ELEKTROFORESIS

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein. Sekarang telah meluas kebanyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.  Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.  Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel – partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel – partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein.  Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug& Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan

jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug& Cummings 1994: A-7). Melalui teknik ini dapat ditentukan:

1. Berat molekul suatu bahan

2. Banyaknya jenis protein pada suatu sampel

3.Adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan4. Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri pathogen tertentu

5. Titik isoelektrik protein

Berdasarkan jenisnya, ada dua macam elektroforesis yaitu:1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarosa atau poliakrilamid.

Jenis elektroforesis

Perangkat elektroforesis gel

1. Elektroforesis kertas  adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat  terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. 2. Elektroforesis gel  ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul - molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menujukutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif

(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215).

            Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat (Fairbanks & Andersen 1999: 280).  Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.  

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:1.    Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan

penandaoligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. Terbentuknya gel ini dengan mencampurkan larutan akrilamid dengan ammonium persulfat dan TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl ethylenediamine).

2.    Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. Secara fisik, agarosa tampak seperti bubuk putih yang sangat halus. Agarosa yang dijual secara komersial terkontaminasi dengan polisakarida, garam dan protein. Banyak sedikitnya kontaminasi di dalam gel dan kemampuan mengambil DNA dari dalam gel untuk digunakan sebagai substrat dalam reaksi enzimatis. Gel agarosa dapat dicetak dengan memanaskan agarosa dalam larutan bufer sampai didapatkan larutan jernih.

3.    Gel agarosa formal dehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuranstandar.(Davis dkk. 1994: 151).            Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:  1.  Comb: digunakanuntukmembentuk well pada gel agarosa.2.  Tray: digunakanuntuksebagaicetakan gel agarosa.3.  Chamber: digunakansebagaiwadah gel agarosa.4.  Sumberlistrik: digunakanuntukmemberiarussaat proses elektroforesis.

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:1. Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.2. Arus listrikSemakin besar arus listrik yang digunakan, laju migrasi akan semakin cepat. Akan tetapi jika arus yang digunakan besar, akan menimbulkan panas yang dapat menyebabkan gel meleleh.3.    Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi

memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

4. Bentuk molekulDNA memiliki beberapa bentuk berbeda. Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. ssDNA (single stranded DNA) lebih cepat migrasinya dibandingkan dsDNA (double stranded DNA) yang berukuran sama.

5. Densitas muatan Muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

6. Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

7. VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

8. Larutan buffer elektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA. (Wolfe 1993: 127; Bowen 2000: 3-4). Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan bufer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik akan menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.

9. Arah medan listrikMolekul DNA akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbanding

terbalik dengan ukuran molekulnya jika medan listrik tetap/konstan. Jika arah medan listrik diubah, molekul yang besar akan membutuhkan waktu yang lebih lama untuk reorientasi. Elektroforesis dengan mengubah arah medan listrik secara periodik dikenal dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE).

Peralatan untuk elektroforesis secara umum terdiri dari 2 komponen utama, yaitu power supply sebagai sumber arus listrik dan tangki elektroforesis.

 Gambar 1. Peralatan Elektroforesis