Relatrio de Bioqumica Cintica Enzimtica

Professoras: Ana Claudia e Ana PaulaAluno: Andr Lucas, Felipe Gorgulho e Marcus RaposoTurma: Bio 231

1.IntroduoAs enzimas so as protenas mais notveis e mais altamente especializadas, possuem um poder cataltico extraordinrio e um alto grau de especificidade para os seus respectivos substratos. Elas aceleram as reaes qumicas e atuam em solues aquosas sob condies suaves de temperatura e pH.As enzimas esto no centro de cada um dos processos bioqumicos. Atuando em sequncias organizadas, elas catalisam cada reao das centenas de etapas que degradam as molculas dos nutrientes, que conservam e transformam energia qumica e que constroem as macromolculas biolgicas a partir de precursores elementares.A cintica enzimtica o ramo da enzimologia que estuda a velocidade das reaes enzimticas, assim como os fatores que influenciam nesta velocidade. Portanto possvel avaliar tal processo com a concentrao de substrato que consumido ou pela concentrao de produto que formado.Uma reao enzimtica simples pode ser escrita como:

E + S ES EP E + POnde E,S e P representam enzima, substrato e produto; ES e EP so complexos transitrios da enzima com o substrato e com o produto.As reaes que so catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de catlise no indica uma resposta linear medida que se aumenta o substrato. Se a velocidade inicial da reao medida sobre uma escala de concentraes de substrato, a velocidade de reao aumenta com o acrscimo de substrato. Todavia, medida que a concentrao de substrato aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor mximo.Essa ideia foi empregada pelos pesquisadores Michaelis e Menten. Eles postularam que a enzima primeiramente se liga ao substrato, uma etapa relativamente rpida, e posteriormente o complexo ES que rompido em uma etapa mais lenta, formando o produto. Mas antes disso, logo que a enzima misturada com um grande excesso de substrato h um perodo inicial, o estado pr-estacionrio, durante o qual a concentrao de ES aumenta, em seguida a reao rapidamente atinge o estado estacionrio no qual a [ES] permanece constante ao longo do tempo at a formao do produto. Os pesquisadores ainda criaram uma equao, que permite demonstrar como a velocidade de uma reao varia com a variao da [S]. Onde Km uma constante denominada constante de Michaelis sendoo valor de Km equivalente a concentrao do substrato necessria para atingir a metade da velocidade mxima da reao. Logo quanto maior o valor de Km menor a afinidade da enzima pelo substrato.Com a equao de Michaelis-Menten possvel transforma-la algebricamente para fazer grficos com dados experimentais

Esta forma da equao denominada equao de Lineweaver-Burk, que possui uma vantagem de permitir uma determinao mais acurada da velocidade mxima que pode ser obtida apenas aproximadamente nos grficos simples.Alm da concentrao de substrato existem outros fatores que alteram a velocidade da reao enzimtica: temperatura, quanto maior a temperatura maior a velocidade da reao, at atingir a temperatura ideal daquela enzima, passando dela o efeito contrario e a velocidade diminui; pH: cada enzima possui um valor de pH ideal para reao, quanto mais prximo dele a velocidade maior e quanto mais distante a reao tende a no acontecer; inibio enzimtica: os inibidores so molculas que interferem com a catlise, diminuindo ou interrompendo as reaes enzimticas podendo ser reversvel ou no.E Ainda existe enzimas reguladoras como a fosfatase alcalina que esta presente no organismo em uma ampla distribuio tecidual que catalisam a hidrlise de steres do cido fosfrico, como o prprio nome diz essa enzima funciona melhor em pH alcalinos e essa enzima retira grupos fosfatos dos substratos como por exemplo ocorrncia de fosfatases durante importantes eventos metablicos como nucleognese, metabolismo do glicognio, sntese de trigliceris e sntese da parede celular bacteriana. De particular importncia o papel das fosfatases no processo de regulao da atividade de outras enzimas, juntamente com as quinases, atravs da chamada modulao covalente da atividade enzimtica.

2.ObjetivoAvaliar a cintica enzimtica da fosfatase alcalina sobre o PNPP nas diferentes condies de pH, temperatura , com presena e sem presena de inibidor.3.Materias Soluo padro de p-nitrofenol(PNP) 0,1 mM em tampo Tris-HCl pH 9,5 Soluo de p-nitro-fenil-fosfato(PNPP) 1 mM em tampo Tris-HCl pH9,5 Solues tampo Tris-HCl 0,2M, pH 7,5 , 8,5 e 9,5 Soluo de Na2HPO4 em tampo Tris-HCl 0,2 M , pH 9,5( sol. Tampo Tris-Pi-HCl) Solues tampo borato-NaOH 0,3 M , pH 9,5 , 10,5 e 11,5 Solues tampo citrato HCl 0,2 M, pH 5,5 , 6,5 e 7,5 Soluo de NaOH 2 M Soluo de enzima: fosfatase alcalina Pipetador automtico 20-200 L Pipetas de 1, 2 e 5 mL Pr-pipetes Tubos de ensaio Vortex Banho de gelo (0C) Banho-maria (25C) Banho-maria (37C) Banho-maria (68C) Cubetas Espectrofotmetro4.Metodos Construo de uma curva padro de PNPCom o auxlio de pipeta e pr-pipete foram aliquotados as solues indicadas para cada tubo de ensaio Tubo nSoluo padro de PNP (mL)Tampo Tris-HCl, pH 9,5 (mL)Soluo de NaOH 2M (mL)

B - 3,2 1,0

1 0,2 3,0 1,0

2 0,4 2,6 1,0

3 0,8 2,4 1,0

4 1,2 2,0 1,0

5 1,6 1,6 1,0

6 1,8 1,4 1,0

Em seguida os tubos foram homogeneizados com auxilio do vortex e posteriormente foi transferido os contedos dos tubos para cubetas e levados para o espectrofotmetro para obter os valores de absorbncia de cada tubo. Influncia do pH Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram aliquotados as solues indicadas para cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH

Tubo nSoluo tampo citratato-HCl (ml)Soluo tampo Tris-HCl (mL)Soluo tampo borato-NaOH (mL)PNPP 1mM(mL)Enzima (mL)NaOH (mL)

pH5,5pH 6,5pH 7,5pH 7,5pH 8,5pH 9,5pH 9,5pH 10,5pH 11,5

B12,01,00,21,0

B22,01,00,21,0

B32,01,00,21,0

12,01,00,21,0

22,01,00,21,0

32,01,00,21,0

42,01,00,21,0

52,01,00,21,0

62,01,00,21,0

72,01,00,21,0

82,01,00,21,0

92,01,00,21,0

Em seguida os tubos so incubados durante 5 minutos em temperatura ambiente, aps esse perodo adicionado a enzima nos tubos com auxilio do pipetador automtico, com intervalos de 1 minuto. Os tubos foram homogeneizados no vortex e novamente incubados em temperatura ambiente, agora por 15 minutos.Aps o perodo de incubao a reao foi paralisada adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 1 minuto, continuando o experimento o contedo dos tubos foram transferidos para cubetas para realizar as a leitura espectrofotomtrica da absorbncia. Influncia da temperaturaCom o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH , em seguida os tubos foram incubados 5 min nas temperaturas indicadas para cada.Tubo nTampo Tris-HCL pH 9,5PNPP 1 mM(mL)Temperatura (C)Enzima(mL)Soluo de NaOH (mL)

1B2,01,040,21,0

12,01,040,21,0

2B2,01,0Ambiente0,21,0

22,01,0Ambiente0,21,0

3B2,01,0370,21,0

32,01,0370,21,0

4B2,01,0680,21,0

42,01,0680,21,0

Aps o perodo de incubao adicionado a enzima nos tubos 1 a 4 em intervalos de 1 minuto e homogeneizado e em seguida novamente incubado durante 15 minutos. Posteriormente a reao interrompida adicionando 1,0 mL de NaOH 2 M aos tubos de 1 a 4 em intervalos de 1 minuto, e posteriormente aos tubos restantes e homogeneizados. Por fim o contedo dos tubos transferido para cubetas para realizar as a leitura espectrofotomtrica da absorbncia. Curso TemporalInicialmente preparado o meio de reao, com auxilio de uma pipeta e pr-pipete, alquotas das solues para um Erlenmeyer de 100 mL como segue a tabela (obs: a enzima s adicionada aps pr-incubar por 5 min em temperatura ambiente) Tampo Tris-HCl 0,2 M pH 9,5 (mL)PNPP 1 mM (mL)Enzima (mL)

20102

Em seguida separado e identificado 9 tubos referentes a cada tempo de reao, neles seram pipetados 1,0 mL de soluo de NaOH 2 M. No Erlenmeyer contendo o meio de reao adicionado a enzima, imediatamente retirado uma alquota de 3,2 mL e colocado no tubo B e iniciada a contagem do tempo. Continuando o experimento retirado alquotas nos tempos indicados na tabela nos tubos tambm indicados. Aps a coleta do ltimo ponto de 45 min realizada a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.Tubo nNaOH 2 M (mL)Tempo de incubaoAlquota do meio de reao (mL)

B1,003,2

11,033,2

21,063,2

31,093,2

41,0123,2

51,0153,2

61,0203,2

71,0303,2

81,0453,2

Curva de substratoCom o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH. Com o auxilio do pipetador automtico adicionado 0,2 mL da soluo de enzima aos tubos em intervalos de 1 minuto e posteriormente incubado em temperatura ambiente por 15 min. Aps esse perodo paralisado a reao adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 1 min. Por fim o contedo dos tubos transferidos para cubetas para realizar a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.Tubo nTampo Tris-HCl pH 9,5PNPP 1 mM (mL)Enzima (mL)Soluo de NaOH (mL)

B2,90,10,21,0

12,90,10,21,0

22,80,20,21,0

32,70,30,21,0

42,60,40,21,0

52,40,60,21,0

62,20,80,21,0

72,01,00,21,0

81,81,20,21,0

91,51,50,21,0

101,21,80,21,0

110,92,10,21,0

120,62,40,21,0

130,32,70,21,0

Influncia do InibidorCom o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH. Com o auxilio do pipetador automtico adicionado 0,2 mL da soluo de enzima aos tubos em intervalos de 1 minuto e homogeneizado e posteriormente incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. Aps esse perodo a reao paralisada adicionando 1,0 mL de NaOH 2,0 M aos tubos em intervalos de 1 minuto. Por fim o contedo dos tubos transferido para cubetas para realizar a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.Tubo nTampo Tris-HCl pH 9,5PNPP 1 nM (mL)Inibidor (mL)Enzima (mL)Soluo de NaOH (mL)

B2,90,100,21,0

12,40,10,50,21,0

22,30,20,50,21,0

32,20,30,50,21,0

42,10,40,50,21,0

51,90,60,50,21,0

61,70,80,50,21,0

71,51,00,50,21,0

81,31,20,50,21,0

91,01,50,50,21,0

100,71,80,50,21,0

110,42,10,50,21,0

120,12,40,50,21,0

1302,70,50,21,0

5.Resultados Curva padro de pnp Como resultado tem-se diferentes valores de absorbncia que foram utilizados para o clculo da concentrao de PNP, como mostrado na tabela. Tais concentraes foram calculadas a partir da frmula de diluio: Ci x Vi = Cf x Vf , tendo em vista que os volumes de NaOH no foram desconsideradas nesses clculos.TuboNmoles de PNPABS. 405nm

B00

10,006250,089

20,01250,177

30,0250,335

40,03750,472

50,050,605

60,056250,653

Influncia do PHO experimento resultou em diferentes nveis de absorbncia como mostrado na tabela:

TuboAbs. 405 nm

B10

B20

B30

10,050

20,165

30,133

40,246

50,468

60,579

70,124

80,073

90,022

Influencia da temperaturaA leitura espectofotomtrica resultou nos seguintes medidas de absorbncia :

TuboAbs 405 nm

1B0

10,256

2B0

20,513

3B0

30,562

4B0

40,226

Curso TemporalAps os diferentes intervalos de incubao, registrou-se as seguintes medidas de absorbncia :

TuboTempo de IncubaoAbs. 405 nm

B00

160,071

290,142

3120,159

4150,209

5200,256

6300,365

7450,535

Curva substrato sem inibidor e com inibidorO experimento sem inibidor e com inibidor resultaram nas seguintes medidas de absorbncia:

Sem inibidorCom inibidor

TuboAbs 405 nmTuboAbs 405 nm

B0B0

10,20010,088

20,26420,170

30,31330,208

40,35340,256

50,42550,308

60,42860,350

70,43270,424

80,45380,469

90,51490,492

100,483100,513

110,445110,471

120,466120,520

130,350130,508

Curva de Michaelis-Mentel

Grfico duplo-recpro

Os valores de Km foram calculados a partir da expresso: ponto de interseo do eixo y= -1/Km. Os valores de Vmx foram calculados a partir da expresso: ponto de interseo do eixo x= 1/Vmx6.DiscussoConsideraes gerais:Nos experimentos realizados, foram utilizados tubos denominados brancos, os quais no houve reao j que a soluo de NaOH foi colocada antes da enzima, para referencial na medioda absorbncia dos outros tubos em que ocorreu reao. Desta forma, garante-se que a absorbncia medida se refere apenas a concentraes de PNP formado.A soluo de NaOH 2M utilizada serviu para parar a reao, j que sua alta concentrao eleva o pH a valores nos quais no ocorre reao. A aplicao desta soluo nos diferentes tubos foi feita com uma diferena de 1 minuto , de forma que tenha ocorrido o mesmo tempo de reao para todos os tubos a partir da aplicao da enzima na soluo.

Construo da curva padro de PNP:A partir dos volumes aliquotados da soluo de PNP e feito a leitura espectofotomtrica, pde-se criar a respectiva curva padro e o fator de calibrao mdio (FCM). A partir destes dados, outros valores de absorbncia encontrados nos outros experimentos puderam ser usados para se calcular a concentrao de PNP na soluo respectiva. Para a construo desta curva, primeiramente foi zerado o valor de absorbncia do tubo B que continha apenas o tampo Tris-HCl e a soluo de NaOH e posteriormente medido os valores dos tubos numerados de 1 a 6 que continham quantidades crescentes de PNP. Desta forma, garante-se que os valores encontrados de absorbncia se referem apenas ao PNP e diminui erros de aferio.Influncia do pH:As enzimas (classe de protenas) possuem uma faixa ideal de pH para realizarem seu funcionamento. Isto por que nesta faixa, a ionizao dos radicais dos resduos de aminocidos gera cargas que estabilizam a molcula em uma conformao tridimensional tima para ocorrer a ao cataltica. De acordo com grfico elaborado, percebe-se que a faixa ideal de pH para a enzima fosfatase alcalina est entre 9,5 , correspondente ao tampo Tris-HCl, j que nesta faixa h maior concentrao de PNP, indicando que houve maior taxa de reao. Nas outras solues tampes utilizadas, Citrato-HCl e Borato-NaOH, as concentraes de PNP formado so baixas, indicando que nas faixas de pH correspondente aos tampes, a enzima tem sua atividade dimuda. Isto ocorre devido a alteraes nas cargas dos grupos dos resduos de aminocidos, principalmente aqueles presentes no stio cataltico, que acabam por alterar a conformidade ideal da molcula, perdendo sua funcionalidade.Influncia da temperatura:Assim como o pH, as enzimas possuem faixas de temperaturas ideiais para seu funcionamento. Isto se explica novamente pela estabilidade ideal da conformidade tridimensional para a atividade cataltica. Nesta estabilidade, participam as interaes fracas entre os resduos de aminocidos, como ligaes de hidrognio e as inicas. Na enzima fosfatase alcalina, segundo o grfico obtido, esta faixa de temperatura corresponde a 37C, j que nesta houve maior taxa de formao de PNP. Este resultado condiz com a literatura, j que a fosfatase participa de vias metablicas humanas. Nas faixas de 0C e 68C, a quantidade de PNP formada foi mais inferior, indicando que nestas faixas de temperatura, as ligaes fracas que estabilizam o enovelamento da enzima se desfizeram, causando sua desnaturao e alterando a funcionalidade cataltica da enzima. Quanto maior a temperatura, maior a energia cintica das molculas, aumentando a velocidade da reao, porm se essa energia for muita alta, pode ocorrer tal desnaturao, assim como ocorre em baixas temperaturas que ocasiona uma maior rigidez da enzima.Curso temporal:A partir dos dados obtidos, pde-se distinguir uma curva que representa a produo de PNP pelo tempo crescente de incubao, ou seja, a velocidade de reao. Percebe-se que os valores de absorbncia e, consequntemente, a concentrao de PNP crescente de acordo com o maior tempo de incubao dos tubos. Isto indica que quanto maior o tempo de reao, maior a quantidade de complexos enzimas-PNPP formados, gerando assim, a partir do stio cataltico o substrato PNP. Pode-se ainda inferir que se a reao no fosse interrompida pela adio de NaOH, obteria-se um valor constante de concentrao de PNP, j que todo PNPP teria sido transformado neste substrato.Velocidade da reao sem inibidor e com inibidor:Pelo experimento feito sem o inibidor, pode-se inferir uma curva com formato que se aproxima a uma hiprbole regular. Esta curva denominada Curva de Michaelis-Mentel, a qual demonstra a velocidade da reao em funo da concentrao de substrato. Esta apresenta um estgio de linearidade que vai at a metade da velocidade mxima e que corresponde a concentrao do substrato igual ao Km. Neste estgio, se estuda a atividade enzimtica. Pela constante de Michaelis (Km), pode ser comparada a afinidade de enzimas por seus respectivos substrato. Com o aumento da concentrao de substrato, a velocidade inicial aumenta cada vez menos at chegar a velocidade mxima, onde os valores do eixo y parecem ser constantes. Neste estgio, a maioria das enzimas est na sua forma complexada com o substrato, atingindo sua saturao. Existem algumas molculas que no so substratos para a enzima, mas que so capazes de se ligar a esta de forma que alteram sua atividade cataltica, modificando seu Km ou Vmx. No caso do experimento realizado com presena do inibidor, tambm foi realizado uma curva de Michaelis-Mentel. Pela anlise comparativa entre as duas curvas (sem e com inibidor) percebe-se que os valores de Km so diferentes, sendo o Km da curva com inibidor maior do que o Km da curva sem inibidor, indicando que houve uma diminuio da afinidade da enzima pelo substrato na presena de inibidor. Percebe-se tambm que com o aumento de concentrao do substrato na curva com inibidor, sua velocidade mxima se encontra com a velocidade mxima da curva sem inibidor. Tais caractersticas indicam que esse inibidor do tipo competitivo reversvel. Tal molcula anloga ao substrato da enzima e se liga no stio ativo desta. Estes dados so melhor visualizados quando estas curvas so convertidos para o grfico de Lineweaver-Menten.Para obteno do grfico de Lineweaver-Mentel, os dados das curvas de Michelis-Mentel foram invertidos. Com as equaes das retas obtidas, percebe-se que os valores de R2 no so 1, logo as retas (sem inibidor e com inibidor)no obtiveram o mesmo valor de interseo do eixo y, mas valores prximos para essa ocorrncia..Essas retas encontram-se no eixo x em pontos diferentes. Esses valores que interceptam o eixo y correspondem ao inverso da Vmx, enquanto os valores que interceptam o eixo x correspondem ao inverso do valor de Km. Tais dados sustentam que o inibidor seja do tipo competitivo reversvel, j que este grfico caracterstico deste tipo de inibidor.

7.Bibliografia Nelson, D.L.; COX, M.M; Princpido de bioqumica de Lehninger. 5 edio. Editora Sarvier,Artmed. So Paulo. 2010