cinética enzimática final

7/17/2019 Cinética Enzimática Final

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Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Ciencias

Biología Molecular de la Célula 1

Practica 6

“Cinética n!im"tica#

Alumnos$

Flores Bonilla %onatanMorales &"nc'e! Ana (orena)ina*ero +errera María %osé)orres ,o*as María Fernanda

-ru.o$ /00

Fec'a de entrega$ &"2ado 3/ de a2ril del 341/

INTRODUCCIÓN.



Enzimas(os en!imas son .roteínas 5ue catali!an reacciones 5uímicas en los seres vivos es decir

sustancias 5ue sin consumirse en una reacción aumentan su velocidad acelerando las reacciones

5ue es.or"dicamente se .roducen7 [Portal de medicina molecular. FIBAO. !!"# [$#

(as en!imas unen su sustrato en el sitio activo o catalítico 5ue suele estar .rotegido del agua .araevitar interacciones no deseadas7 (a en!ima se une al sustrato donde .resenta un estado de

transición 8interacción en!ima sustrato9 : .osteriormente lo ex.ulsa en ;orma de .roducto7 (as

en!imas son mu: selectivas en relación a los sustratos 5ue modi;ican7 Adem"s suelen ser muc'o

m"s grandes 5ue sus sustratos : en muc'as ocasiones re5uieren de la .artici.ación de otras

moléculas m"s .e5ue<as no .oli.e.tídicas como las coen!imas o los iones met"licos llamados

co;actores7

n las reacciones 5uímicas sencillas la trans;ormación de un sustrato en un .roducto suele .asar

.or un estado intermedio llamado estado de transición7 ste estado de transición es mu: inesta2le :

suele necesitar a.orte de energía7 (a velocidad de una reacción 5uímica de.ende de esta energíade activación7 (a en!ima acelera la reacción 5uímica disminu:endo la energía de activación

interaccionando con los elementos 5ue .artici.an en la reacción 5uímica esta2ili!"ndolos en el sitio

activo7 Así aumenta enormemente la .ro2a2ilidad de 5ue se .rodu!ca la reacción 5uímica :a 5ue

concentra : .one en contacto los elementos necesarios .ara la reacción7 [Portal de medicina molecular. FIBAO. !!"# [$#

(os ;actores 5ue in;lu:en so2re la actividad en!im"tica de manera directa son el .+ : la tem.eratura

del medio : los co;actores7 (os co;actores son com.onentes no .roteicos 5ue en ocasiones son

necesarios .ara 5ue la en!ima .ueda reali!ar su ;unción7

(a cinética en!im"tica estudia la velocidad de las reacciones catali!adas .or en!imas7 (a actividaden!im"tica se ve a;ectada .or cam2ios am2ientales .or lo 5ue la medida de velocidad se reali!a en

las condiciones ó.timas de .+ tem.eratura .resencia de co;actores : se utili!an concentraciones

saturantes de sustrato7 n estas condiciones la velocidad de reacción o2servada es la velocidad

m"xima 8=max97 [Casado %ela. !$!# [#

C&lculo de la 'm ( de la %ma) de un enzima

(a re.resentación gr";ica de la ecuación de Mic'aelis>Menten 8v4 ;rente a ?&@49 es una 'i.ér2ola

rectangular7 (a =max corres.onde al valor m"ximo al 5ue tiende la curva ex.erimental : la m

corres.onde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la

=max7

Figura 1. Representación gráfica de la ecuación

Michaeis-Menten.



Poli*enol o)idasa

(as .oli;enol oxidasas son en!imas 5ue catali!an las reacciones de.endientes de oxígeno7 n el

interior de la célula conducen a la ;ormación de .olímeros marrones o negros res.onsa2les de las

.érdidas de ;rutos : vegetales7 [Casado %ela. !$!# [#

(a .resencia de .oli;enol oxidasa se 'a .odido determinar : caracteri!ar utili!ando 'o*as : ;rutos de

numerosas es.ecies vegetales como ;uente en!im"tica7

n te*idos vegetales intactos las .oli;enol oxidasas : sus sustratos ;enólicos .ermanecen en

com.artimentos se.arados cloro.lastos : vacuolas res.ectivamente .or lo 5ue no tiene lugar

ninguna reacción : sirve como mecanismo de de;ensa contra insectos : .atógenos7 (a

desorgani!ación de la integridad de las células sucede como consecuencia de da<os mec"nicos

5ue .rovocan una ru.tura celular : una .uesta en contacto de .oli;enol oxidasa : ;enoles dando

lugar a reacciones de .ardeamiento en!im"tico o2servadas en ;rutos maduros te*idos da<ados :

tam2ién en te*idos a;ectados .or ru.turas7 [Casado %ela. !$!# [#

+IPÓTE,I,

(a cinética en!im"tica estudia la -elocidad de las reacciones catalizadas or enzimas7 n esta

.r"ctica se 'ar" una .re.aración cruda de la .oli;enol oxidasa de tu2érculo de .a.a : siguiendo el

.rocedimiento adecuadamente se .odr" esta2lecer la =max7 : la M 2a*o las condiciones de

ensa:o .or tanto o2tendremos una .r"ctica acertada7

OB/ETI%O

eterminar la =o de una en!ima : el método .ara anali!ar la reacción entre la ?&@ : la =o lo 5ue.ermitir" calcular la M : la =max7

0ATERIA1E, 2 03TODO,

• &e .esaron 47 g de .a.a sin cascara los cuales se colocaron en un tu2o de ensa:o con 1 ml de

amortiguador de ;os;atos a 471 M .osteriormente se mac'acó la .a.a con a:uda de una varilla

de vidrio7

• nmediatamente el extracto se des.ositó en un tu2o e..endor; 5ue se colocó en la centrí;uga

.ara a.licarle un s.in doDn7• l lí5uido 5ue se recolectó se vació en un tu2o Corning al 5ue se le adicionó un 1 m( de

amortiguador con a:uda de una micro.i.eta : de nuevo se vació en el tu2o e..endor;7 &e

centri;ugó .or 04 segundos a 1444 r.mE : seguidamente se reali!ó una disolución de 1$14 con

una micro.i.eta .ara una me*or .recisión7 sta dilución .ermaneció en un vaso de .reci.itado

con 'ielo durante toda la .r"ctica :a 5ue .odría a;ectar la naturale!a de la en!ima7



• Mientras se reali!a2a el extracto de la en!ima se eti5uetaron 6 tu2os de ensa:o : se colocaron

las siguientes cantidades de reactivo de acuerdo a la )a2la 1 .ara este .aso se utili!aron las

micro.i.etas de 1 ml : de 144 (7

)a2la 17 Cantidades de .irogalol : amortiguador corres.ondientes a los tu2os 1>G7

)u2o %mM isolución de

.irogalol

Enzima Bu**er

$ 4 4 04( /444

47/ /4 04( G34

4 47H/ H/ 04( IG/

5 1 144 04( IH4

6 17/ 1/4 04( I34

7 374 344 04( HH4

" 74 44 04( /H4

8 674 644 04( 0H49 1374 1344 04( 0HH4

• &e colocó 'ielo en una 2ande*a de aluminio donde .osteriormente se acomodaron los tu2os :a

.re.arados7 Con los reactivos listos : en 'ielo se .asó a encender el es.ectro;otómetro : se

a*ustó a una longitud de onda de 03/ nm7

• &e utili!ó el tu2o 1 como 2lanco7 Para ello se adicionó 471 ml del extracto de la .a.a al tu2o con

a:uda de una micro.i.eta seguidamente se agitó r".idamente : se vació en una celda7 &e

tomaron mediciones de a2sor2ancia cada 14 segundos .or 3 minutosE donde el tiem.o 4 ;ue

igual a los .rimeros 14 segundos *usto des.ués de 5ue se le agregara el extracto de la .a.a7• ste .rocedimiento se reali!ó con cada uno de los tu2os siguientesE ca2e destacar 5ue des.ués

de cada medición de a2sor2ancia se regresó la solución a los tu2os de ensa:o adem"s de 5ue

el extracto de la en!ima se mantuvo en el vaso de .reci.itado con 'ielo .ara evitar 5ue se

desnaturali!ara7

• (os resultados se .asaron a una 'o*a de xcel donde se .rosiguió a reali!ar las o.eraciones

adecuadas .ara la reali!ación de las gr";icas7

RE,U1TADO,

TUBO TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO " TUBO 8 TUBO 9474/I 474G/ 474/6 474G/ 47// 4734 474H 4711

4764 474G6 4746/ 47113 474/H 47040 47466 471H

47463 474GI 474H 4713/ 474/H 470G 474H3 471/G

4746H 47144 474I0 4710G 474/G 4706H 474H6 4716H

474H4 4714/ 474GI 471/I 47464 4706/ 47I1 471H6



474I0 4714H 4714I 471H1 47461 470H 47II 471I0

474I6 47111 4711H 471I6 47460 4704I 47G3 471II

471H4 4711/ 47130 473 47460 4736/ 47G6 471G/

471H0 4711G 47104 4731/ 4746/ 4731I 47141 47344

471H6 47131 4710H 47304 47466 471HG 4714/ 47346

471HH 4713 471 4733 4746H 4714 4714I 47313471I/ 4713I 471/1 473/ 4746G 474GG 47111 47316

4710 471/6 4736/ 4746G 474H4 4711/ 4733

4711 47H4 474/H 4711G 47304

4710 474// 4713 47300

471 4713H 4730H

47104 4734

47100 473

47106 473H

4710I 473/4

4713 473/0

4710 473/64716 473/G

471/4 47363

471/3 4736/

471/ 4736I

TUBO TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO " TUBO 8 TUBO 9 tiemo

474/I 474G/ 474/6 474G/ 474// 473 474H 4711 4

4746 474G6 4746/ 47113 474/H 47040 47466 471H 1447463 474GI 474H 4713/ 474/H 470G 474H3 471/G 34

4746H 471 474I0 4710G 474/G 4706H 474H6 4716H 04

474H 4714/ 474GI 471/I 4746 4706/ 474I1 471H6 4

474I0 4714H 4714I 471H1 47461 470H 474II 471I0 /4

474I6 47111 4711H 471I6 47460 4704I 474G3 471II 64

471H 4711/ 47130 473 47460 4736/ 474G6 471G/ H4

471H0 4711G 4710 4731/ 4746/ 4731I 47141 473 I4

471H6 47131 4710H 4730 47466 471HG 4714/ 47346 G4

471HH 4713 471 4733 4746H 471 4714I 47313 144

471I/ 4713I 471/1 473/ 4746G 474GG 47111 47316 114



,ECCIÓN $: ;R<FICA, CORRE,PONDIENTE, A 1A, RE;RE,IONE, 1INEA1E,REA1I=ADA,

;r&*ica $: Tu>o $

0

0.05

0.1

0.15

0.2

f(x) = 0.01x + 0.02

Linear ()

;r&*ica : Tu>o

0

0.05

0.1

0.15

f(x) = 0x + 0.09

Linear ()

;r&*ica 4: Tu>o 4

0

0.05

0.1

0.15

0.2

f(x) = 0.01x + 0.05

Linear ()

;r&*ica 5: Tu>o 5



0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

f(x) = 0.01x + 0.08

Linear ()

;r&*ica 6: Tu>o 6

0

0.02

0.04

0.06

0.08

f(x) = 0x + 0.05

Linear ()

;r&*ica 7: Tu>o 7

0

0.050.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

f(x) = - 0.02x + 0.39

Linear ()

;r&*ica ": Tu>o "

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

f(x) = 0.01x + 0.05

Linear ()



;r&*ica 8: Tu>o 8

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.01x + 0.14

Linear ()

;R<FICA 9: UNIÓN DE 1A, ;R<FICA, ANTERIORE,

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

,ECCIÓN : RE1ACIÓN ENTRE CONCENTRACIÓN 2 %E1OCIDAD

m0 0 % inicial47/ 47410 47I/I

47H/ 474403 471G3

1 4744II 47/3I

17/ 47416 47IH6

3 474413 474H3

>4741I/ 1711

6 4744/3 47013



13 47446G 471

nmolJminJmil

17013/

07H/

47G

17/

17II

71

;r&*ica $!: Concentraci?n -s. %elocidad

0.5 0.75 1 1.5 2 4 6 12

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

f(x) = 0.25x + 1.36

mM

mM

Linear (mM)

,ECCIÓN 4: DATO, CORRE;IDO,

m0 0 % inicial47/ 47410 47I/I

47H/ 47416 47G6

17/ 47416 47IH6

4741I/ 1711

;r&*ica $$: Concentraci?n -s. %elocidad @correida



0.5 0.75 1.5 4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = 0.07x + 0.78

mM

mM

Linear (mM)

,ECCIÓN 6: EADIE +OF,TEE

Columna$ Columna Columna4 Columna5mM M = =J&

47/ 47410 47I/I 17H16

47H/ 474403 471G3 473/6

1 4744II 47/3I 47/3I

17/ 47416 47IH6 47/6

3 474413 474H3 47406

>4741I/ 1711 473HH/

6 4744/3 47013 474/313 47446G 471 4740/

;r&*ica $: EADIE +OF,TEE



00.2

0.40.60.8

11.2

f(x) = - 0.02x + 0.63

V/S

V/S

Linear (V/S)

,ECCIÓN 7: 1INEEA%ER 2 +OF,TEE

Columna$ Columna Columna4 Columna5 Columna6mM M = 1J= 1J&

47/ 47410 47I/I 1716// 3

47H/ 474403 471G3 /734I0 1700000000

1 4744II 47/3I 17IG0G 1

17/ 47416 47IH6 1711// 3J0

3 474413 474H3 107IIIII 1J3

>4741I/ 1711 47G44G44G 1J

6 4744/3 47013 0734/13I 1J6

13 47446G 471 371//IG 474I000000

;r&*ica $4: 1ineea-er ( +o*stee



0246810

121416

f(x) = 0.1x + 3.27

1/V

1/V

Linear (1/V)

AN<1I,I, DE RE,U1TADO,

Primeramente como se muestra en la sección 1 de los resultados se reali!aron las gr";icascorres.ondientes .ara cada tu2o considerando los datos de tiem.o : distancia7 e manerasiguiente se les a.licó una regresión lineal .ara o2tener la ecuación de la recta7 A .artir de ello sereali!aron las gr";icas de cada uno de los tu2os con a:uda de los datos de tiem.o : a2sor2anciao2tenidos7

Con 2ase a las ecuaciones de la recta o2tenidas se .uede mencionar 5ue el valor de la .endiente

relaciona a la a2sor2ancia con el tiem.o .ues indica cu"nta a2sor2ancia se .resentar" .orsegundo7 s .or esta ra!ón 5ue los valores de las .endientes los consideramos como unae5uivalencia de la velocidad 8=o9 como se muestra en la ta2la de la segunda sección de resultados7

Para la segunda sección en la 5ue se tiene 5ue reali!ar la gr";ica de Mic'aelis>Menten se tuvo 5uecalcular .rimeramente la concentración de .irogalol en mgJml en cada uno de los tu2osE :.osteriormente convertir esos valores a Milimolar 8Mm97

&in em2argo al reali!ar la gr";ica nos encontramos con 5ue el com.ortamiento de nuestra en!imano se acerca2a al ideal .or así decirloE es .or esto 5ue tuvimos 5ue .roceder a tomar en cuenta sololas .artes m"s rectas de cada una de nuestras gr";icas7 Con lo anterior nos re;erimos a calcular la

.endiente sólo con a5uellos valores continuos en los 5ue la a2sor2ancia ;ue en ascenso con;ormetranscurría el tiem.o7 K tal : como se muestra en la gr";ica 11 el com.ortamiento se acercó m"s ales.erado sin em2argo no ;ue ideal7

Posteriormente se ela2oraron las gr";icas de (ineDeaver BurL : adie +o;stee con las cuales sedeterminaría el valor de la =elocidad m"xima 8=max9 : el de la m 5ue es una constante 5ue indica laa;inidad con la 5ue la en!ima reconoce al sustrato7



CONC1U,IONE,

Mediante ésta .r"ctica se o2servó la actividad de la en!ima .oli;enol oxidasa al reaccionar con un

sustrato 8.irogalol97

&e com.ro2ó tam2ién 5ue a medida 5ue el tiem.o transcurría la cantidad de .roducto ;ormado

aumenta2a :a 5ue al leer la muestra 5ue contenía a la en!ima con el sustrato en eles.ectro;otómetro la a2sor2ancia aumenta2a cada ve!7

Con 2ase en este ex.erimento con;irmamos el 'ec'o de 5ue los tu2os al contener cantidades

di;erentes de sustrato .resentar"n velocidades mu: distintas .ermitiendo concluir 5ue cuanto m"s

sustrato se agregue ma:or ser" la velocidad de reacción7

No o2stante considerando 5ue existe un límite m"ximo del incremento de la velocidad

caracteri!ado .or la cantidad de en!ima .resente 8:a 5ue dic'a cantidad es la misma9 se llegar" a

un .unto en el 5ue la cantidad de sustrato ser" ma:or 5ue la de la en!ima : desem2ocar" en 5ue no

'a:a su;iciente en!ima .ara ;ormar un com.le*o en!ima>sustrato con lo 5ue la velocidad se

incrementar" 'asta alcan!ar una velocidad m"xima : des.ués un valor constante7

REFERENCIA,

?1@ Medicina Molecular FBA7 8344H97 n!ima7 n 'tt.$JJmedmol7es7 ,ecu.erado el 36 de Mar!o

de 341/ de 'tt.$JJmedmol7esJglosarioJHHJ7 •

?3@ Casado =ela %uan7 8341497 Puri;icación : caracteri!ación cinética de la .oli;enol oxidasa de

tomate7 n 'tt.$JJrua7ua7esJds.aceJ7 ,ecu.erado el 36 de Mar!o de 341/ de'tt.$JJrua7ua7esJds.aceJ2itstreamJ144/JGG1GJJCasado34=ela34%uanO07.d;

http://medmol.es/

http://medmol.es/glosario/77/


http://rua.ua.es/dspace/

http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/9919/4/Casado%20Vela,%20Juan_3.pdf


http://rua.ua.es/dspace/

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http://medmol.es/

cinética enzimática final

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