CINTICA ENZIMTICALos principios generales de las reacciones qumicas se aplican tambin a las reacciones enzimticas. Por este motivo, antes de empezar con la cintica qumica, se van a repasar algunosconceptos bsicos de cintica qumica.A continuacin, se describirn los siguientes conceptos: Cintica enzimtica Modelo cintico de Michaelis-Menten Clculo de la KMy la Vmaxde un enzima Actividad enzimtica

CONCEPTOS BSICOS DE CINTICA QUMICA

En una reaccin deorden cero, la velocidad de formacin del producto es independiente de la concentracin de sustrato:v = kEn una reaccin deprimer ordenla velocidad de formacin de los productos es directamente proporcional a la concentracin del sustrato:v = k [A].As, en la reaccin:sacarosa + aguaglucosa + fructosa

La velocidad de hidrlisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentracin de sacarosa. Dicho matemticamente, donde [A] es la concentracin de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que sta es una reaccin de primer orden.Una reaccin desegundo ordenes aquella en la que la velocidad de formacin del producto depende de la concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de condensacin):v = k [A1] [A2] del cuadrado de la concentracin de un nico sustrato (reaccin de dimerizacin):v = k [A]2En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reaccin, y laforma de calcular sus parmetros cinticos.ORDEN CEROPRIMER ORDENSEGUNDO ORDEN

Expresin diferencial de la velocidad

Ecuacin integrada de la velocidad[A] = -kt + [A]0Ln[A] = -kt + Ln[A]0

Vida media (t1/2)

Representacin que da lugar a una recta[A] vs tLn[A] vs t1/[A] vs t

Signo de la pendientenegativonegativopositivo

Significado de la pendiente-k-kk

Significado de la ordenada en el origen[A]0Ln[A]0

[A]0esbeb1/b

CINTICA ENZIMTICA

La cintica enzimticaestudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casosno es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en lascondiciones ptimasde pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamadacurva de avance de la reaccin, o simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin (Figura de la derecha). Para evitar esta complicacin se procede amedir la velocidad inicial de la reaccin(v0). La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que puedaconsiderarse la [S] como esencialmente constantea lo largo del experimento. Adems, en estas condicionesno es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cintica enzimtica se mide elefecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0frente a [S]0obtenemos una grfica como la de la Figura de la derecha.Cuando [S]0es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto,la reaccin es de primer orden.A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto,la reaccin es de orden ceroy la velocidad es mxima (Vmax).

MODELO CINTICO DE MICHAELIS-MENTEN

Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inical del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica.En 1913,Leonor Michaelis(foto de la izquierda)y Maud Menten(foto de la derecha)desarrollaron esta teoray propusieron una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas.

Para explicar la relacin oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurrenen dos etapas: En la primera etapase forma el complejo enzima-sustratoy en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a laformacin del producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2y k3son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre deconstantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que: v1= k1[E] [S] v2= k2[ES] v3= k3[ES]

Se puede distinguir entreenzima libre(E) yenzima unido al sustrato(ES), de forma que laconcentracin total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es:[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1[S] [ES]

Este modelo cintico adopta lahiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3):v1= v2+ v3Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es constante:v = v3= k3[ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que:k1[S] [ET] - k1[S] [ES] = k2[ES] + k3[ES]Despejando [ES], queda que:,siendo, en donde la expresin (k2+k3)/k1se ha sustitudo porKM, oconstante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicacin sobre lasrazones que hacen de la KMun parmetro cintico importante.Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:v = v3= k3[ES] =

Para cualquier reaccin enzimtica, [ET], k3y KMson constantes. Vamos a considerar dos casos extremos: A concentraciones de sustrato pequeas([S] > KM),v = k3[ET]. La velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y por tanto, la reaccin es unproceso cintico de orden cero. Adems, tanto k3como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parmetro, lavelocidad mxima de la reaccin(Vmax): Vmax= k3[ET], que es la velocidad que se alcanzara cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.Si introducimos el parmetro Vmaxen la ecuacin general de la velocidad, (la frmula recuadrada anteriormente), obtenemosla expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con losenzimas alostricos, cuya grfica v frente a [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En lacintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

CLCULO DE LA KMY DE LA VmaxDE UN ENZIMA

La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v0frente a [S]0) es una hiprbola (Figura de la izquierda). La Vmaxcorresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la KMcorresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax.

Para determinar grficamente los valores de KMy Vmaxes ms sencillo utilizar larepresentacin doble recproca(1/v0frente a 1/[S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre derepresentacin de Lineweaver-Burk(Figura de la derecha). Es una recta en la cual: La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0= 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0= 0) es 1/VmaxDe esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de KMy Vmaxde un enzima para diversos sustratos.

ACTIVIDAD ENZIMTICA

Se define launidad de actividad enzimtica(U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml).Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llamakatal(kat). Como 1 mol son 106moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6kat) o el nanokatal (nkat, 10-9kat).Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el nmero de centros activos por molcula de enzima, las medidas de actividad enzimtica permiten calcularel nmero de recambiodel enzima, o sea, el nmero de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

MOTIVOS QUE HACEN DE KMUN PARMETRO CINTICO IMPORTANTE

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico importante pr mltiples razones: KMes laconcentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM= [S], la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2. El valor de KMda idea de la afinidad del enzima por el sustrato:A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que KMse define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si KMes grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KMes pequea, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato). LaKMdel sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KMtiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax. Losvalores de KMde muchos enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.