagen.

CONCLUSIONES

La proteinasa K es un buffer

de lisis del material celular, la

cual degrada los péptidos de

membrana plasmática y

nuclear, facilitando la

liberación de ADN.

El ADN se precipita en

alcohol, pues es insoluble en

este, y se torna visible en la

interfaz alcohol-H2O.

El corrido electroforético

depende de una buena

práctica de extracción de

ADN.

BIBLIOGRAFIA

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