Laboratorium Biokimia Laboratorium Biokimia

Fakultas Biologi UGMFakultas Biologi UGM

Pemisahan BiokimiawiPemisahan BiokimiawiProduk/Sumber alam

Ekstrak kasar/crude extract

Konsentrasi ekstrak kasar

Produk murni

Ekstraksi, dialisisFiltrasi/Sentrifugasi

Fraksinasi (garam, solvent, asam, pemanasan)Metode sentrifugasi

Teknik kromatografi

Metode elektroforasi

Desain untuk isalasi dan purifikasi produkyang diinginkan

Hasil (%)

Kemurnian

Aktivitas Biologi

ELEKTROFORESISELEKTROFORESIS

Teknik Elektroforesis adalah suatu Teknik Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan partikel metode pemisahan partikel (biomolekul) bermuatan di dalam media (biomolekul) bermuatan di dalam media yang diberi arus atau medan listrik.yang diberi arus atau medan listrik.

Dengan teknik ini partikel bermuatan akan Dengan teknik ini partikel bermuatan akan bergerak menuju elektroda yang memiliki muatan bergerak menuju elektroda yang memiliki muatan yang berlawananyang berlawanan

Anoda (elektroda ‘+’) menarik anion Anoda (elektroda ‘+’) menarik anion

Katoda (elektroda ‘-’) menarik kationKatoda (elektroda ‘-’) menarik kation

Pemisahan memerlukan fase gerak buffer.Buffer yang biasa digunakan adalah:

TBE = Tris borate EDTATAE = Tris acetate EDTA

Tidak hanya menyediakan kondisi pH yang sesuai tetapi juga menyediakan ion untuk membantu konduktivitas

Pada kondisi ini beberapa hal yang perlu menjadi perhatian :Suatu proses pemisahan molekul lebih baik dihentikan ketika proses tersebut belum mencapai titik kesetimbangannya.ketika medan listrik dimatikan (power supply mati) maka molekul yang telah terpisah akan menyebar lagi sehingga pemisahan tidak stabil. untuk itu pemisahan tidak dilakukan di dalam larutan akan tetapi menggunakan suatu matrix

matrix akan menahan sampel tidak menyebar lagi dan memberikan ‘frictional efect’ yang berpengaruh terhadap kecepatan migrasi sampel

fase diam / matrix yang biasa digunakan fase diam / matrix yang biasa digunakan adalah gel.adalah gel.

Macam gel yang biasa digunakan dalam Macam gel yang biasa digunakan dalam elektroforesiselektroforesis

poliakrilamidpoliakrilamid

agarosaagarosa

1 poliakrilamid1 poliakrilamid (Raymond and Weintraub, (Raymond and Weintraub,

1959)1959)

ukuran pori-pori dapat dibuat bervariasi untuk ukuran pori-pori dapat dibuat bervariasi untuk memberikan efek penyaringan memberikan efek penyaringan

biasa digunakan untuk memisahkan proteinbiasa digunakan untuk memisahkan protein

konsentrasi yang biasa digunakan : 3.5 -20% konsentrasi yang biasa digunakan : 3.5 -20% dapat memisahkan molekul sebesar 5 – 200 kddapat memisahkan molekul sebesar 5 – 200 kd

lebih fleksibel dan memberikan hasil pemisahan lebih fleksibel dan memberikan hasil pemisahan yang lebih tajamyang lebih tajam

lebih sulit disiapkan karena O2 menghambat lebih sulit disiapkan karena O2 menghambat polimerasinya.polimerasinya.

2. Agarosa2. Agarosa

diperoleh dari ekstraksi rumput lautdiperoleh dari ekstraksi rumput lautbersifat mudah patah dan mudah hancur bersifat mudah patah dan mudah hancur mempunyai pori yang besar (lbh besar dr mempunyai pori yang besar (lbh besar dr akriplamid)akriplamid)digunakan untuk memisahkan molekul yang digunakan untuk memisahkan molekul yang besar 200-50000 bpbesar 200-50000 bppenyiapan lebih mudah dibanding dgn penyiapan lebih mudah dibanding dgn polikrilamid, tetapi resolusinya lebih rendah polikrilamid, tetapi resolusinya lebih rendah hasil pemisahan kurang tajam hasil pemisahan kurang tajam konsentrasi yang digunakan berkisar 0.5 – 2%konsentrasi yang digunakan berkisar 0.5 – 2%

Faktor yg mempengaruhi kecepatan Faktor yg mempengaruhi kecepatan migrasi elektroforesis (Rf) :migrasi elektroforesis (Rf) :

Kekuatan medan listrik ( berbanding lurus Kekuatan medan listrik ( berbanding lurus dengan kecepatan migrasi)dengan kecepatan migrasi)

Muatan ionik dari molekul yang dipisahkan Muatan ionik dari molekul yang dipisahkan (berbanding lurus dengan kecepatan migrasi)(berbanding lurus dengan kecepatan migrasi)

koefisien gesekan/hambatan dari matrik koefisien gesekan/hambatan dari matrik penyangga (berbanding terbalik dengan penyangga (berbanding terbalik dengan kecepatan migrasi)kecepatan migrasi)

ukuran molekul yang dipisahkanukuran molekul yang dipisahkan

bentuk molekul yang dipisahkanbentuk molekul yang dipisahkan

PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) biasa digunakan untuk pemisahan protein biasa digunakan untuk pemisahan protein polimer yang terdiri dari 2 komponen polimer yang terdiri dari 2 komponen

acrylamide dan bis-acrylamideacrylamide dan bis-acrylamide konsentrasi polimer ini akan berpengaruh konsentrasi polimer ini akan berpengaruh thdp kecepatan migrasi proteinthdp kecepatan migrasi protein

Protein dgn BM tinggi Protein dgn BM tinggi gel konsentrasi rendah gel konsentrasi rendah

Protein dgn BM rendah Protein dgn BM rendah gel konsentrasi gel konsentrasi tinggitinggi dalam pemisahan protein dalam pemisahan protein kadang kadang mempunyai muatan positif kadang negative mempunyai muatan positif kadang negative tergantung pada buffer larutan.tergantung pada buffer larutan.

Pemisahan protein berdasarkan massa dan muatan keseluruhan protein tsbt

untuk penentuan BM protein untuk penentuan BM protein protein harus mempunyai protein harus mempunyai muatan yang samamuatan yang sama digunakan SDS = sodium dodecyl sulfate / laurel digunakan SDS = sodium dodecyl sulfate / laurel sulfatesulfate

SDS terikat pada protein dengan ikatan hidrofobik sesuai SDS terikat pada protein dengan ikatan hidrofobik sesuai dengan ukuran (besar kecilnya) molekul protein tersebutdengan ukuran (besar kecilnya) molekul protein tersebut

SDS akan memberi muatan negative pada semua SDS akan memberi muatan negative pada semua kondisi pH kecuali pada kondisi yang sangat asamkondisi pH kecuali pada kondisi yang sangat asam

karena itu rasio antara berat molekul dengan muatan karena itu rasio antara berat molekul dengan muatan menjadi konstan menjadi konstan protein migrasi sesuai dengan protein migrasi sesuai dengan massanya massanya menuju anoda menuju anoda

Dapat dibedakan massa dari protein tersebutDapat dibedakan massa dari protein tersebut

Pada prakteknya Pada prakteknya protein selalu protein selalu dipisahkan dlm kondisi terdenaturasi.dipisahkan dlm kondisi terdenaturasi.

preparasi sampel : protein dipanaskan preparasi sampel : protein dipanaskan sehingga struktur sekunder dan tersier sehingga struktur sekunder dan tersier telah hilang telah hilang SDS akan terikat SDS akan terikat sepanjang polipeptida yang adasepanjang polipeptida yang ada

Konsentrasi gel harus disesuaikan dengan ukuran sampel yang akan dipisahkan

Ketika kita memisahkan sampel dengan gel Ketika kita memisahkan sampel dengan gel elektroforesis elektroforesis tidak tahu kapan berhenti tidak tahu kapan berhenti perlu penanda untuk mengetahui kapan harus perlu penanda untuk mengetahui kapan harus menghentikan elektroforesisnya.menghentikan elektroforesisnya.Pewarna Pewarna molekul kecil, dapat menyerap sinar molekul kecil, dapat menyerap sinar tampak, mempunyai muatan yang sama dengan tampak, mempunyai muatan yang sama dengan sampel yang dipisahkan. sampel yang dipisahkan. migrasi lebih cepat migrasi lebih cepat dari sampel dari sampel bromphenol blue bromphenol blue

Visualisasi hasil pemisahan elektroforesisVisualisasi hasil pemisahan elektroforesisUntuk DNA dan RNA Untuk DNA dan RNA ethidium bromide ethidium bromide

silver stainingsilver stainingUntuk proteinUntuk protein Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue

1. GST2. GST-OsKAN3. MBP-Hd3a4. GST & MBP-Hd3a5. GST-OsKAN & MBP-

Hd3a

M

BeforeIPTG

AfterIPTG

Sup

pell

et

SDS-PAGE : CBB SDS-PAGE : Silver staining

Contoh hasil visualisasi elektroforesis

Gel agarosa : EtBr

Visualisasi di bawah sinar UV

2-D elektrophoresis2-D elektrophoresiselektroforesis yang dilakukan dalam 2 dimensi merupakan elektroforesis yang dilakukan dalam 2 dimensi merupakan kombinasi dari isoelectric focusing dengan SDS PAGEkombinasi dari isoelectric focusing dengan SDS PAGEmempunyai spesifisitas yang lebih tinggi mempunyai spesifisitas yang lebih tinggi horizontal = berdasarkan titik isoelektrik (pI) = horizontal = berdasarkan titik isoelektrik (pI) = isoelectric isoelectric focusingfocusingvertical = berdasarkan berat molekulvertical = berdasarkan berat molekul

Isoelectric focusingIsoelectric focusingsuatu prosedur yang digunakan untuk menentukan titik suatu prosedur yang digunakan untuk menentukan titik isoelektrik suatu proteinisoelektrik suatu proteingradient pH terbentuk dengan cara memberi campuran gradient pH terbentuk dengan cara memberi campuran asam dan basa organic dengan BM rendah pada medan asam dan basa organic dengan BM rendah pada medan listrik listrik terdistribusi dengan sendirinya sepanjang gel terdistribusi dengan sendirinya sepanjang gel tersebuttersebutprotein sampel akan merambat sampai mencapai pH protein sampel akan merambat sampai mencapai pH yang sesuai dengan titik isoelektriknya. Sehingga protein yang sesuai dengan titik isoelektriknya. Sehingga protein dengan pI berbeda akan terdistribusi dengan jarak yang dengan pI berbeda akan terdistribusi dengan jarak yang berbeda pulaberbeda pula

Alat yang digunakan dalam Alat yang digunakan dalam elektroforesiselektroforesis

power supplypower supplytangki elektroforesistangki elektroforesiscetakan gel dan sisircetakan gel dan sisirtransilluminator (uv lightbox)transilluminator (uv lightbox)kamerakamerabuffer (TBE/TAE)buffer (TBE/TAE)loading buffer (fungsi ?)loading buffer (fungsi ?)ethidium bromideethidium bromide

Kegunaan Gel elektroforesisKegunaan Gel elektroforesis

untuk melihat kemurnian suatu proteinuntuk melihat kemurnian suatu protein

menentukan berat molekul protein / asam menentukan berat molekul protein / asam nukleatnukleat

bidang kedokteran bidang kedokteran diagnosa penyakit diagnosa penyakit genetis, paternity, DNA fingerprintinggenetis, paternity, DNA fingerprinting

Molecular systematic Molecular systematic RPAD / RFLP RPAD / RFLP

Pemisahan potongan DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis gel agarosa. Dasar dari teknik ini adalah dalam medan listrik DNA yang bermuatan negatif (karena adanya gugus fosfat) akan bergerak menuju elektroda positif dan kecepatannya sesuai dengan panjang pendeknya potongan DNA

Penggunaan sidik jari DNA untukmenggantikan peran sidik jari daritangan atau kaki

Pola pita DNA kromosom yangdipotong dengan enzim endonukleaserestriksi yang sama untuk bagian fragmen DNA yang sama tetapimilik dari dua individu yang berbeda, akan menunjukkan pola pita DNA yang berbeda. Hal ini seperti perbedaan pola yang ditunjukkan oleh sidik jari tangan atau kaki dari kedua individu tersebut.

Hasil potongan DNA dengan enzin endonuklease restriksi tertentu pada suatu gen marker dapat digunakan sebagai sidik jari DNA untuk menunjukkan hubungan kekerabatan

Sebagian pita dari profil sidik jari DNA pihak ibu (warna ungu, lajur kiri) dimiliki si anak, sedanguntuk pihak pria yang memilikikesamaan profil sidik jari DNA (warna merah muda, lajur ketiga)dengan si anak adalah pria no 1

Identifikasi ayah biologis melaluiSidik jari DNA

Analisis profil DNA kromosom dari individu yang berbeda

RFLP untuk karakterisasi mikrobiaRFLP untuk karakterisasi mikrobia

 

1500

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

1 2 3 4 5 6 7 8 M bp

Fig 5. ARDRA Patterns of 16S rDNA sequence after digestion with endonuclease restriction enzyme RsaI

Lanes : (M) Marker 100 bp ladder ; (1) NB 111 ; (2) NB 112 ; (3) 5 LGI; (4) 10.3.1 ; (5) 10.3.3 ; (6) Azorhizophilus paspali DSM 2283T; (7) Azotobacter chroococcum DSM 2286T ;(8) sekuen 16S rDNA yang tidak dipotong (uncut)

 

1500

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M bp

FIG 6. ARDRA Patterns of 16S rDNA sequence after digestion with endonuclease restriction enzymeAluI Lanes : (M) Marker 100 bp ladder ; (1) NB 111 ; (2) NB 112 ; (3) 5 LGI; (4) 10.3.1 ; (5) 10.3.3 ; (6) Azorhizophilus paspali DSM 2283T ; (7) Azotobacter chroococcum DSM 2286T ;(8) sekuen 16S rDNA yang tidak dipotong (uncut)

FIG 7. FIG 7. ARDRA Patterns of 16S rDNA sequence after digestion with endonuclease restriction ARDRA Patterns of 16S rDNA sequence after digestion with endonuclease restriction enzyme enzyme HinfHinfII

 Lanes :(M) Marker 100 bp ladder ; (1) NB 111 ; (2) NB 112 ; (3) 5 LGI; (4) 10.3.1 ; (5) 10.3.3 ;  Lanes :(M) Marker 100 bp ladder ; (1) NB 111 ; (2) NB 112 ; (3) 5 LGI; (4) 10.3.1 ; (5) 10.3.3 ; (6) (6) AzorhizophilusAzorhizophilus paspali paspali DSM 2283DSM 2283T T ; (7) ; (7) AzotobacterAzotobacter chroococcumchroococcum DSM 2286 DSM 2286TT ; ;(8) sekuen 16S rDNA yang tidak dipotong ((8) sekuen 16S rDNA yang tidak dipotong (uncuuncut)t)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M