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  • DEPARTAMENT DE BIOLOGIA, CULTIU I PATOLOGIA D’ESPÈCIES MARINES DUPLICACIÓN, ORGANIZACIÓN GENÓMICA Y REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE LOS RECEPTORES DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO DE PECES. ASPECTOS BÁSICOS Y APLICADOS EN DORADA SPARUS AURATA. ALFONSO SAERA VILA

    UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Servei de Publicacions

    2010

  • Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a València el dia 13 de novembre de 2009 davant un tribunal format per:

    - Dra. Silvia Zanuy Doste - Dr. Lluis Tort Bardolet - Dra. Mª del Mar Malagón Poyato - Dr. Juan Miguel Mancera Romero - Dr. Rubén D. Artero Allepuz

    Va ser dirigida per: Dr. Jaume Pérez Sánchez ©Copyright: Servei de Publicacions Alfonso Saera Vila Dipòsit legal: V-1059-2011 I.S.B.N.: 978-84-370-7795-6

    Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Spain

    Telèfon:(0034)963864115

  • FACULTAT DE CIÈNCIES BIOLÒGIQUES

    UNIVERSITAT DE VALÈNCIA

    DEPARTAMENT DE GENÈTICA

    DUPLICACIÓN, ORGANIZACIÓN GENÓMICA Y REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE LOS

    RECEPTORES DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO DE PECES. ASPECTOS BÁSICOS Y

    APLICADOS EN DORADA (Sparus aurata) Memoria presentada por Alfonso Saera Vila para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas

    Fdo.: Alfonso Saera Vila

    Valencia, septiembre 2009 LA PRESENTE TESIS DOCTORAL HA SIDO DIRIGIDA POR EL DOCTOR JAUME PÉREZ SÁNCHEZ, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (INSTITUTO DE ACUICULTURA DE TORRE LA SAL), Y CUMPLE CON TODOS LOS REQUISITOS EXIGIDOS POR LA LEGISLACIÓN VIGENTE.

    Fdo.: Jaume Pérez Sánchez

  • Para desarrollar la investigación descrita en esta memoria, Alfonso Saera Vila recibió una beca predoctoral de la Excelentísima Diputación Provincial de Castellón.

  • “La virtud está en el término medio”

    Aristóteles (384 a.c. – 322 a.c.) c

  • Índice

    I

    1. ....................................................................... 1 Prólogo 2. Introducción.............................................................11

    2.1. Familia GH/PRL............................................................. 13 2.1.1. Origen y evolución .................................................. 13 2.1.2. Estructura proteica y organización genómica.......... 18 2.1.3. Función biológica .................................................... 21

    2.1.3.1. Regulación del crecimiento: eje somatotrópico 22 2.2. Receptores de la hormona del crecimiento..................... 25

    2.2.1. Superfamilia de receptores de citoquina clase I ...... 25 2.2.2. Receptores de la hormona del crecimiento de tetrápodos........................................................................... 26

    2.2.2.1. Transducción de la señal................................... 28 2.2.2.2. Organización genómica y formas alternativas.. 31

    2.2.3. GHR de peces .......................................................... 35 3. Objetivos y plan de trabajo......................................43 4. Material y Métodos..................................................51

    4.1. Extracción de ARN......................................................... 53 4.2. Retrotranscripción........................................................... 56 4.3. Secuenciación del ADNc del GHR-II............................. 56

    4.3.1. Diseño de cebadores ................................................ 56 4.3.2. Amplificación y secuenciación................................ 57 4.3.3. Amplificación de los extremos 5’ y 3’ .................... 59

    4.4. Inicio de la transcripción ................................................ 61 4.5. Organización genómica .................................................. 62

    4.5.1. Extracción de ADN genómico................................. 62 4.5.2. Amplificación por PCR ........................................... 63 4.5.3. Librerías genómicas................................................. 64

    4.6. Análisis bioinformáticos................................................. 65 4.7. Análisis de la expresión génica....................................... 65 4.8. Ensayos bioquímicos ...................................................... 72

    4.8.1. GH e IGF-I............................................................... 72 4.8.1.1. Radioyodación .................................................. 74 4.8.1.2. Radioinmunoensayos de GH e IGF-I ............... 75

    4.8.3. Cortisol .................................................................... 78 4.8.4. Glucosa .................................................................... 79

    4.9. Animales en experimentación......................................... 80 4.9.1. Condiciones de cultivo ............................................ 80 4.9.2. Muestreos................................................................. 81

  • Índice

    II

    4.9.2.1. Biomasa .............................................................81 4.9.2.2. Sangre y tejidos .................................................82

    4.10. Modelos experimentales ................................................82 4.10.1. Ayuno .....................................................................82 4.10.2. Estación ..................................................................82 4.10.3. Edad........................................................................83 4.10.4. Reto frente a patógeno............................................84

    4.10.4.1. Diseño experimental ........................................84 4.10.4.2. Detección del parásito .....................................86

    4.10.4.2.1. Técnicas histológicas................................86 4.10.4.2.2. Técnicas moleculares................................86

    4.10.5. Estrés por confinamiento ........................................87 4.11. Análisis estadísticos.......................................................89

    5. Resultados ............................................................... 91 5.1. Secuenciación del GHR-II...............................................93 5.2. Organización genómica de los GHR de dorada ............102

    5.2.1. Sitio de inicio de la transcripción ...........................102 5.2.2. Estructura exón-intrón ............................................102 5.2.3. Región flanqueante en 5’........................................105

    5.3. Modelos experimentales ................................................109 5.3.1. Ayuno .....................................................................109 5.3.2. Estación ..................................................................110 5.3.3. Edad........................................................................114 5.3.4. Reto frente a parásito..............................................118

    5.3.4.1. Progresión de la infección ...............................118 5.3.4.2. Análisis de la expresión génica .......................119

    5.3.5. Estrés por confinamiento ........................................121 5.3.5.1. Marcadores plasmáticos de estrés ...................121 5.3.5.2. Eje GH-IGF .....................................................122

    5.4. Anexo: Resumen de las correlaciones ...........................126 6. Discusión ............................................................... 127

    6.1. Duplicación del GHR en el genoma de peces ...............129 6.2. Organización genómica de los GHR de peces ..............135

    6.2.1. Sitio de inicio de la transcripción y región flanqueante en 5’ ..................................................................................140

    6.3. Regulación transcripcional de los GHR de dorada........144 7. Conclusiones ......................................................... 163 8. Bibliografía............................................................ 167

  • Índice

    III

    9. Anexo: artículos publicados ..................................203

     Saera-Vila A, Calduch-Giner JA y Pérez-Sánchez J (2005). Duplication of growth hormone receptor (GHR) in fish genome: gene organization and transcriptional regulation of GHR type I and II in gilthead sea bream (Sparus aurata). General and Comparative Endocrinology 142, 193-203.

     Saera-Vila A, Calduch-Giner JA y Pérez-Sánchez J (2007). Co-expression of IGFs and GH receptors (GHRs) in gilthead sea bream (Sparus aurata L.): sequence analysis of the GHR-flanking region. Journal of Endocrinology 194, 361-372.

     Sitjà-Bobadilla A, Calduch-Giner JA, Saera-Vila A, Palenzuela O, Álvarez-Pellitero P y Pérez-Sánchez J (2008). Chronic exposure to the parasite Enteromyxum leei (Myxozoa: Myxosporea) modulates the immune response and the expression of growth, redox and immune relevant genes in gilthead sea bream, Sparus aurata L. Fish & Shellfish Immunology 24, 610-619.

     Saera-Vila A, Calduch-Giner JA, Prunet P y Pérez- Sánchez J (2009). Dynamics of liver GH/IGF axis and selected stress markers in juvenile gilthead sea bream (Sparus aurata) exposed to acute confinement. Differential stress response of growth hormone receptors. Comparative Biochemistry and Physiology

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