ElektroforesisDari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum DiperiksaLangsung ke: navigasi, cari

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .[1] Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. [2] Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. [2] Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.[2] Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. [3]

[sunting] Jenis elektroforesis

Perangkat elektroforesis gel

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. [4] Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. [4] Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. [5]

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. [6] Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. [6] Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. [6]

[sunting] Lihat pula

Elektroforesis gel

[sunting] Referensi

1. ̂ (en) Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. New Jersey: John Wiley & Sons inc.

2. ^ a b c d Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.3. ̂ Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press4. ^ a b Sulaiman, Hardi A & Kundari NA. 2007. Pemisahan dan karakterisasi spesi senyawa

kompleks ytrium-90 dan sstronsium-90 dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1 No.25. ̂ Khopkar SM. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.6. ^ a b c Yepyhardi. 2009. Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular.

Sciencebiotech.net[web]. http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular

7. Elektroforesis gel8. Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas9. Belum Diperiksa10. Langsung ke: navigasi, cari 11. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai

dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis.

12. [sunting] Cara kerja

13.14.15. Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR menggunakan primer mikrosatelit. Berkas

(band) mendatar merupakan sekumpulan DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan kecepatan berbeda. Semakin pendek DNA semakin cepat bergerak.

16. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.

17. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.

 Artikel bertopik biokimia ini adalah sebuah rintisan. Anda dapat membantu Wikipedia dengan mengembangkannya.

Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju elektrode positifElektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:Fe = qEF= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

Jenis Elektroforesis1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

Medium PendukungElektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa. 1. Cellulose asetat

2. Larutan BufferLarutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :- KomposisiBuffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.- KonsentrasiDengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M. - pHTingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa3. Medan elektrikApabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.- VoltaseApabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya

adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.- Aliran listrikArus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.- Tahanan Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

Lebih lanjut tentang: Pengertian Elektroforesis

Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular

May 19, 2009 Biotechnology , Elektroforesis 37 comments

Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg

Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu

gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.

Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.

Elektroforesis dengan Kertas Saring

Smithies menerima hadiah Nobel

Smithies menerima hadiah Nobel

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?

Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com

Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com

Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Elektroforesis Gel Kanji

Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp

Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.

Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.  Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.

Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.

Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.

Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.

Sumber:

Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group. http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kcepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.dengan demikian elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencega terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrikElektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu elektroda.Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif.Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell

1. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Prinsip:

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu medan elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah elektroforesis zonan (zonal electrophoresis) di mana protein dipisahkan dari satu campuran yang kompleks kepada jalur (band) melalui migrasi didalam larutan penimbal berair melalui satu matrik polimer dipanggil gel. Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim didalam elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan. Matrik gel boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca atau keping (slab) diantara dua kepingan kaca.

Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI nya. Suatu protein bercas negatif sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala suatu protein itu bercas positif sekiranya pH larutan dibawah pI nya. Banyaknya cas dan voltan yang diberikan akan menentukan berapa jauhnya suatu protein itu akan bergerak didalam suatu medan elektrik. Semakin tinggi voltan dan semakin besar cas yang terdapat pada protein, maka semakin besarlah pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan bentuk molekul yang menentukan jejari Stokes suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan didalam matrik gel tersebut. Pergerakan protein perlahan apabila pergeseran molekul meningkat akibat dari mertambahnya jejari Stokes; dengan demikian, protein yang lebig kecil bergerak lebih pantas didalam matrik gel. Bagitu juga, pengurangan dalam saiz liang (pore) matrik gel akan memperlahankan pergerakan.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun, merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein

dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian (resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya, digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang diskrit.

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000. Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain). Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.

Kegunaan:

Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.

Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.

Kegunaan:

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi

dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

3. Elektroforesis Gel   Agarosa

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

TUJUAN

Melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII2. Sampel DNA, misalnya :3. DNA kromosom bakteri,4. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)5. DNA plasmid hasil restriksi (cut)6. Agarosa7. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M

pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)8. Akuades9. Gelas Ukur 1000 ml10. Labu Erlenmeyer 50 ml

11. Tabung mikrosentrifuga12. Sarung tangan13. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)14. Kertas parafilm15. seperangkat alat elektroforesis16. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;

EDTA 120 mM)17. larutan Etidium Bromid (EtBr)18. UV transluminator19. Kaca mata UV20. kamera digital

CARA KERJA

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah

diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa

dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang

tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).

13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.

15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.

16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).

17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL

Gambarlah pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.

Elektroforesis 

Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Untuk lebih jelas, mari kita lihat tabung berikut di samping.

Pada gambar, terlihat bahwa partikel-partikel koloid bermuatan positif tersebut bergerak menuju elektrode dengan muatan berlawanan, yaitu elektrode negatif. Jika sistem koloid bermuatan negatif, maka partikel itu akan menuju elektrode positif

 

Sifat-sifat Koloid Efek TyndallGerak Brown Adsorpsi Koloid ElektroforesisKoagulasi KoloidEmulsiLiofil dan Liofob

 

Animasi

Koloid

  Terjadinya Elektroforesis Peristiwa Elektroforesis

ElektroforesisPosted by admin on Friday, June 19, 2009 · 2 Comments 

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa

merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul  biologi  tersebut  terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul  biologi  yang  bermuatan  positif  akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran.

Elektroforesis Protein

Seperti halnya dengan elektroforesis DNA, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit.

Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu bagian electric transformer yang mengubah arus AC ke DC dan bagian tanki elektroforesis yang berisi flat bed, slab, column, dan selang.

Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein :

1. Densitas muatan molekul - berbeda diantara pH media dan pl molekul.

2. Pengaruh buffer

-          pH - akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi tingkat dan arah pergerakannya

-          Kekuatan ionik - mempengaruhi tingkat pemisahan

-          Komposisi - bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein.

3. Bentuk dan ukuran molekul

4. media pendukung

-          Restriksi pada mobilitas

-          Pengaruh difusi

-          Elektroendosmosis

-          Mikro-heterogenitas molekuler spesies

Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE)

Sistem yang digunakan dalam PAGE

-          Flat Bed

-          Rod atau Column

-          Vertical Slab

-          Capillary

Faktor yang mempengaruhi resolusi

1. Konsentrasi Gel Poliakrilamid

-          Konsentrasi monomer - proporsional terhadap porositas gel akhir

-          Persentase Cross-linker pada Monomer - mempunyai pengaruh pada porositas gel akhir

-          kimia alam untuk Cross-linker - dapat mempengaruhi porositas dan penangan selanjutnya pada gel akhir

-          Kemurnian monomer - sering terkontaminasi dengan asam akrilat yang menyebakan efek elektroendosmosis pada gel final.

2. Buffer

-          pH

-          Penggunaan sistem buffer kontnyu atau diskontinyu

-          Komposisi buffer

-          Inklusi agen disosiasi : Urea, detergen non ionic, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)

Buffer sistem

Buffer ini dapat digunakan dengan atau tanpa SDS meskipun inklusi SDS sering umum digunakan belakangan ini. Laemmli Buffer - Tris, Glycine HCl buffer - adalah buffer yang banyak digunakan secara luas terutama dengan SDS. Resolusinya sangat jelek dengan ukuran MW dibawah 10KDa.

Schaegger & Von Jagow Buffer system - Tricine, Tris , HCl buffer - dengan komposisi gel yang benar sistem buffer ini dapat menguraikan peptida hingga 1 KDa dan umumnya memberikan memberikan reolusi yang lebih baik hingga 100 KDa.

Penggunaan agen disosiasi

1.    Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)

-          Resolusi pemisahan tinggi

-          Estimasi berat molekuler

2.    Urea atau Detergen Non Ionik (Tween 20)

Membantu melarutkan material yang tidak larut dalam media cair seperti protein membran sel

Struktur Protein

Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh interaksi elektrostatik dan hidrofobik,  sekaligus juga gaya yang lebih kuat seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier protein.

Teknik elektroforesis

Untuk mempelajari protein, kita perlu mengurutkan dan memvisualisasikannya. Salah satu cara paling umum untuk melakukannya dikenal dengan SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis). 

Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul bermuatan melalui matriks atau gel. Pada laboratorium sederhana kita bisa menggunakan gel agarose utnuk memisahkan fragmen DNA. Dalam kasus ini, kita memerlukan matriks yang terang/bening untuk memisahkan molekul. Matriks yang bening ini terbuat dari polimer akrilamid.  Sehingga PAGE diartikan sebagai proses pemisahan protein dalam sebuah gel akrilamid melalui aplikasi arus listrik. Seperti halnya pada elektroforesis DNA, molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel.

Tidak seperti DNA, protein yang diisolasi ini tidak akan memiliki muatan negatif yang sama. Karena itu perlu untuk melindungi semua protein dengan sesuatu untuk memberikan muatan negatif, yang memungkinkan mereka bergerak menuju ujung positif arus listrik.

Untuk memisahkan protein secara akurat berdasarkan ukurannya, akan sangat penting jika kita mendenaturasi protein sebelum mengisikannya dalam gel. Untuk melakukan hal ini, kita akan menggunakan loading buffer dengan 2 bahan penting, SDS dan DTT (ditiotreitol). DTT adalah agen pereduksi yang kuat yang memutus ikatan disulfida. Selain itu untuk mempergunakan 2 agen kimia untuk mendenaturasi protein, kita juga harus memanaskan beberapa sampel hingga 95oC untuk membantu mendenaturasi protein secara sempurna, menghasilkan molekul linier yang akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya.

Jenis elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

ELEKTROFORESIS

RINGKASAN ELEKTROFORESIS

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat

terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur,

viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah

pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan

Ada beberapa jenis Elekroforesis, diantaranya:

1. Elektroforesis dengan Kertas Saring

Pada akhir proses elektroforesis komponen dengan elektroforesis kertas saring tersebut

terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

2. Elektroforesis Gel Kanji

Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk

menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti

agarosa dan polimer akrilamida.

3. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk

menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas

tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan

dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat

molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam

beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat

molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak

diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

4. Elekroforesis Wilayah

Ada berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factor-

faktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam

larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau

tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan

adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel.

5. Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu)

Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu

tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu

aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu

reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang

elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan

komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan

Prinsip Elektroforesis

Jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda

potensial, fase tersebut akan berpindah

sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda

atau anoda sesuai dengan muatan partikel.

Fenomena ini adalah elektroforesis

Peralatan Dan Metodologi

Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu

elektrolit dan direntangkan secara horizontal

diantara dua ruang elektroda yang berbeda

potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah

lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan

diantara dua lempeng kaca untuk mencegah

penguapan elektrolit.

Arus searah digunakan pada beda teganan

sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan

karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi

dengan aliran pelarut yang simultan untuk

memisahkan zat-zat inik juga telah

dikembangkan.

Aplikasi

Aplikasi analisis dengan Elektroforesis ini adalah seperti dalam “EKSPRESI PROTEIN PADA

MIKROORGANISME RESISTEN LOGAM BERAT Cr DENGAN METODE ELEKTROFORESIS”

Elektroforesis SDS-PAGE untuk mengetahui ekspresi protein mikroorganisme.

Sebanyak 5 mL kultur bakteri dituangkan kedalam tabung ependorf 1,5 mL dan sel-selnya

diendapakan dengan disentrifugasi selama 5 menit 13.000 rpm. Endapan sel dibersihkan dari media LB

cair dengan membuang supernatannya, pelet sel yang mengendap disuspensi dengan Phospat Buffered

Saline Solution (PBS) sebanyak dua kali, kemudian disentrifuse kembali, dan supernatant PBS dibuang.

Pelet kemudian ditambahkan 1 mL PBS. Untuk memecah sel digunakan sonikasi selama 30 detik

sebanyak 4 kali, disentrifuse ulang dan diambil supernatannya untuk dirunning dengan menambahkan

buffer sampel (4:1/v:v).

Sebelum diloading ke dalam sumuran, campuran sampel dan buffer sampel direbus dalam air

mendidih selama 2 menit, kemudian dimasukkan ke dalam es selama + 5 menit, setelah itu sampel siap

dirunning. Gel yang sudah terbentuk (discontinous ge 10 % dan stacking gel 3%), dipindahkan ke dalam

tangki elektroforesis (Hames & Rickwood, 1990).

Selanjutnya tangki elektroforesis diisi dengan running buffer (0,19 M Glycine, 10 ml SDS 10 %, dan

0,0248 M Tris dalam 1 Liter) hingga penuh. Letakkan 10 μL mikropipet campuran sampel dan buffer

sampel dan masukkan dalam sumuran elektroforesis secara hati-hati. Setelah semua sampel masuk

dalam sumuran pasang tutup tanki dan atur voltase (100V, 90 menit).

Pewarnaan dengan menggunakan metode Comassie Blue untuk pewarnaan protein. Larutan

dibuat dengan komposisi 1 g zat warna Comassie. Blue dilarutkan dalam 1 L larutan destaining (100 ml

asam asetat, 400 mL metanol, kemudian diencerkan dengan penambahan akuades hingga mencapai

volume 1 L). (Hames & Rickwood,1990). Setelah dirunning, gel direndam dalamlarutan pewarna

Comassie Blue selama 12 jam, kemudian dicuci dengan destainig sebanyak 3-4

kali selama 2 jam hingga didapatkan pola pita protein yang terbentuk.

Ekpresi Protein pada Mikroorganisme Resisten Logam Berat Cr dengan Metode SDS-PAGE

Hasil running dari lima macam mikroorganisme diantaranya K. pneumonia, Pantoea sp, P.

aeruginosa, P. putida, dan S. Cerevisieae yang masing-masing sampelnya diekstrak dari sel-sel

mikroorganisme yang ditumbuhkan dalam kultur LB cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm.

Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk membedakan antara populasi mikroorganisme yang resisten

dengan yang tidak resisten. Pola Pita protein hasil running dengan menggunakan gel polyakrilamid

seperti terlihat pada Gambar 3.

Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari

campuran polypeptida (Hames & Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan

memiliki rentang beratmolekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat

sejumlah pita protein yangmemiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki

ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan

selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor (Wijaya & Rahman: 2005). Pada

hasil elektroforesis di atas terdapat beberapa buah protein mayor pada spesies P.

aeruginosa (M3) dan P. putida (M4). Berat molekul dari protein mayor ini berkisar

148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105 kDa. Kedua species ini memiliki protein mayor yang

intensitas warna dan ketebalan yang hampir sama karena kedua mikroorganisme

ini masih termasuk dalam genus yang sama yaitu Pseudomonas.

Diposkan oleh Jamson, H.P.P. Tp. Bolon di 21:49

0 komentar:

Poskan KomentarPosting Lebih Baru Beranda

Langgan: Poskan Komentar (Atom)

Gel elektroforesis

From Wikipedia, the free encyclopedia Dari Wikipedia, ensiklopedia bebas

Jump to: navigation , search Langsung ke: navigasi , cari

Gel electrophoresis Gel elektroforesis

Gel electrophoresis apparatus – An agarose gel is placed in

this buffer-filled box and electrical field is applied via the

power supply to the rear. Gel elektroforesis aparatus -

Sebuah gel agarosa ditempatkan dalam kotak penuh buffer

dan medan listrik diterapkan melalui catu daya ke belakang.

The negative terminal is at the far end (black wire), so DNA

migrates toward the camera. Terminal negatif adalah di

ujung (kabel hitam), sehingga DNA bermigrasi ke arah

kamera.

Classification

Klasifikasi Electrophoresis Elektroforesis

Other techniques Lain teknik

Related Terkait Capillary electrophoresis

Elektroforesis kapiler

SDS-PAGE SDS-PAGE

Two-dimensional gel electrophoresis

Dua dimensi elektroforesis gel

Temperature gradient gel

electrophoresis Temperatur gradien

elektroforesis gel

Gel electrophoresis is a technique used for the separation of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), or protein molecules using an electric field applied to a gel matrix. [ a ] DNA Gel electrophoresis is usually performed for analytical purposes, often after amplification of DNA via PCR , but may be used as a preparative technique prior to use of other methods such as mass spectrometry , RFLP , PCR , cloning , DNA sequencing , or Southern blotting for further characterization. Gel elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk pemisahan asam deoksiribonukleat (DNA), asam ribonukleat (RNA), atau protein molekul menggunakan medan listrik diterapkan pada gel matriks. [a] Gel elektroforesis DNA biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, seringkali setelah amplifikasi DNA melalui PCR , tetapi dapat digunakan sebagai teknik preparatif sebelum penggunaan metode lain seperti spektrometri massa , RFLP , PCR , kloning , sekuensing DNA , atau Southern blotting untuk karakterisasi lebih lanjut.

Contents Isi

[hide]

1 Separation 1 Pemisahan 2 Visualization 2 Visualisasi 3 Applications 3 Aplikasi

o 3.1 Nucleic acids 3.1 Asam Nukleat o 3.2 Proteins 3.2 Protein

4 History 4 Sejarah 5 See also 5 Lihat juga 6 References 6 Referensi 7 External links 7 Pranala luar

Separation Pemisahan

The term " gel " in this instance refers to the matrix used to contain, then separate the target molecules. Istilah " gel "dalam hal ini mengacu pada matriks yang digunakan untuk mengandung, kemudian memisahkan molekul target. In most cases, the gel is a crosslinked polymer whose composition and porosity is chosen based on the specific weight and composition of the target to be analyzed. Dalam kebanyakan kasus, gel adalah polimer crosslinked dengan komposisi dan porositas dipilih berdasarkan berat jenis dan komposisi dari target akan dianalisis. When separating proteins or small nucleic acids ( DNA , RNA , or oligonucleotides ) the gel is usually composed of different concentrations of acrylamide and a cross-linker , producing different sized mesh networks of polyacrylamide . Ketika memisahkan protein atau kecil asam nukleat ( DNA , RNA , atau oligonukleotida ) gel biasanya terdiri dari konsentrasi yang berbeda akrilamida dan linker-lintas , menghasilkan jaringan mesh ukuran berbeda poliakrilamida . When

separating larger nucleic acids (greater than a few hundred bases ), the preferred matrix is purified agarose . Ketika memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa ), matriks disukai adalah dimurnikan agarosa . In both cases, the gel forms a solid, yet porous matrix. Acrylamide , in contrast to polyacrylamide , is a neurotoxin and must be handled using appropriate safety precautions to avoid poisoning. Agarose is composed of long unbranched chains of uncharged carbohydrate without cross links resulting in a gel with large pores allowing for the separation of macromolecules and macromolecular complexes . [ citation needed ]

Dalam kedua kasus, gel bentuk solid, namun keropos matriks. Akrilamida , berbeda dengan poliakrilamida , adalah neurotoxin dan harus ditangani dengan menggunakan tindakan pencegahan keselamatan yang tepat untuk menghindari keracunan. Agarose terdiri dari rantai bercabang panjang bermuatan karbohidrat tanpa hubungan silang yang dihasilkan dalam gel dengan pori-pori besar memungkinkan untuk pemisahan makromolekul dan kompleks makromolekul . [ rujukan? ]

" Electrophoresis " refers to the electromotive force (EMF) that is used to move the molecules through the gel matrix. " Elektroforesis "mengacu pada gaya gerak listrik (EMF) yang digunakan untuk memindahkan molekul melalui matriks gel. By placing the molecules in wells in the gel and applying an electric field, the molecules will move through the matrix at different rates, determined largely by their mass when the charge to mass ratio (Z) of all species is uniform, toward the anode if negatively charged or toward the cathode if positively charged. [ b ] Dengan menempatkan molekul dalam sumur pada gel dan menerapkan medan listrik, molekul akan bergerak melalui matriks pada tingkat yang berbeda, ditentukan terutama oleh massa mereka ketika muatan terhadap massa (Z) dari semua spesies yang seragam, menuju anoda jika dibebankan atau negatif terhadap katoda jika bermuatan positif. [b]

In simple terms: Electrophoresis is a procedure which enables the sorting of molecules based on size and charge. Secara sederhana: Elektroforesis adalah prosedur yang memungkinkan pemilahan molekul berdasarkan ukuran dan biaya. Using an electric field, molecules (such as DNA) can be made to move through a gel made of agar. Menggunakan medan listrik, molekul (seperti DNA) dapat dibuat untuk bergerak melalui gel yang terbuat dari agar. The molecules being sorted move through the space in gel material. Molekul-molekul yang disortir bergerak melalui ruang dalam bahan gel. The gel is placed in an electrophoresis chamber, which is then connected to a power source. Gel ditempatkan dalam ruang elektroforesis, yang kemudian dihubungkan ke sumber listrik. When the electric current is applied, the larger molecules move more slowly through the gel while the smaller molecules move faster. Ketika arus listrik diterapkan, molekul besar bergerak lebih lambat melalui gel sedangkan molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat. The different sized molecules form distinct bands on the gel. [ citation needed ] Molekul-molekul yang berbeda ukuran bentuk band yang berbeda pada gel. [ rujukan? ]

Visualization Visualisasi

Gel electrophoresis Gel elektroforesis

After the electrophoresis is complete, the molecules in the gel can be stained to make them visible. Ethidium bromide , silver, or Coomassie Brilliant Blue dye may be used for this process. Setelah elektroforesis selesai, molekul pada gel dapat diwarnai untuk membuat mereka terlihat. etidium bromida , perak, atau Coomassie Brilliant Blue pewarna dapat digunakan untuk proses ini. Other methods may also be used to visualize the separation of the mixture's components on the gel. Metode lain juga dapat digunakan untuk memvisualisasikan pemisahan komponen campuran di gel. If the analyte molecules fluoresce under ultraviolet light, a photograph can be taken of the gel under ultraviolet lighting conditions, often using a Gel Doc . Jika molekul analit fluoresce bawah ultraviolet cahaya, sebuah foto dapat diambil dari gel di bawah kondisi pencahayaan ultraviolet, yang sering menggunakan Doc Gel . If the molecules to be separated contain radioactivity added for visibility, an autoradiogram can be recorded of the gel. [ citation needed ]

Jika molekul untuk dipisahkan mengandung radioaktivitas tambah bagi visibilitas, sebuah autoradiogram dapat direkam dari gel. [ rujukan? ]

If several samples have been loaded into adjacent wells in the gel, they will run parallel in individual lanes. Jika beberapa contoh telah dimuat ke dalam sumur yang berdekatan di gel, mereka akan berjalan paralel di jalur masing-masing. Depending on the number of different molecules, each lane shows separation of the components from the original mixture as one or more distinct bands, one band per component. Tergantung pada jumlah molekul yang berbeda, masing-masing jalur menunjukkan pemisahan komponen dari campuran asli sebagai satu atau lebih band yang berbeda, satu band per komponen. Incomplete separation of the components can lead to overlapping bands, or to indistinguishable smears representing multiple unresolved components. [ citation needed ] pemisahan lengkap komponen dapat menyebabkan band tumpang tindih, atau noda bisa dibedakan mewakili beberapa komponen yang belum terselesaikan. [ rujukan? ]

Bands in different lanes that end up at the same distance from the top contain molecules that passed through the gel with the same speed, which usually means they are approximately the same size. Band di jalur berbeda yang berakhir pada jarak yang sama dari atas mengandung molekul yang melewati gel dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti mereka adalah kira-kira ukuran yang sama. There are molecular weight size markers available that contain a mixture of molecules of known sizes. Ada penanda ukuran berat molekul yang tersedia yang

mengandung campuran molekul ukuran diketahui. If such a marker was run on one lane in the gel parallel to the unknown samples, the bands observed can be compared to those of the unknown in order to determine their size. Apabila penanda dijalankan pada satu jalur dalam gel paralel dengan sampel yang tidak diketahui, band-band yang diamati dapat dibandingkan dengan mereka yang tidak diketahui untuk menentukan ukurannya. The distance a band travels is approximately inversely proportional to the logarithm of the size of the molecule. [ citation needed ] Jarak perjalanan band adalah sekitar berbanding terbalik dengan logaritma ukuran molekul. [

rujukan? ]

Applications Aplikasi

Gel electrophoresis is used in forensics , molecular biology , genetics , microbiology and biochemistry . Gel elektroforesis digunakan dalam forensik , biologi molekuler , genetika , mikrobiologi dan biokimia . The results can be analyzed quantitatively by visualizing the gel with UV light and a gel imaging device. Hasil dapat dianalisis secara kuantitatif dengan memvisualisasikan gel dengan sinar UV dan perangkat pencitraan gel. The image is recorded with a computer operated camera, and the intensity of the band or spot of interest is measured and compared against standard or markers loaded on the same gel. Gambar akan direkam dengan kamera komputer dioperasikan, dan intensitas dari band atau spot kepentingan diukur dan dibandingkan dengan standar atau spidol dimuat pada gel yang sama. The measurement and analysis are mostly done with specialized software. Pengukuran dan analisa sebagian besar dilakukan dengan perangkat lunak khusus.

Depending on the type of analysis being performed, other techniques are often implemented in conjunction with the results of gel electrophoresis, providing a wide range of field-specific applications. Tergantung pada jenis analisis yang dilakukan, teknik lain yang sering diimplementasikan dalam hubungannya dengan hasil elektroforesis gel, menyediakan berbagai macam aplikasi lapangan khusus.

Nucleic acids Asam nukleat

An agarose gel of a PCR product compared to a DNA ladder. Sebuah gel agarosa dari PCR produk dibandingkan dengan tangga DNA.

In the case of nucleic acids, the direction of migration, from negative to positive electrodes, is due to the naturally-occurring negative charge carried by their sugar - phosphate backbone. [ c ] Dalam hal asam nukleat, arah migrasi, dari negatif ke elektroda positif, adalah karena terjadi negatif biaya-alami yang dibawa oleh mereka gula - fosfat . backbone [c]

Double-stranded DNA fragments naturally behave as long rods, so their migration through the gel is relative to their size or, for cyclic fragments, their radius of gyration . Double-stranded DNA fragmen alami berperilaku seperti batang panjang, sehingga migrasi mereka melalui gel relatif terhadap ukuran mereka atau, untuk fragmen siklik, mereka radius rotasi . Single-stranded DNA or RNA tend to fold up into molecules with complex shapes and migrate through the gel in a complicated manner based on their tertiary structure. Single-stranded DNA atau RNA cenderung melipat menjadi molekul dengan bentuk yang kompleks dan bermigrasi melalui gel dengan cara yang rumit berdasarkan struktur tersier mereka. Therefore, agents that disrupt the hydrogen bonds , such as sodium hydroxide or formamide , are used to denature the nucleic acids and cause them to behave as long rods again. [ d ] Oleh karena itu, agen yang mengganggu ikatan hidrogen , seperti natrium hidroksida atau formamida , digunakan untuk mengubah sifat sesuatu benda asam nukleat dan menyebabkan mereka untuk berperilaku sebagai batang panjang lagi. [d]

Gel electrophoresis of large DNA or RNA is usually done by agarose gel electrophoresis . Gel elektroforesis besar DNA atau RNA biasanya dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa . See the " Chain termination method " page for an example of a polyacrylamide DNA sequencing gel. Lihat " Rantai metode penghentian "halaman untuk contoh poliakrilamida gel sekuensing DNA. Characterization through ligand interaction of nucleic acids or fragments may be performed by mobility shift affinity electrophoresis . Karakterisasi melalui interaksi ligan asam nukleat atau fragmen dapat dilakukan oleh pergeseran mobilitas elektroforesis afinitas .

Electrophoresis of RNA samples can be used to check for genomic DNA contamination and also for RNA degradation. Elektroforesis RNA sampel dapat digunakan untuk memeriksa kontaminasi DNA genomik dan juga untuk degradasi RNA. RNA from eukaryotic organisms shows distinct bands of 28s and 18s rRNA, the 28s band being approximately twice as intense as the 18s band. RNA dari organisme eukariotik menunjukkan pita berbeda 28S dan 18 rRNA, 28S band yang kira-kira dua kali lebih intens sebagai band 18. Degraded RNA has less sharpely defined bands, has a smeared appearance, and intensity ratio is less than 2:1. RNA terdegradasi memiliki kurang band sharpely didefinisikan, memiliki penampilan yang diolesi, dan rasio intensitas kurang dari 2:1.

Proteins Protein

SDS-PAGE autoradiography – The indicated proteins are present in different concentrations in the two samples. SDS-PAGE autoradiografi - Protein ditunjukkan yang hadir dalam konsentrasi yang berbeda dalam dua sampel.

Proteins , unlike nucleic acids, can have varying charges and complex shapes, therefore they may not migrate into the polyacrylamide gel at similar rates, or at all, when placing a negative to positive EMF on the sample. Protein , seperti asam nukleat, dapat memiliki berbagai biaya dan bentuk kompleks, karena itu mereka tidak dapat bermigrasi ke dalam gel poliakrilamid dengan tingkat yang sama, atau sama sekali, ketika menempatkan negatif untuk EMF positif pada sampel. Proteins therefore, are usually denatured in the presence of a detergent such as sodium dodecyl sulfate / sodium dodecyl phosphate (SDS/SDP) that coats the proteins with a negative charge. [ a ] Generally, the amount of SDS bound is relative to the size of the protein (usually 1.4g SDS per gram of protein), so that the resulting denatured proteins have an overall negative charge, and all the proteins have a similar charge to mass ratio. Protein Oleh karena itu, biasanya terdenaturasi di hadapan sebuah deterjen seperti dodecyl sulfat natrium / sodium fosfat dodesil (SDS / SDP) yang melapisi protein dengan muatan negatif. [a] Secara umum, jumlah SDS terikat relatif ke ukuran protein (biasanya 1.4g SDS per gram protein), sehingga protein didenaturasi yang dihasilkan memiliki muatan negatif secara keseluruhan, dan semua protein memiliki muatan yang mirip dengan rasio massa. Since denatured proteins act like long rods instead of having a complex tertiary shape, the rate at which the resulting SDS coated proteins migrate in the gel is relative only to its size and not its charge or shape. [ a ] Karena protein didenaturasi bertindak seperti batang panjang daripada memiliki bentuk tersier yang kompleks, tingkat di mana SDS dilapisi protein yang dihasilkan bermigrasi dalam gel relatif hanya untuk ukuran dan tidak dikenakan biaya atau bentuk. [a]

Proteins are usually analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE ), by native gel electrophoresis , by quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis ( QPNC-PAGE ), or by 2-D electrophoresis . Protein biasanya dianalisis dengan sulfat gel dodesil poliakrilamid elektroforesis natrium ( SDS-PAGE ), dengan elektroforesis gel asli , dengan kuantitatif preparatif gel elektroforesis kontinyu poliakrilamid asli ( QPNC-PAGE ), atau oleh -D elektroforesis 2 .

Characterization through ligand interaction may be performed by electroblotting or by affinity electrophoresis in agarose or by capillary electrophoresis as for estimation of binding constants and determination of structural features like glycan content through lectin binding. Karakterisasi melalui interaksi ligan dapat dilakukan oleh electroblotting atau elektroforesis afinitas di agarosa atau dengan elektroforesis kapiler sebagai untuk estimasi konstanta mengikat dan penentuan fitur struktural seperti glycan konten melalui lektin mengikat.

ELEKTROFORESIS

DefinisiTehnik pemisahan komponen-komponen dengan pengaruh arus listrik sehingga terjadi laju perpindahan disebut sebagai suatu elektroforesis atau elektrokromatografi. Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yaitu elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinyu.

Prinsip ElektroforesisJika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena ini adalah elektroforesis.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.

Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakuka kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi.

Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang palng sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun erikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary.Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarka perbedaan transport fisik zatterlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat

terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur, viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan.

Peralatan dan MetodologiSecarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit.

Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat inik juga telah dikembangkan.

Elekroforesis WilayahAda berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis.

Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel.

Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu)Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan.

Pemakaian Analitik ElektrokromatografiHomogenitas wilayah elektrokromatografi adalah suatu criteria penting untuk memperoleh kemurnian. Teknik elektrokromatografi pada kertas telah digunakan untuk pemisahan komponen-komponen yang sulit dipisahkan. Pemisahan anorganik segera dapat dil;akukan melalui agen pengompleks. Agen ini mempengaruhi laju kromatografi sedangkan kompleks elektromigrasi mempunyai afinitas adsorbsi yang berbeda terhadap medium migrasi serta berbagai bentukion sederhana misalkan Ag, Ni berpindah kearah katoda, tetapi dengan penambahan EDTA, Ni saja yang pindah ke anoda. Logam-logam alkali dan magnesium juga dipisahkan. Pemisahan Pb, Pt, Rh, Ir, Os, Ru, dan Au secara kuantitatif pada secarik kertas diperoleh dengan elektrokromatografi dalam berbagai larutan elektrolit.Setelah kertas, medium lain yang tepat untuk percobaan elektromigrasi adalah kanji. Pemisahan pada umumnya dilaksanakan dalam kolom, dan kadangkala untuk sejumlah komponen mempunyai beberapa kelebihan disbanding dengan kertas. Teknik elektrokromatografi banyak digunakan pada pemisahan ion-ion anorganik dan diagnosis klinik.

Osmosis TerbalikTeknik ini adalah teknik yang sedang berkembang. Diantara pemakaiannya adalah pengolahan air limbah. Biasanya air dibersihkan dengan mengeluarkan kotoran dari air,tetapi dengan cara ini justru air diperas keluardari limbah air. Limbah berupa air garam dimasukkan melalui bagian celah sel. Pada bagian bawah air garam akan tersekat oleh suatu membrane semipermeabel yang umumnya terbuat dari polistirena, cellophane polivinil klorida atau etil selulosa.

Air segar cenderung untuk bergerak melalui membrane semi permeable menuju bagian yang konsentrasi garamnya tinggi, tetapi dengan memberikan tekanan yang cukup tinggi pada bagian air garamnya, tekanan osmosis normalinya dapat dibalik, berarti aliran dan keluar pada saluran bagian bawah. Osmosis terbalik tidak mempunyai pemakaian analitik.

ElektrodialisisMetode ini merupakan metode yang masih dapat dikembangkan, yang mana ion-ion positif dan negative dalam suatu aliran air rawa-rawa dipisahkan dengan melakukannya sepanjang membrane penukar ion dibawah pengaruh medan listrik.air rawa-rawa dimasukkan melalui tiga saluran pada bagian atas sel. Suatu medan listrik dengan kutub membuat ion positif dan ion negative bergeser pada arah yang berlawanan.

Dengan pemilihan membrane penukar ion yang tepat, maka dimungkinkan menjadikan membrane kation permeable terhadap kation dan penukar anion yang permeable terhadap anion. Dengan pengaturan kondisi aliran, air yang keluar sebagai efluen pada penyalur bagian tengah akan mengandung garam yang lebih rendah disbanding kedua penyalur lainnya.teknik ini sebenarnya dasar pengembangan tekik osmosis terbalik.

BAB IV REPLIKASI DNA

Di dalam bab ini akan dibahas tiga fungsi DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme serta cara replikasi DNA baik pada sistem prokariot maupun eukariot. Dengan mempelajari pokok bahasan ini akan diperoleh gambaran mengenai perbedaan cara replikasi DNA di antara kedua kelompok organisme tersebut.

Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:

1. tiga fungsi DNA sebagai materi genetik, 1. mekanisme replikasi semikonservatif,2. mekanisme replikasi lingkaran menggulung,3. pengertian replikon, ori, garpu replikasi, dan termini,

2. cara replikasi DNA pada prokariot, dan 1. cara replikasi DNA pada eukariot.

Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur asam nukleat, khususnya DNA, dan struktur molekuler kromosom, yang masing-masing telah dijelaskan pada Bab II dan Bab III.  Selain itu, konsep dasar tentang replikasi DNA yang telah diperoleh pada mata kuliah Genetika juga sangat mendukung pemahaman materi bahasan di dalam bab ini.

Fungsi DNA sebagai Materi GenetikDNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini.

1. DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi. Inilah materi yang akan dibahas di dalam bab ini.

2. DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen (Bab V hingga Bab VII).

3. DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa perubahan semacam ini, evolusi tidak akan pernah berlangsung. Fungsi ini merupakan fungsi evolusioner, yang dilaksanakan melalui peristiwa mutasi (Bab VIII).

Mekanisme Replikasi Semikonservatif

Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida

baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru.

konservatif                        semikonservatif                            dispersif

Gambar 4.1. Tiga cara teoretis replikasi DNA

= untai lama            = untai baru

Di antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.

Mereka menumbuhkan bakteri Escherichia coli selama beberapa generasi di dalam medium yang mengandung isotop nitrogen 15N untuk menggantikan isotop nitrogen normal 14N yang lebih ringan. Akibatnya, basa-basa nitrogen pada molekul DNA sel-sel bakteri tersebut akan memiliki 15N yang berat. Molekul DNA dengan basa nitrogen yang mengandung 15N mempunyai tingkat kerapatan (berat per satuan volume) yang lebih tinggi daripada DNA normal (14N). Oleh karena molekul-molekul dengan tingkat kerapatan yang berbeda dapat dipisahkan dengan cara sentrifugasi tersebut di atas, maka Meselson dan Stahl dapat mengikuti perubahan tingkat kerapatan DNA sel-sel bakteri E. coli yang semula ditumbuhkan pada medium 15N selama beberapa generasi, kemudian dikembalikan ke medium normal 14N selama beberapa generasi berikutnya.

Molekul DNA mempunyai kerapatan yang lebih kurang sama dengan kerapatan larutan garam yang sangat pekat seperti larutan 6M CsCl (sesium khlorida).  Sebagai perbandingan, kerapatan DNA E.coli dengan basa nitrogen yang mengandung isotop 14N dan 15N masing-masing adalah 1,708 g/cm3 dan 1,724 g/cm3, sedangkan kerapatan larutan 6M CsCl adalah 1,700 g/cm3.

Ketika larutan 6M CsCl yang di dalamnya terdapat molekul DNA disentrifugasi dengan kecepatan sangat tinggi, katakanlah 30.000 hingga 50.000 rpm, dalam waktu 48 hingga 72 jam, maka akan terjadi keseimbangan tingkat kerapatan. Hal ini karena molekul-molekul garam tersebut akan mengendap ke dasar tabung sentrifuga akibat adanya gaya sentrifugal, sementara di sisi lain difusi akan menggerakkan molekul-molekul garam kembali ke atas tabung. Molekul DNA dengan tingkat kerapatan tertentu akan menempati kedudukan yang sama dengan kedudukan larutan garam yang tingkat kerapatannya sama dengannya.

medium 15N     ekstrak DNA

(generasi 0)

ekstrak DNA

medium 14N        (generasi 1)

ekstrak DNA

(generasi 2)

medium 14N

ekstrak DNA

medium 14N       (generasi 3)

interpretasi data hasil sentrifugasi DNA

Gambar 4.2. Diagram percobaan Meselson dan Stahl yang memperlihatkan

replikasi DNA secara semikonservatif

DNA yang diekstrak dari sel E. coli yang ditumbuhkan pada medium 15N terlihat  menempati dasar tabung. Selanjutnya, DNA yang diekstrak dari sel E.coli yang pertama kali dipindahkan kembali ke medium 14N terlihat menempati bagian tengah tabung. Pada generasi kedua setelah E.coli ditumbuhkan pada medium 14N ternyata DNAnya menempati bagian tengah dan atas tabung. Ketika E.coli telah ditumbuhkan selama beberapa generasi pada medium 14N, DNAnya nampak makin banyak berada di bagian atas tabung, sedangkan DNA yang berada di bagian tengah tabung tetap. Meselson dan Stahl menjelaskan bahwa pada generasi 15N, atau dianggap sebagai generasi 0, DNAnya mempunyai kerapatan tinggi. Kemudian, pada generasi 14N yang pertama, atau disebut sebagai generasi 1, DNAnya merupakan hibrid antara DNA dengan kerapatan tinggi dan rendah. Pada generasi 2 DNA hibridnya masih ada, tetapi muncul pula DNA baru dengan kerapatan rendah. Demikian seterusnya, DNA hibrid akan tetap jumlahnya, sedangkan DNA baru dengan kerapatan rendah akan makin banyak dijumpai. Pada Gambar 4.2 terlihat bahwa interpretasi data hasil percobaan sentrifugasi ini jelas sejalan dengan cara pembentukan molekul DNA melalui replikasi semikonservatif.

Pada percobaan Meselson dan Stahl ekstrak DNA yang diperoleh dari sel-sel E. coli berada dalam keadaan terfragmentasi sehingga replikasi molekul DNA dalam bentuknya yang utuh sebenarnya belum diketahui. Replikasi DNA kromosom dalam keadaan utuh _ yang pada prokariot ternyata berbentuk melingkar atau sirkular _ baru dapat diamati menggunakan teknik autoradiografi dan mikroskopi elektron. Dengan kedua teknik ini terlihat bahwa DNA berbagai virus, khloroplas, dan mitokhondria melakukan replikasi yang dikenal sebagai replikasi θ (theta) karena autoradiogramnya menghasilkan gambaran seperti huruf Yunani tersebut. Selain replikasi θ, pada sejumlah bakteri dan organisme eukariot dikenal pula replikasi yang dinamakan replikasi lingkaran menggulung (rolling circle replication). Replikasi ini diawali dengan pemotongan ikatan fosfodiester pada daerah tertentu yang menghasilkan ujung 3’ dan ujung 5’. Pembentukan (sintesis) untai DNA baru terjadi dengan penambahan deoksinukleotida pada ujung 3’ yang diikuti oleh pelepasan ujung 5’ dari lingkaran molekul DNA. Sejalan dengan berlangsungnya replikasi di seputar lingkaran DNA, ujung 5’ akan makin terlepas dari lingkaran tersebut sehingga membentuk ’ekor’ yang makin memanjang (Gambar 4.3).

penambahan

nukleotida

ujung 3’

tempat ujung 5’ pelepasan ujung 5’    pemanjangan ’ekor’

terpotongnya ikatan fosfodiester

Gambar 4.3. Replikasi lingkaran menggulung

= untai lama            = untai baru

Replikon, Ori, Garpu Replikasi, dan TerminiSetiap molekul DNA yang melakukan replikasi sebagai suatu satuan tunggal dinamakan replikon. Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan hingga tercapai suatu ujung (terminus). Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.

Replikasi pada kedua untai DNAProses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand).  Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.

Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’.  Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’.  Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.

Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Fragmen-fragmen

Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.

fragmen-fragmen           untai tertinggal

3’                                           Okazaki                   5’

5’                               3’                              5’    3’

untai pengarah

Gambar 4.4. Diagram replikasi pada kedua untai DNA

Replikasi DNA prokariotReplikasi DNA kromosom prokariot, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi, DNA kromosom prokariot dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk, sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah.

Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’® 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’® 3’, eksonuklease 5’ ® 3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’ ® 5’. Eksonuklease 5’ ® 3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180°C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Replikasi DNA eukariotPada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariot bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.

Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukomatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. DNA sentromir dan telomir bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.

Seperti halnya pada prokariot, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III  pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariot (telomir) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.

ELEKTROFORESIS

DefinisiTehnik pemisahan komponen-komponen dengan pengaruh arus listrik sehingga terjadi laju perpindahan disebut sebagai suatu elektroforesis atau elektrokromatografi. Secara luas teknik ini

diklasifikasikan dalam tiga kelompok yaitu elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinyu.

Prinsip ElektroforesisJika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena ini adalah elektroforesis.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.

Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakuka kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi.

Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang palng sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun erikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary.Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarka perbedaan transport fisik zatterlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur, viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan.

Peralatan dan MetodologiSecarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit.

Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat inik juga telah dikembangkan.

Elekroforesis WilayahAda berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis.

Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel.

Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu)Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan.

Pemakaian Analitik ElektrokromatografiHomogenitas wilayah elektrokromatografi adalah suatu criteria penting untuk memperoleh kemurnian. Teknik elektrokromatografi pada kertas telah digunakan untuk pemisahan komponen-komponen yang sulit dipisahkan. Pemisahan anorganik segera dapat dil;akukan melalui agen pengompleks. Agen ini mempengaruhi laju kromatografi sedangkan kompleks elektromigrasi mempunyai afinitas adsorbsi yang berbeda terhadap medium migrasi serta berbagai bentukion sederhana misalkan Ag, Ni berpindah kearah katoda, tetapi dengan penambahan EDTA, Ni saja yang pindah ke anoda. Logam-logam alkali dan magnesium juga dipisahkan. Pemisahan Pb, Pt, Rh, Ir, Os, Ru, dan Au secara kuantitatif pada secarik kertas diperoleh dengan elektrokromatografi dalam berbagai larutan elektrolit.Setelah kertas, medium lain yang tepat untuk percobaan elektromigrasi adalah kanji. Pemisahan pada umumnya dilaksanakan dalam kolom, dan kadangkala untuk sejumlah komponen mempunyai beberapa kelebihan disbanding dengan kertas. Teknik elektrokromatografi banyak digunakan pada pemisahan ion-ion anorganik dan diagnosis klinik.

Osmosis TerbalikTeknik ini adalah teknik yang sedang berkembang. Diantara pemakaiannya adalah pengolahan air limbah. Biasanya air dibersihkan dengan mengeluarkan kotoran dari air,tetapi dengan cara ini justru air diperas keluardari limbah air. Limbah berupa air garam dimasukkan melalui bagian celah sel. Pada bagian bawah air garam akan tersekat oleh suatu membrane semipermeabel yang umumnya terbuat dari polistirena, cellophane polivinil klorida atau etil selulosa.

Air segar cenderung untuk bergerak melalui membrane semi permeable menuju bagian yang konsentrasi garamnya tinggi, tetapi dengan memberikan tekanan yang cukup tinggi pada bagian air garamnya, tekanan osmosis normalinya dapat dibalik, berarti aliran dan keluar pada saluran bagian bawah. Osmosis terbalik tidak mempunyai pemakaian analitik.

Elektrodialisis

Metode ini merupakan metode yang masih dapat dikembangkan, yang mana ion-ion positif dan negative dalam suatu aliran air rawa-rawa dipisahkan dengan melakukannya sepanjang membrane penukar ion dibawah pengaruh medan listrik.air rawa-rawa dimasukkan melalui tiga saluran pada bagian atas sel. Suatu medan listrik dengan kutub membuat ion positif dan ion negative bergeser pada arah yang berlawanan.

Dengan pemilihan membrane penukar ion yang tepat, maka dimungkinkan menjadikan membrane kation permeable terhadap kation dan penukar anion yang permeable terhadap anion. Dengan pengaturan kondisi aliran, air yang keluar sebagai efluen pada penyalur bagian tengah akan mengandung garam yang lebih rendah disbanding kedua penyalur lainnya.teknik ini sebenarnya dasar pengembangan tekik osmosis terbalik. Diposkan oleh ADEWIRLI PUTRA di 10:08 0 komentar Link ke posting ini Label: ELEKTROFORESIS गक (Gas Chromatography )

Kromatografi Gas adalah metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama lebih dari 30 tahun. Sekarang GC dipakai secara rutin di sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. GC dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu yang dipakai untuk pemisahan.

Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap danbergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas. Pada kromatografi cair pembatasan yang bersesuaian ialah komponen cairan harus mempunyai kelarutan yang berarti didalam fase gerak yang berupa cairan. Secara sepintas tampaknya pembatasan tekanan uap pada

Kromatografi gas lebih serius daripada pembatasan kelarutan pada kromatografi cair, secara keseluruhan memang demikian. Akan tetapi, jika kita ingat bahwa suhu sampai 400¬0C dapat dipakai pada kromatografi gas dan bahwa kromatografi dilakukan secara cepat untuk meminimumkan penguraian, pembatasan itu menjadi tidak begitu perlu. Disamping itu, pada KG, senyawa yang tak atsiri sering dapat dibah menjadi turunan yang lebih atsiri dan lebih stabil sebelum kromatografi.

Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya.

Ada beberapa kelebihan kromatografi gas, diantaranya kita dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi. Gs dan uap mempunyai viskositas yang rendah, demikian juga kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat, sehingga analisis relative cepat dan sensitifitasnya tinggi. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat-zat terlarut. Kelemahannya adalah tehnik ini terbatas unruk zat yang mudah menguap.

Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik utnuk campuran

sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Komponen campuran dapat diidentifikasikan dengan menggunakan waktu tambat (waktu retensi) yang khas pada kondisi yang tepat. Waktu tambat ialah waktu yang menunjukkan berapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom.waktu tambat diukur dari jejak pencatat pada kromatogram dan serupa dengan volumetambat dalam KCKT dan Rf dalam KLT. Dengan kalibrasi yang patut, banyaknya (kuantitas) komponen campuran dapat pula diukur secara teliti . kekurangan utama KG adalah bahwa ia tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan campuran pada tingkat g mungkin dilakukan; tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika tidak ada metode lain.

Pada KG dan KCKT, kolom dapat dipakai kembali dan jika dirawat dengan baik dapat tahan lama. Perawatan harus dilakukan karena kolom dapat sangat mahal.

Fase diam pada KG biasanya berupa cairan yang disaputkan pada bahan penyangga padat yang lembab , bukan senyawa padat yang berfungsi sebagai permukaan yang menyerap (kromatografi gas-padat). Sistem gas-padat telah dipakai secara luas dalam pemurnian gas dan penghilangan asap, tetapi kurang kegunaannya dalam kromatografi. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam cmapuran.

Satu-satunya pembatas pada pemilihan cairan yang demikian ialah bahwa zat cair itu harus stabil dan tidak atsiri pada kondisi kromatografi. Akan tetapi, keadaan ini berubah akibat pengembangan fase terikat dan pemakaian kolo kapiler atau kolom tabung terbuka yang sangat efisien. Pada fase terikat, cairan sebenarnya terikat pada penyangga padat atau pada dinding koplom kapiler, tidak hanya disaputkan begitu saja.Pemakaian detector untuk menganalisis efluen kromatograf secara sinambung telah memungkinkan adanya KG dan KCKT. Pada KG, tersedianya berbagai detector, pemakaiannya yang umum untuk banyak jenis senyawa, dan tingkat kepekaannya yang tinggi telah memungkinkan penentuan secara teliti berbagai jenis komponen dalam kisaran yang besar, kadang-kadang dalam jumlah yang sangat kecil. Tersedianya detector selektif, misalnya detector yang hanya mendeteksi senyawa yang mengandung P, N, atau S merupakan hal yang sangat penting pula. Ini berbeda dengan KCKT yang hanya menyediakan lebih sedikit jenis detector dan kurang peka.

Petunjuk cara kerjaWalaupun beberapa system KG sangat rumit, pada dasarnya cara kerjanya sama. Jika KG telah dinyalakan maka dapat dilakukan beberapa langkah berikut ini ;

1. istrumen diperiksa, terutama jika tidak dipakai terus-menerus. Ini dilakukan untuk mengecek apakah telah dipasang kolom yang tepat, apakah septum injector tidak rusak (apakah ada lubang besar atau bocor karena sering dipakai), apakah sambungan saluran gas kedap, apakah tutup tanur tertutup rapat, apakah semua bagian listrik bekerja dengan baik, dan apakah detector yang terpasang sesuai.

2. aliran gas kekolom dimulai atau disesuaikan. Ini dilakukan dengan membukan katup utama

pada tangki gas dan kemudian memutar katup (diafragma) sekunder kesekitar 15psi dan membuka katup jarum sedikit. Ini memungkinkan aliran gas yang lambat (2-5 ml)/menit untuk kolom kemas dan sekitar 0,5ml/menit untuk kolom kapiler melewati system dan melindungi kolom dan detector terhadap perusakan secara oksidasi. Dalam banyak instrument modern, aliran gas dapat diatur dengan rotameter atau aliran otomatis atau pengendali tekanan, atau dapat dimasukkan melalui modul pengendali berlandas mikroprosesor. Apapun jenisnya, sambungan system (terutama sambungan kolom) harus dicek dengan larutan sabun untuk mengetahui apakah ada yang bocor, atau dengan larutan khusus untuk mendeteksi kebocoran (SNOOP),atau dapat juga dengan larutan pendeteksi kebocoran niaga.

3. kolom dipanaskan sampai suhu awal yang dikehendaki. Ini dilakukan, pada instrument buatan lama, dengan memutar transformator tegangan peubah yang mengendalikan gelungan pemanas dalam tanur kesekitar 90 V. Diposkan oleh ADEWIRLI PUTRA di 10:07 0 komentar Link ke posting ini ह्प्ल्क ( High Performance Liquid Chromatography)

Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang da walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium.

Alat HPLC niaga terdiri atas system pencampur pelarut yang sangat canggih yang mampu menghasilkan campuran landaian yang mengandung sampai empat linarut yang berbeda, pompa yang mampu menghasilkan tekanan sampai 6000psi atau 10.000 psi, kolom yang mengandung fase diam (atau lebih tepat penyangga), dan system pendeteki sinambung yang bermacam-macam jenisnya. Yang paling sering ditemukan, seluruh radas itu dipimpin dan dikendalikan oleh mikroprosesor.

Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi yang mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh pemisahan yang sangat baik; seringkali, hasil dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative.

Sedikit banyak HPLC dan GC saling melengkapi. GC telah dilengkapi instrumen dan dikembangkan demikian rupa sehingga daya pisah yang tinggi dan hasil kuantitatif mudah diperoleh. Akan tetapi, GC mensyaratkan bahwa seyawa yang dipisahkan haruslah atsiri. HPLC mempunyai pembatas yang sebanding yaitu cuplikan harus larut didalam zat cair. Akan tetapi ini bukan pembatas yang berat., dan setidaknya HPLC dapat dipakai untuk sebagia besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik, yang sebagian besar tidak atsiri. HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, senyawa yang tidak tahan panas dapat diangani dengan mudah.

Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas denganberacam diameter.parikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan

sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom.

Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang ; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi.

Prinsip HPLCLuas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang. Sedangkanparameter-parameter yang menentukan proses berlangsungnya proses-prosess tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dan ketebalan stasioner.

PenunjangPenunjang fase diam harus tahan erhadap tekanan. Biasanya penunjang anorganik bersifat stabil dan tahan sampai tekanan 600 atm. Struktur dengan pori-pori yang besar akan rusak bila diberi tekanan tinggi. Penukar ion, mempunyai permeabilitas yang rendah bila diberi tekanan.

Penunjang yang baik adalah silica gel dan alumina. Penunjang dengan bahan kimia di permukaannya (bonded phase) mempunyai kelebihan karena tidak perlu dijenuhkan lagi permukaannya oleh fase cair dan idak memerlukan prekolom. Fase diam terikat secara kovalen dengan permukaan zat padat penunjang sehingga diharapkan tidak mudah lepas dan mengkontaminasi eluen.

Penunjang dengan kemampuan penukar ion pemakaiannya terbatas,karena mudah terkompresi,tetapi saat ini bermacam resin sintetis yang taha tekanan sampai 200 amosfer sudah dapat diperoleh. Resin demikian mempunyai kapasitas penukar ion antara 3 sampai 5 meq/g.

Penunjang fase diam untuk kromatografi eksklusi lebih rumit daripada resin penukar ion. Hamper semua ipe gel dalam kolom untuk jenis eksklusi tidak tahan tekanan. Penyusutan volume akan terjadi sehingga permeabilitasnya turun dan akibatnya efisiensi pemisahan menurun.

PemakaianHPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori.

Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya lebih pendek. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan.

Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom kromatografi. Diposkan oleh ADEWIRLI PUTRA di 10:05 0 komentar Link ke posting ini

kromatografi ionAplikasi kromatografi ion modern di banyak bidang keilmuan menjadikan teknik ini lebih favorit digunakan dibanding dengan teknik deteksi ion lainnya. Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi ion sehingga menjadikan “the best choice” dalam dunia penentuan/pemisahan ion/logam, di antaranya :

a. Kecepatan (speed):

Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang sangat penting dalam hal analisis ion। Salah satu yang menyebabkannya adalah masalah ｡ｦ klasik｡ｦ yaitu untuk mengurangi biaya dan bisa menghasilkan data-data analisis yang akurat dan cepat। Namun lebih daripada itu, sebenarnya yang lebih penting adalah memberikan andil dengan maksimal dalam perhatian kepada kondisi lingkungan (environmental efforts) yang dari hari ke hari jumlah sampel yang mau dianalisis (untuk diketahui kandungan apa saja di dalamnya) semakin bertambah। Itulah sebabnya, teknik ini terus dikembangkan orang untuk mendapatkan teknik pemisahan/pendeteksian yang lebih praktis dengan biaya yang relatif murah। Sebagai tambahan pula bahwa limbah (waste) yang dihasilkan dari penggunaan eluen dapat dikurangi.

b. Sensitivitas (sensitivity):

Dengan berkembangnnya teknologi mikroprosessor, mulailah orang mengkombinasikannya dengan efisiensi kolom pemisah, mulai skala konvensional (ukuran diameter dalam milimeter) sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolumn। Sehingga walaupun hanya dengan jumlah sampel yang sangat sedikit, semisal 10 ｦ｡｡ｦ yang diinjetkan ke dalam sistem kromatografi, ion-ion yang ada dalam sampel tersebut dapat terdeteksi dengan baik।

c. Selektivitas (selectivity):

Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan keinginan, misalnya kation/anion organik saja atau kation/anion anorganik yang ingin dipisahkan। Itu dapat dilakukan dengan memilih kolom pemisah yang tepat। Ataupun hanya ion tertentu yang ingin diukur walaupun banyak ion lain yang ada dalam sampel।

d. Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection):

Secara umum, anion dan kation dipisahkan/dideteksi terpisah dengan menggunakan sistem analisis yang terpisah (different systems) pula। Padahal sangat penting dilakukan pendeteksian secara serempak (simultaneous) antara anion dan kation dalam dalam sekali injek untuk sebuah

sampel। Tentunya, pendekatan yang terakhir ini punya sejumlah kelebihan dibanding pemisahan terpisah। Sebagaimana telah diulas di atas, beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan biaya operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis berlangsung, memperpendek waktu analisis (short time analysis) serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan।

e. Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column):

Walaupun sebenarnya, ketahanan kolom ini berdasarkan pada paking (packing) material yang diisikan ke dalam kolom pemisah। Namun kebanyakan, kolom pemisah bisa bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan mempengaruhi kestabilan material penyusun kolom। Namun, diakui bahwa ada juga kolom pemisah yang mempunyai waktu penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan paking kolom yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya।

Literatur

[1] J. Weiss, Ion chromatography, 2nd ed., VCH, Weinheim (1995).[2] J. S. Fritz, D. T. Gjerde, Ion chromatography, 3rd ed., VCH, Weinheim (1999).[3] R. Saari-Nordhaus, L. Nair, J. M. Anderson, Jr., J. Chromatogr. 602 (1992) 127.[4] K. J. B. A. Karim, J.-Y. Jin, T. Takeuchi, J. Chromatogr. A 995 (2003) 153.[5] M Amin, L. W. Lim, T. Takeuchi, Anal. Bioanal. Chem. 381 (2005) 1426.[6] M. Amin, L. W. Lim, T. Takeuchi, Anal. Bioanal. Chem., 384 (2006) 839.[7] M. Amin, L. W. Lim, T. Takeuchi, Talanta, 71 (2007) 1470.