02-tècniques de cultiu (i)

8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)

1/16

2. TÈCNIQUES DE CULTIUS (I)

1. Condicions físiques

1.1. Temperatura d'incubació

1.2. pH

1.3. Constitució fase gasosa

1.4. Pressió osmòtica

1.5. Tipus de substrat

1.6. Tipus de flascons

2. Condicions biològiques

2.1. Constituents del medi

2.2. Solucions salines equilibrades

2.3. Medis definits

3. Esterilització

4. Laboratori de cultius1


2/16

1. Condicions físiques

1.1. Temperatura d’incubació

-Temperatura del cos de l’organisme original

-mamífers: 36,5-37ºC

-aus: 38,5ºC

-poiquiloterms: tº ambient –2ºC

-Millor constància que exactitud Excés morenFred conserva

2


3/16

1.2. pH

-pH fisiològic (7,0 - 7,7; la majoria a 7,4)

-Línies transformades 7,0 - 7,4-Control amb indicador de pH (roig de fenol)

- Problemes

- Acidificació

- Basificació

- Solució

- Cultius tamponats

NaHCO3–CO2 (bicarbonat)

HPO42--H2PO4 (fosfats)

HEPES (tòxic [])3


4/16


-N2 : 78%

-O2: 21%

-CO2:


5/16


Re l a c ió CO 2 i p H

-CO2 regula pH del medi, el CO2 es dissolt en H2O en funció Tº

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- (1)

CO2 atmos no dissolució pH = 7,4

CO2 atmosf dissolució pH

-Per evitar disminució de pH podem afegir tampons (bicarbonat)

NaHCO3 Na+ + HCO3- (2)

NaOH + H2CO3 NaHCO3 + H2O Na+ + HCO3- + H2O (3)

-L'addició de NaHCO3 o NaOH fa augmentar la quantitat de HCO3- il’equació (1) es desplaça a l’esquerra, equilibrant el pH a 7,4

5


6/16

1.4. Pressió osmòtica

1 osmol de solutOsmolaritat= = osmols/litre

1 l. de solvent

1 osmol de solutOsmolalitat= = osmols/Kg

1 Kg. de solvent

osmol: unitat estàndard de pressió osmòtica basada en unaconcentració 1 molal d'un ió en una dissolució.

Cultius: entre 260 - 320 mOsm/Kg

- superior medi hipertònic

- inferior medi hipotònic

6


7/16

1.5. Tipus de substrat

-Cèl·lules en suspensió

-Línies hematopoiètiques, alguns tumors, gàmetes,...-Cèl·lules adherides al substrat

-Majoria

-

Semisòlid col·lagen, agar, gelatina-Sòlid vidre, plàstic

-Cèl·lules en cocultiu

-Amb altres tipus cel·lulars subministren GF, nutrients

Cel epitelitals

Cel epitelialscocultiu

Cel epitelials

cocultiu

Amb matriuSense matriu

Placa doble

7


8/16

1.6. Tipus de flascons

Tubs: sang

8


9/16

2. Condicions biològiques

2 . 1 . Co n s t i t u e n t p r i n c i p a l d e l m e d i

-H2O destil·lada i desionitzada

2 .2 . So l u c io n s s a l i n e s e q u i l i b r a d e s

-H2O + sals inorgàniques-Manteniment cèl·lules màxim 4 h. (transport, manipulació

9


10/16

2 .3 . M e d i s d e f i n i t s

-De més simples (MEM) a molt complexes

-MEM

-M199

-RPMI 1640

-Ham’s F10 i Ham’s F12

10


11/16

2.3.1. Aminoàcids:

- essencials: no síntesi a la cèl·lula

- Cisteina: in vitro no intercanviable per Met- Tirosina: in vitro no transformable de Phe

- Glutamina: font extra carboni i energia

2.3.2. Vitamines:- Grup B, actuen com a cofactors

2.3.3. Sals:

-

Na+

, K+

, Ca2+

, Cl-

: potencial membrana- HCO3

-, PO43-, SO4

2: requeriments matriu, precursors macromolèc,regulació carrega intracel·lular

- Ca2+: adhesió cèl·lules i unions

- HCO3-: tampó de pH, paper nutricional- Fe2+: necessari pels citocroms

- PO43-: síntesi d'ATP

2.3.4. Carbohidrats2.3.5. Suplements orgànics

11

2 3 6 Sè


12/16

2.3.6. Sèrum:- fetal calf serum- new born calf s.- calf serum- horse serum- human cord s.- human serum

12

Inactivació del sèrum


13/16

M ed i s q u ím i cam e n t d e f i n i t s

-Medis sense sèrum

-Només funcionen en alguns tipus cel·lulars

-Addició

-Factors adhesió

-Inhibidors proteases

-Hormones

-GF

-Nutrients

-Proteïnes i poliamides

13


14/16

3. Esterilització

-Tipus de contaminació

-Fongs, bacteris, micoplasmes i virus

-Mètodes d’esterilització

-Forn Pasteur: vidre, plàstic, metall

-Autocalu: vidre, plàstic, metall, sol salines

-Filtració: medis, sol salines, altres líquids

-Raig : plàstics

-Òxid etilé: plàstics

Forn PasteurFiltracióAutoclau

14

ó


15/16

3. EsterilitzacióLloc treball: Cambra de flux vertical o horitzontal

15

b i d l i


16/16

4. Laboratori de cultius

16

02-tècniques de cultiu (i)

Documents