PRACTICA N° I.5.CINÉTICA ENZIMÁTICA

Ing° Doyle Benel Fernández

Biòlog. Ysabel Murrugarra Bringas

Ing° Liliana Quiñones Chapoñán

Ing° Javier Velez Verona

"ACREDITACIÓN: COMPROMISO DE TODOS"

ASIGNATURA: Bioquímica.CICLO : IV – Segundo AñoSEMESTRE: 2015-IIUNIDAD : ISEMANA : 06

CONTENIDO

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1. Motivación2. Objetivos3. Introducción4. Cinética Enzimática5. Parte experimental

Objetivos

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Observar el efecto de los factores que modifican la velocidad de una reacción enzimática.

Calcular el porcentaje de producto formado en cada experiencia.

Elaborar la gráfica: factor que modifica la velocidad de reacción vs porcentaje de producto formado.

INTRODUCCIÓN• En los diversos compartimientos celulares transcurre un gran número de

reacciones químicas que proporcionan a la célula energía y los componentes necesarios para su mantenimiento. La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y específicos.

• Las enzimas son proteínas que funcionan como catalizadores biológicos.• Los factores que afectan la cinética de las reacciones químicas son aplicables a

las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, éstas muestran (además del fenómeno de la especificidad) un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima.

• En nuestra práctica observaremos el efecto de la pepsina sobre la albúmina del huevo. La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez proteica.

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CINÉTICA ENZIMÁTICA

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.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y del comportamiento específico de la enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima.

Las enzimas son proteínas con la capacidad de manipular otras moléculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático.

¿CÓMO SE MANIFIESTA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA?

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La actividad enzimática se manifiesta y se mide por:Desaparición del sustrato.Formación del producto.Modificación del cofactor.

Existen muchos factores que pueden modificar la actividad enzimática como:pH, temperatura, concentración de sustrato, concentración de enzima, tiempo de incubación.

Cuando la actividad enzimática se reporta en función del % de formación de producto se hace uso de la siguiente ecuación:% Formación de producto (FP) = 100 – (Abs tubos/Abs albúmina)*100

Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos después del incubado.

Abs albúmina = Absorbancia de la albúmina (Abs = 0.995)

PARTE EXPERIMENTAL

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EXPERIMENTO.- Efecto del pH

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• Preparar cinco tubos con:• TUBO Nº 1 2 3 4 5 • pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11 • mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 • mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0 • mL CO3Na2 0,0 0,0 0,0 0,5 2,0 • mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0 • Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1%

a 37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolorímetro con filtro azul (420 nm).

EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

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Preparar cinco tubos con: •TUBO Nº 1 2 3 4 5 •mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 •mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 •mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Preparar otros cinco tubos com:•TUBO Nº 6 7 8 9 10 •mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura: •TUBO Nº 1 y 6 2 y 7 3 y 8 4 y 9 5 10 •Temperatura O ºC Amb. 37 ºC 70 ºC 37 ºC 100 ºC •Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.

Elaboración de gráficos:

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Con los resultados obtenidos confeccionar las siguientes graficas, establecer sus conclusiones

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% F

orm

ació

n pr

oduc

to

pH

Experimento: Efecto del pH

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

% F

orm

ació

n pr

oduc

to

Temperatura (ºC)

Experimento: Efecto de la temperatura

EXPERIMENTO. -Efecto de la concentración de la enzima

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Preparar 5 tubos con: •TUBO Nº 1 2 3 4 5 •mL albúmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0 •mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5 •mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5 •mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0

•Incubar los 5 tubos a 37ºC por 5 minutos y enseguida añadir: •TUBO Nº 1 2 3 4 5 •mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1

Incubar por cinco minutos a 37ºC. Observar al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua

EXPERIMENTO.-Efecto de la concentración del sustrato

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• Preparar 6 tubos con: • TUBO Nº 1 2 3 4 5 6 • mL albúmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 • mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 • mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 • mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

• Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37ºC. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37ºC. Leer al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.

Elaboración de gráficos:

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Con los resultados obtenidos confeccionar las siguientes graficas, establecer sus conclusiones

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

% F

orm

ació

n pr

oduc

to

Concentración enzima (mg/mL)

Experimento: Efecto de la concentración de enzima

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

% F

orm

ació

n pr

oduc

toConcentración de sustrato

Experimento: Efecto de la concentración de sustrato

CUESTIONARIO1.-Solo una pequeña fracción de la enzima se une al sustrato ¿Qué función desempeña el resto de la molécula de la enzima?

2.-Enzimas: • a) Si el pH óptimo de una enzima es igual a 7,3,¿qué ocurrirá con la actividad enzimática a pH

3,0 y a pH 9,5? • b) Si la temperatura óptima de una enzima es de 36ºC, ¿Qué ocurrirá a 80ºC? . Justifique las

respuestas.

3.-Indicar que enzima se relaciona con cada una de las siguientes enfermedades. FenilcetonuriaHemofiliaEnfermedad de GaucherGalactosemia

4.-Explique que es un inhibidor enzimático. De 02 ejemplos.

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BIBLIOGRAFÍAMathews, C.K. y Van Holde, K.E. (2008). Bioquímica. 5° Edición. McGraw-Hill.

Interamericana. p 206-209.

Herrera, E.(1999). Biología Molecular y Bioquímica Fisiológica. 3° Edición. McGraw-Hill. Interamericana, p 86-92.

De Robertis EMF, Hib J, Ponzio R. Biología Celular y Molecular. 12ª ed. Buenos Aires. El Ateneo; 2009, p 45-50

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GRACIAS…!!!