elektroforesis zona 2014

5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014

1/13

2014/4/16

1

FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 1

ELEKTROFORESIS

ZONA


LO Bahan Kajian

Mahasiswa mampu menjelaskan dan

menerapkan pemisahan dengan elektroforesiszona beserta instrumentasi utamanya.


Elektroforesis Zona

Definisi dan Sejarah1

Perkembangan Teknik

Elektroforesis2

Instrumentasi Utama3

Faktor yang memengaruhi

pemisahan4

Elektroforesis Kertas5

Elektroforesis Selulosa

Asetat6

Elektroforesis gel alami7

Elektroforesis gel buatan8

Aplikasi9


Buku Acuan

Meloan CE. 1999. Chemical Separations:

Principles, Techniques and Experiments.

Canada, John Wiley & Sons


2/13

2014/4/16

2


Definisi dan Sejarah

Arne Tiselius

Swedia 1902-1971

Father of Electrophoresis

The Nobel Prize in Chemistry 1948

For his research on electrophoresis and adsorption analysis,

especially for his discoveries concerning the complex nature of the

serum proteins.

Serum kuda pada Pipa U dipisahkan dengan elektroforesis

menghasilkan 4 pita yang terpisah dengan baik yang terdiri

atas albumin dan 3 globulin yang diberi nama , , dan



Pemisahan ion dalam larutan berdasarkan perbedaan

ukuran dan muatan ketika tegangan tinggi diberikan pada

larutan

Muatan positif akan bergerak ke kutub negatif dan

sebaliknya

+

+

+

+

+

++

+

+

+

3

+

3

+

3

+

2

+

2

+

2

+

+

+



Keadaan struktur ionik dipengaruhi oleh

Jumlah dan keadaan gugus yang dapat diionkan

pH lingkungan

Keberadaan ion lainnya

Perbedaan dengan metode lain

Asosiasi dengan ion lawanKromatografi penukar ion

prinsip?

Pergerakan pada medan elektrik elektroforesis prinsip

Pengendapan pada elektroda elektrodeposisi / elektrolisis

prinsip


Definisi dan sejarah

Sistem fase tunggal mobilitas relatif ion

kondisi elektrik

GAYA DORONG:F (dlm elektroforesis)

Teknik dua fase

- Adsorpsi

- Solubilitas

- Pengikatan ligan

- Interaksi ion

Teknik satu fase

- Friksi molekular

- Elektrostatis

GAYA TAHANf(koefisien

friksi).v(kecepatan

partikel)


3/13

2014/4/16

3



F>=f.

F=Q.E

Q.E = f.saat Ekonstan = Q/f =

Berdasarkan Hk Stoke:

f = 6r molekul bulat

F =Q.E= 6r

U = /E =Q/6r

Q : muatan partikel;

E: kekuatan medan

: mobilitas per unitmedan listrik

r : jari-jari partikel (cm)

: viskositas medium(poises)

: kecepatanelektroforetik (cm/dt)

U: mobilitas partikel (cm2

volt-1dt-1


Contoh Soal

Tentukan mobilitas ion Ba2+dalam larutan BaCl20.0625M,jejari Ba2+dalam larutan sebesar 2.78A dan viskositas

larutan 10.31 mili poises.Jawab

Q = 2x4.8x10-10esu (electrostatic unit of charge) bagaimana cara menentukan hal ini?

r= 2.78 x 10-8cm

= 1.03 x-2poises300 volt = 1.000692145 esu

U= .

3...33= 5.9x10-4cm-2.vol-1dt-1


Definisi dan sejarah

Untuk memperhitungkan

efek ion Cl-yang ada

dalam larutan diperlukan

koreksi denganpersamaan Debye-

Huckel

u =

u : kekuatan ionik

A: konstanta: 0.2333x108

untuk air pada 25oC

r : jari-jari partikel (cm)c: konsentrasi (mol/L)

Z: valensi ion


Contoh Soal

Berdasarkan soal sebelumnya, tentukan mobilitas Ba2+ketika

dipertimbangkan keberadaan ion lainnya.

Jawab

=

=

0.06252

+ 20.06251 = 0.187489

U=

=

5.9x10;

..33 .=

4.6210;cm2volt-1dt-1


4/13

2014/4/16

4



Secara praktis digunakan

persamaan

=

=

.

k=C/R

:jarak pergerakan ion (cm)

: jarak antar elektroda (cm)

V : tegangan (volt)

t : waktu (detik)

E : kekuatan medan (volt/cm)

i : arus (amper)

q : luas penampang lintas sel (cm2)

k : konduktivitas spesifik (ohm-1cm-1)

R : tahanan larutan dalam sel (ohm)

C : konstanta sel (cm-1)


Contoh Soal

Larutan albumin telur 3% dalam bufer pH 7.2 ditempatkan pada sel

elektroforesis yang memiliki diameter 1.2cm. Digunakan arus sebesar

20mA dan albumin telur memerlukan waktu 208 menit untuk bergerak

5.87cm menuju elektroda (+). Jika konstanta sel sebesar 18.3cm -1dan

tahanan sistem sebesar 7690 ohm pada 0oC, tentukan mobilitas

albumin telur tsb.

Jawab

Tentukan konduktivitas spesifik:

k = C/R = 18.3/7690 = 0.00238 ohm-1cm-1

Tentukan nilai E: =

.=

.

(3..)(.3)= 7.43 volt/cm

Tentukan nilai U: =

=

;.

()(.3)= -6.3x10-3cm2volt-1det-1


Perkembangan teknik

elektroforesis1930 : Pipa U Tiselus

1937 : Elektroforesis Kertas disarankan oleh P Konig diaktualkan 1948 oleh EFisher

1939 : elektroforesis zona dikembangkan

1955 : gel pati (Smithies)

1957 : Selulosa Asetat (J Kohn)

1959: PAGE (polyacrylamide gels) (Raymond & Weintraub)

1961 : IEF (Svensson)

1964 : Disc gel electrophoresis (Ornstein & Davis)

1969 : SDS electrophoresis (Beber & Osborn)

1971 : Gel selulosa asetat (Meera)

1975 : Elektroforesis 2 dimensi

1977: sekuensing gel digunakan

1979 : gel agarosa

1983 : pulsed field electrophoresis

1983 : capillary electrophoresis


Perkembangan teknik

elektroforesis

Horizontal vertikal

+ -

+

+

Zona sempit

- Spot

- pita

Zona

sempit


5/13

2014/4/16

5


Instrumentasi utama

Elektroda (positif dan negatif)

Sumber tegangan

Medium

Bufer

Pewarna/deteksi


Medium

Perkembangan elektroforesis didasari oleh

perkembangan medium Kertas kertas selulosa asetat gel

Fungsi:

Reseptor spot/pita dari zat-zat terlarut

Menyediakan jalur migrasi

Medium berbeda: efektivitas pemisahan

berbeda bergantung sifat zat yang dipisahkan


Bufer

Fungsi:

Membawa arus yang diberikanjembatan konduksi

Menyediakan pH

Menentukan muatan dari zat terlarut

Kekuatan ionik bufer

Kekuatan yang tinggi menghasilkan pita yang tajam

Kekuatan yang tinggi menghasilkan panas lebih tinggi

Bufer yang biasa digunakan

Bufer barbital & Tris-EDTA untuk protein

Tris-asetat-EDTA & tris borat-EDTA


Deteksi

Dengan pewarnaan: Prinsip: diberi pereaksi spesifik

Cara: disemprot, diuapi, direndam, dll

Kadang perlu menghilangkan warna

background pada medium dengan

destaining.

Tanpa pewarnaan: Deteksi dengan UV

Densitometer/scanner

Identifikasi Mengukur jarak tempuh komponenRf

Spot dengan Rf/jarak tempuh yang sama dengan standardianggap sebagai senyawa yang sama


6/13

2014/4/16

6


Beberapa pereaksi pewarna

Pereaksi Senyawa yang dideteksi

Amido black 10 B ProteinCoomassie blue Protein

Silver nitrat Protein

Etidium bromida DNA dan RNA

Sudan black Lipid dan lipoprotein

Schiff-periodic acid Karbohidrat dan glukoprotein

Ninhydrin Asam amino


Peralatan Elektroforesis


Faktor yang memengaruhi

pemisahan

Voltase yang digunakan

Konsentrasi bufer

pH bufer Efek elektroosmotik

Efek difusi



Tegangan yang tinggi akan menyebabkan

Efek termal Penguapan bufer

perubahan mobilitas karena perubahan tegangan dan arus

Menyebabkan efek kapiler pada kertas dan gel karena akanmengambil bufer dari tempat bufer

Waktu pemisahan pendek

Panas maksimum yang dapat ditoleransi 0.15watt/cm3

Perhitungan panas:

H=

: panas yang terbentuk W/cm3


7/13

2014/4/16

7


Contoh Soal

Tentukan panas yang terbentuk pada albumin

telur di soal sebelumnya

Jawab

H=

=

.

.3.3= 0.132 W/cm3



Pada saat panas sangat tinggi dapat

ditemukan bentuk pita yang tersenyum


Konsentrasi bufer

Mempengaruhi mobilitas partikel (ingat

kembali rumus perhitungan U)

Konsentrasi bufer

viskositas bufer ?

mobilitas ion ? memerlukan konduktivitas ?

pemanasan ? efek yang muncul?

=


pH bufer

Muatan zat ampiprotik ditentukan pH lingkungannya

pH asam = kation pH basa = anion

tidak bermuatan

pH = pI


8/13

2014/4/16

8


Efek elektroosmotik

Zat berbeda hantaran berbeda

Contoh: kertas (medium) dan air (pelarut/bufer) akan

berinteraksi menimbulkan perbedaan muatan

Kertas lebih bermuatan (-) dari selulosa

Air lebih bermuatan (+)

Air ditempatkan pada tabung kapiler yang diberi

elektroda positif dan negatif, air akan bermigrasi

pada elektroda negatif


Efek difusi

Cairan cenderung mengalir

Kecepatan difusi dipengaruhi oleh Ukuran partikel: makin kecil ukuran partikel,

makin cepat berdifusi

Perbedaan konsentrasi

Suhu: makin tinggi makin mudah berdifusi


Elektroforesis kertas

Teknik pekerjaan mirip dengan kromatografi kertas

Aplikasi contoh: Cara kering:

seperti kromatografi kertas

Resolusi spot lebih baik karena lebih kecil Belum ada jembatan konduksi

Cara basah: kertas dibasahi dengan bufer lalu contoh ditetesi

Spot lebih lebar

Sudah ada jembatan konduksi

Hanya untuk molekul kecil yang mobilitasnya kecil perlupotensial tinggi (200volt/cm)panas

Efek elektroosmotik tinggi

Efek difusi besar membran selulosa asetat


Selulosa Asetat

transparan

Lebih seragam dan memberikanpemisahan yang lebih tajam dan

mengurangi efek backgroundpada pewarnaan.

Waktu pemisahan lebih pendek

Jangan dicelupkan dalam bufertapi biarkan bufer masuk daribagian dasar selulosa asetat

Faktor difusi masih besar


9/13

2014/4/16

9


Gel alami

Memperbaiki efek difusilebih kaku

Gel alami pati kentang polimer alami, ukuran pori sesuai

dengan sifat kimia bahan pati kentang/beragam

tidakdapat digunakan untuk penyaringan

Resolusi lebih baik dari kertas

Cara mempersiapkan

Pati kentang + bufer dipanaskan sekitar 90oC hingga larut.

Udara dalam campuran dikeluarkan dengan vakum

Letakkan pada cetakan, disiapkan tempat meletakkan contoh dengan

sisir dan didinginkan

Gel yang telah dirunningdapat dipotong dan diwarnai dengan

pewarna yang berbeda


Gel Buatan

Ukuran pori seragam bergantung konsentrasi

Konsentrasi kecil konsentrasi besar

Hati-hati memilih konsentrasi perhatikandata dari produsen bahan kimia

Contoh PAGE


PAGE

Lebih fleksibel, kuat, dan mudah ditanganidibandingkan dengan gel lain

Transparan thd radiasi UV dan Vis

Menghilangkan efek elektroosmosis dan difusi Pembuatan gel akrilamida memerlukan

Monomer akrilamida

N,N-metilena-bis-akrilamida sebagai cross linker

Ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator

Tetrametilenadiamina (TEMED) sebagai katalisator

Polimerisasi fotokimiawi diaktifkan oleh riboflavindengan adanya radikal UV


Reaksi pembentukan PAGE


10/13

2014/4/16

10


PAGE

Gel standar: 7.5% ukuran molekul 10.0001.000.000

3.5% ukuran molekul 1.000.0005.000.000 Ukuran >5.000.000 agarosa atau campuran gel

Elektroforesis Gel diskontinu 2 konsentrasi gel:

stacking gel /gel atas ukuran pori besar &

separation gel / gel bawah ukuran pori kecil

2 nilai bufer (biasanya berbeda 2 satuan pH) Bufer gel bawah pH sekitar 8.9

Bufer gel atas pH sekitar 6.7


SDS PAGE

Sodium dodesil sulfat (SDS): detergen

Bagian hidrofobik bereaksi dengan

protein dengan perbandingan teratur Protein membawa muatan SDS dg Mr

berbeda sampel memiliki muatansama tapi berbeda Mr-nya

U=

3.

;/3

=kzMr-1/3

persamaan logaritmik antara U danMr


SDS


Pemisahan protein terikat SDS


11/13

2014/4/16

11


PAGE & SDS PAGE


Aplikasi

Forensik

Membandingkan

DNA sampel daritersangka,

korban, dan data

di lapangan

+

T1

DNA

T2 T3 korban

Tersangka Sampeldilapangan


Aplikasi

Penentuan hubungan evolusi DNA organisme

+

DNA

1 32 4 5 1 2 3 4 5

Kura-kura ular tikus tupai lalat


Aplikasi

Menentukan bobot molekul protein dengan

SDS PAGE

Carilah literatur mengenai penggunaan

elektroforesis zona


12/13

2014/4/16

12


Aplikasi


Aplikasi


Aplikasi


Aplikasi

/ /


13/13

2014/4/16

13


LATIHAN

Apa yang dimaksud dengan elektroforesis

Jelaskan sejarah perkembangan elektroforesis

Jelaskan instrumentasi utama pada elektroforesis Jelaskan faktor-faktor yang memengaruhi pemisahan

pada elektroforesis

Apakah persamaan dan perbedaan antaraelektroforesis kertas, selulosa asetat, gel alami dan gelbuatan.

Apakah persamaan dan perbedaan native PAGE danSDS-PAGE

Sebutkan contoh penerapan pemisahan denganelektroforesis zona


PENUTUP

PELAJARI ELEKTROFORESIS KAPILER untuk

PERTEMUAN YANG AKAN DATANG

elektroforesis zona 2014

Documents

interaksi ionteknik

6r molekul bulat f

sejarah pemisahan ion

techniques and experiments

berdasarkan hk stoke

pipa u dipisahkan

jari partikel cm

mobilitas partikel cm2volt