LAPORAN GENETIKA MOLEKULER

ELEKTROFORESIS DAN KUANTIFIKASI DNA

Hari/Tanggal: Jum’at, 15 Juni 2012

Disusun Oleh:

1. Ira Nailas (081014097)2. Selva Rosyta Dewi (081014099)3. Nur Apriana (081014106)4. Dias Rizka Darisa (081014111)5. Indira Faya N (081014114)

Dosen Pembimbing

M. Hilman F.A, Ssi.,M.Si

PROGRAM STUDI BIOLOGIDEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS AIRLANGGA

I. TUJUAN

Mengajarkan dan melatih kepada mahasiswa untuk dapat ampifikasi dan elektroforesis DNA

darah dan tumbuhan.

II. DASAR TEORI

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau

perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi

yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik

(titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,

besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Campbell dkk. 2002: 396--398).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas

ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfatkan

muatan listrik yang ada pada makro molekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika

molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium misalnya gel agarose,

kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul

tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut

tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk

molekulnya. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein

(Yuwono, 2005).

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip

dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya

gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula

digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam

metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-

blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis gel merupakan

suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi

molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-

bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap

campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam

elektroforesis) (Finkelstein, 2007).

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk

proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula

deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di

dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi

hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. (Sambrook & Russell

2001: 52--53).

III. ALAT dan BAHAN

Bahan : Alat :

Pewarna ethidium bromide Erlenmeyer

Agarosa Seperangkat alat elektroforesis

Buffer TAE Glove

Loading dye UV transluminator

IV. PROSEDUR KERJA

1. Pembuatan Gek agarosa

a. Timbang 0,5 gr Agarosa

b. Larutkan dalam 50 mL x 1 x Buffer TAE ke Erlenmeyer lalu larutkan

c. Panaskan Erlenmeyer hingga mendidih dan larutan jernih.

d. Dinginkan larutan agarosa (500C)x 2 µL Larutan ethidium bromide, campur hingga

homogen.

e. Siapkan tray, lalu tutup denganisolator pada ujung dan tuangkan larutan agarosa

dalam tray yang telah dipasang well-forming combs.

f. Tunggu sampai gel mengeras (± 25oC) lepas comb secara perlahan dan gel agarosa

siap digunakan.

2. Running Elektroforesis

a. Letakkan tray berisi gel agarosa dalam tanki elektroforesis dengan posisi gel terdapat

well pada kutub (-) DNA akan menuju kutub (+).

b. Tuang larutan 1x buffer TAE ke dalam tank elektroforesis sampai permukaan gel

terendam.

c. Ambil sampel 10 µL isolasi DNA dan letakkan di atas parafilm. Lalu campur dengan

2µL loading dye, lalu resuspen hingga homogeny.

d. Ambil 4-8 µL larutan, dan masukkan dalam well pada gel agarosa.

e. Tutup tank elektroforesis dan hubungkan ke arud listrik (100-120 V)

f. Tunggu selama ± 1 jam (running elektroforesis) sampai terlihat DNA migrasi

g. Matikan arus listrik dan ambil tray dengan glove setelah elektroforesis selesai.

h. Meletakkan tray pada UV transluminator (tampak pita DNA ) dan siapkan.

V. HASIL PENGAMATAN

No Gambar Keterangan

1. Hasil dari DNA yang telah

di UV. DNA sebelah kanan

merupakan gelombang 1 ,

dimana sampel dari

tumbuhan tidak ada DNA-

nya, sedangkan dari sampel

darah manusia DNA-nya

ada semua. Sedangkan

DNA sebelah kiri

merupakan gelombang 2,

dimana sampel dari

tumbuhan ada semua

bahkan ada RNA-nya dalam

jumlah yang cukup banyak ,

sedangkan dari sampel

manusia DNA-nya ada

semua namun tidak

sebanyak dengan DNA

milik gelombang 1.

2. Ini adalah sampel DNA dari

gelombang 2, dimana

sampel DNA dari tumbuhan

ada semua bahkan ada RNA

dalam jumlah yang cukup

banyak , sedangkan DNA

dari sampel darah manusia

DNA ada semua tetapi

sedikit sekali diketahui dari

pita DNA-nya yang sangat

tipis.

3. Ini adalah sampel DNA dari

gelombang 1, dimana

sampel DNA dari tumbuhan

ada yang tidak ada,

sedangkan DNA dari

sampel darah manusia DNA

ada semua diketahui dari

pita DNA yang tebal.

VI. PEMBAHASAN

DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan senyawa biomolekuler

pembawa sifat genetik yang tersusun dari asam nukleat dan pengatur

seluruh perkembangan biologis makhluk hidup. DNA hadir dalam bentuk

double helix (pilinan ganda) berupa dua pita yang saling berpasangan. Satu

pita DNA tersusun dari banyak nukleotida. Nukleotida merupakan monomer

dari DNA. Nukleotida terdiri dari gugus gula, basa nitrogen dan fosfat

(Irawan,2008). Komponen fosfat yang melekat pada atom C5' dari gula

memiliki dua atom O yang belum berpasangan. Keadaan demikian membuat

nukleotida bermuatan negatif sebagaimana gambar di bawah ini:

Nukleotida-nukleotida tersebut akan saling berikatan dengan ikatan

fosfodiester membentuk suatu pita DNA. Sekalipun pita DNA yang panjang

tidak mengalami kendala dalam ikatannya namun pita DNA tersebut akan

selalu bermuatan negatif.

Pada tahun 1947, sebelum ditemukannya struktur molekul DNA,

seorang ahli biokimia bernama Erwin Chargaff menganalisis komposisi basa

DNA sejumlah organisme yang berbeda. Hasil analisisnya adalah tiap spesies

organisme memiliki komposisi DNA yang berbeda-beda. Banyaknya keempat

basa nitrogen pada tiap spesies tidak sama, tetapi memiliki perbandingan

yang khas. Artinya, tiap spesies memiliki jumlah basa yang khas. Dalam DNA

setiap spesies yang ditelitinya, Chargaff mengemukakan bahwa jumlah

adenin hampir sama dengan jumlah timin dan jumlah sitosin hampir sama

dengan jumlah guanin. Selain itu, urutan basa dan panjang DNA pada tiap

spesies berbeda. Dengan 4 macam basa dan DNA yang panjang, akan

terbentuk berbagai kemungkinan urutan basa. Karena gen tersusun dari

urutan basa tertentu, maka jumlah gen pada DNA juga sangat banyak

kemungkinannya. Jadi, hanya dengan 4 macam basa akan terbentuk banyak

gen yang menentukan sifat individu.

Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA murni dari pengotor-

pengotor yang terdapat pada sel, misalnya organel-organel sel lainnya.

Sedangkan proses elektroforesis merupakan suatu migrasi partikel melalui

suatu media di bawah pengaruh medan listrik. Pada praktikum kali ini

menggunakan gel agarose sebagai medianya. pembuatan gel agarose

dilarutkan dalam buffer TAE hingga larut. Penambahan larutan buffer pada

pembuatan gel agarose berfungsi untuk mendukung proses elektroforesis

Kebanyakan gel agarosa dibuat antara 0,7% dan 2%. Sebuah gel 0,7%

akan menunjukkan pemisahan yang baik (resolusi) fragmen DNA besar (kb

5-10) dan gel 2% akan menunjukkan resolusi yang baik untuk fragmen kecil

(0,2-1 kb). Gel dalam persentase rendah bersifat sangat lemah dan bisa

pecah ketika diangkat. Gel dalam persentase yang tinggi sering rapuh dan

tidak larut secara merata. Pada praktikum kali ini menggunakan prosentase

1%.

Tujuan dari penggunaan gel ini untuk melihat DNA. DNA

divisualisasikan pada gel dengan penambahan etidium bromida pada saat

gel agarose yang telah didihkan mengalami penurunan suhu atau diberikan

pada suhu berkisar 50oC bertujuan untuk meminimalkan penguapan etidium

bromida. Etidium bromida sangat berbahaya atau bersifat mutagenik.

Kelebihannya, Etidium bromida dapat mengikat kuat DNA dengan

terinterkalasi antara dasar dan neon yang berarti bahwa ia menyerap sinar

UV tidak terlihat dan memancarkan energi sebagai cahaya oranye terlihat.

Sebelum gel agarose dituangkan dalam tray dipasang comb (yang telah

ditentukan jumlah well sesuai kebutuhan) terlebih dahulu untuk membuat

well. Dimana well tersebut digunakan untuk meletakkan hasil isolasi DNA.

Well merupakan kutub negatif yang merupakan tempat DNA. Telah kita

bahas di atas bahwa DNA bermuatan negatif.

Gel agarose yang telah dingin dalam tray dimasukkan dalam tank

elektroforesis. Namun sebelumnya comb harus dilepas secara perlahan agar

gel tidak rusak. Selanjutnya dilakukan penuangan buffer TAE ke dalam tank

elktroforesis. Penggunaan buffer TAE pada proses elektroforesis tersebut

digunakan sebagai media perantara katode yang dialirkan dari sumber listrik

ke dalam gel. Penggunaan larutan penyangga yang sama pada pembuatan

gel, sample dan media perantara katode dinamakan continuous buffer

system. Dalam sistem kontinu, muatan molekul dan ukuran pori gel adalah

satu-satunya faktor yang memiliki efek penting pada pemisahan dan

penyusunan atau konsentrasi sampel ke dalam sebuah band. Sebuah band

terkonsentrasi bentuk sampel dimana molekul melambat antara permukaan

buffer dan gel.

Sampel hasil isolasi DNA 10 µl dicampur dengan loading dye 2 µl,

kemudian di-resuspen hingga homogen. Penambahn loading dye pada

sample memiliki dua tujuan. Pertama, pewarna tersebut memberikan

muatan untuk membantu berat DNA, sehingga dapat tenggelam ke dasar

sumur dan tidak mengapung dalam larutan buffer. kedua, loading dye

bergerak lebih cepat dari bagian DNA yang sebenarnya sehingga dapat

dijadikan sebagai indikator untuk mengetahui kapan listrik pada ruang

elektroforesis harus dimatikan. Cairan tersebut juga membuat DNA terlihat

dengan mata telanjang, memberikan warna keunguan, dan membuat proses

elektroforesis lebih cepat berlangsung.Proses elektroforesis berlangsung

selama kurang lebih satu jam. Kemudian tray hasil dari proses elektroforesis

diletakkan dalam UV transluminator untuk melihat band-band DNA.

VII. KESIMPULAN

Proses elektorforesis ialah suatu proses migrasi molekul-molekul DNA

dari muatan negatif ke muatan positif melalui suatu larutan penyangga.

Proses ini bertujuan untuk melihat pita-pita DNA pada suatu sampel.

Penggunaan larutan penyangga atau buffer yang sama pada pembuatan gel,

sample dan media perantara katoda dinamakan continuous buffer system.

Penambah loading dye ialah untuk memberikan pewarnaan dan muatan

pada DNA agar tidak mengapung dalam larutan buffer.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Terj. dari Biology oleh

Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.

Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm.

David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC.

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

Sambrook, J. & D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual vol 2. 3rd ed.

Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

Skoog, A. D; F. J. Holler; and T. A. Nieman. 1998. Principle of Instrumental Analysis Fifth

Edition. Saunders College Publishing.

Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga: Jakarta.

Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.

XI. LAMPIRAN

No Gambar Keterangan1.

Ethidium Bromine

2.Buffer TAE

3.Tray yang masih kosong dan yang menutup isolator pada ujung

4.Proses pembuatan Gel Agarose

5.Penuangan agarose pada tray,yang telah di beri sisir.

6.Gel Agarose yang sudah mengeras

7.Agarose yang telah memadat dan diambil sisirnya,agar membentuk kolom-kolom

8.Saat penuangan larutan 1x buffer TAE ke tank elektroforesis sampai permukaan gel terendam

9.Sampel DNA tumbuhan maupun darah yang akan digunakan untuk elektroforesis

10.Pengambilan sampel DNA tumbuhan maupun darah

11.Saat pengambilan sampel 10 µl isolasi DNA tumbuhan maupun darah dan meletakkan diatas parafilm kemudian mencampurkannya atau meresuspen.

12.Saat akan memberikan larutan dan dimasukkan dalam well pada gel agarose

13.sampel dalam well pada agarose, yang siap untuk di elektroforesis

14.Saat menutup tank elektroforesis

15.Menghubungkan arus ke listrik (100 volt ) selama 2 jam (running elektroforesis sampai terlihat molekul DNA migrasi

16.Saat meletakkan Try pada UV transluminator (akan tampak pita DNA)

17.Pita DNA tumbuhan

18.Pita DNA hewan