Ćelijske kulture

Download ĆELIJSKE KULTURE

Post on 21-Oct-2015

217 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Biologija

TRANSCRIPT

ELIJSKE KULTUREELIJSKE KULTUREUVOD

Kultura elija podrazumijeva odravanje elija u vjetaki kontroliranojsredini koja pogoduje njihovom rastu.

Prvo uspjeno kultiviranje animalnih elija izvrio je Ross Harrison 1907. god., kada je, pokuavajui posmatrati razvoj nervnih vlakana, uspio kultivirati tkivo embriona abe 1-4 sedmice.

ira upotreba ove tehnike poela je kasnih 1940. i ranih 1950. godina.

U ranom periodu tehnike kulture elija uglavnom se radilo o iznalaenjunaina prevazilaenja problema kontaminacije (razvoj antibiotika).

U novije vrijeme, glavno obiljeje razvoja ove tehnike je njena komercijalizacija. Kultivirati se mogu elije, tkiva i organi.ELIJSKE KULTURELABORATORIJ ZA ELIJSKE KULTURE

UVsvjetlost

Ureaj zasterilizaciju

Dezinfekcijska sredstva

Zatitna odjea i rukavice

LaminarELIJSKE KULTURELABORATORIJ ZA ELIJSKE KULTURE

Inkubator

Temperatura: obino 37C za elije sisara Vlanost zraka: spreava isparavanje medija CO2: najee 5%, odravanje pH.ELIJSKE KULTURELABORATORIJ ZA ELIJSKE KULTURE

Mikroskopi

Standardni InverzniELIJSKE KULTURELABORATORIJ ZA ELIJSKE KULTURE

Centrifuge Kontejneri sa tenim azotomELIJSKE KULTUREUSLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJA

Za uspjean rast humanih elijskih kultura neophodno je obezbijeditisljedee uslove:

SterilnostTemperaturaKoncentracija CO2pHAdekvatan sastav i koliina hranjivog medijaPosude za kultivacijuUSLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJASTERILNOST

Mogi mikroorganizmi rastu intenzivnije i bre od humanih elija u kulturi, a veina njih proizvode toksine koji tete kultiviranim elijama i na kraju mogu uzrokovati unitenje kulture.

Kontaminanti elijskih kultura mogu voditi porijeklo iz organizma ije se elije kultiviraju ili iz okolne sredine (obino iz zraka)

Da bi se sprijeio unos kontaminanata, potrebno je pridravati se osnovnih pravila aseptine tehnike koja podrazumijevaju:

Izbjegavanje kontakta sterilnog pribora ili posua, koji dolaze u direktnikontakt s uzorkom, sa nesterilnim priborom i golim rukama

Izbjegavanje kaljanja, kihanja, prianja ili disanja direktno nad sterilnimpriborom koji dolazi u direktni kontakt s uzorkomUSLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJASTERILNOST

Adekvatna upotreba odgovarajue opreme

Rad sa kulturama iskljuivo u laminaru sa protokom sterilnog zraka

Lice koje radi sa kulturama elija mora biti adekvatno odjeveno (mantil,rukavice, maska za lice)

Sterilizacija pribora upotrebom autoklava ili suhog sterilizatora i koritenje plastinog sterilnog materijala za jednokratnu upotrebu.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJASTERILNOST

Smanjenje mogunosti kontaminacije kulture postie se dodavanjemantibiotika u medije.

Antibiotici su komercijalno dostupni i pripremljeni za elijske kulture i obino sadre: penicilin, streptomicin, kanamicin ili gentamicin.

Fungicidi: nistatin i fungizon, obino se dodaju u primarne elijske kulture,da bi se sprijeila infekcija Candidom albicans.

Kontaminacija primarnih elijskih kultura virusima obino je posljedica prisustva virusa u elijama prije biopsije.

Virusne infekcije obino su hronine i ne ubijaju domainske elije u kulturi.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJATEMPERATURA

Optimalna temperatura za humane elijske kulture je 37C.

Blago poveanje temperature poveava stopu umnoavanja elija do odreenog nivoa. Kada se postigne gornji prag, dalje poveanje temperature djeluje inhibitorno na rast elija.

Temperature ispod 37C usporavaju elijski metabolizam i rast kulture. Temperatura u inkubatoru ne smije varirati vie od 0.25C.Vie temperature djeluju tetnije na kulture, od niih. Kratkotrajno izlaganjetemperaturi vioj za 3C od normalne moe dovesti do smrti cijele kulture.

Iste kulture mogu preivjeti kratkotrajna izlaganja temperaturi nioj za 10Cod normalne.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJATEMPERATURA

elijske kulture izvedene iz odreenih tkiva, kao i pojedine elijske linije, mogu zahtijevati neto drugaiju teperaturu za optimalan rast.

Primjer: normalna temperatura testisa je znaajno nia od tjelesne temperature i iznosi 33C, zato je za odvijanje spermatogeneze in vitro potrebno odravati tu temperaturu.

elije insekata, crva i riba npr., zahtijevaju znaajno nie temperaturekultivacije od 37C.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJAPH MEDIJA

Optimalan pH za kutivaciju je 7.0-7.4

Ovaj pH u kulturi se odrava zahvaljujui puferima koje medij sadri ikoncentraciji gasova u inkubatoru.

Uobiajeno je da se za najvei broj elijskih linija u inubatoru odrava mjeavina gasova: 5%CO2 i 95% atmosferski zrak.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJASASTAV I KOLIINA HRANJIVOG MEDIJA

Sastav medija mora biti podeen za odreeni tip elija.

Najee koriteni mediji su RPMI 1640, MEM (minimal essential medium) iangov medij.

Ovi osnovni mediji sadre veliki broj materija koje elije trebaju za uspjean rast u kulturi, kao to su: neorganske soli, aminokiseline i vitamini.

Vano je u medij dodati antibiotike da bi se smanjila mogunost kontaminacije (najee penicilin/streptomicin).

Mediji sadre L-glutamin, a za kulture limfocita periferne krvi neophodan jemitogeni stimulator-fitohemaglutinin.

U kompletnom mediju za elijsku kulturu neophodan je serum (najeeBSA-govei serum albumin).USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJASASTAV I KOLIINA HRANJIVOG MEDIJA

Uloga seruma nije razjanjena ali je dokazano da bez njega elije u kulturi ne mogu preivjeti dugo.

Odravanje pH kompletnog medija obezbjeuje prisustvo puferskih soli.

Primjer sastava medija za kultivaciju epitelnih elija:

200 mL RPMI 1640 (bazalni medij)42.5 mL serum (BSA)2.5 mL L-glutamin5.0 mL otopine penicilina/streptomicinaUSLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJAPOSUDE ZA KULTIVACIJU

U zavisnosti od tipa elija koji se kultivira, potrebe kultiviranja u otvorenom ili zatvorenom sistemu, kao i specifinosti eksperimenta koji se izvodi, bira se adekvatna posuda za kultivaciju.

Preferira se upotreba plastinih sterilnih posuda namijenjenih za jednokratnuupotrebu.

Najee se koriste multiwell ploe, T-flaskovi zapremine 25-75 mL, Petri posude i tube za centrifugiranje sa konusnim dnom, zapremine 15 mL.USLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJAPOSUDE ZA KULTIVACIJUUSLOVI USPOSTAVLJANJA KULTURE ELIJAPOSUDE ZA KULTIVACIJU

Spinner bottles/flasks: staklene boce sa centralnom teflonskom drkom sa magnetom; uzgoj elija u suspenziji

Roller bottles: plastine boce; elije prianjaju za unutranju povrinu bocePOHRANJIVANJE ELIJSKIH KULTURA

elije se pohranjuju zamrzavanjem (krioprezervacija).

Osnovni princip uspjene krioprezervacije je postepeno zamrzavanje i brzo odmrzavanje. Obino se hlaenje obavlja brzinom 1 do 3C po minuti, a otapanje tako to se zamrznute elije stave u vodenu kupelj na 37C.

elije koje su namijenjene za krioprezervaciju moraju biti vijabilne - preko 90%, ne smiju pokazivati znakove mikrobne kontaminacije i moraju biti u log fazi rasta (ne smiju biti konfluentne, tj. ne smiju dostii najveu gustou).Potrebno je da su u visokoj koncentraciji seruma/proteina (obino oko 50%). Koristi se krioprotektant, dimetilsulfoksid (DMSO) ili glicerol, koji tite eliju odstvaranja ledenih kristala. Najee se koristi DMSO koncentracije 10%. Nakonotapanja elija, DMSO se uklanja centrifugiranjem.

elije se mogu na neodreeno vrijeme pohraniti u tenom azotu (135C).PRIMARNE ELIJSKE KULTURE I

SUBKULTIVIRANJE

Kada se iz nekog organizma biopsijom ili hirurki odstrane fragmenti odreenog tkiva, a zatim stave u odgovarajuu vjetaki kontroliranu sredinu za kultiviranje, elije e se vezati za podlogu, dijeliti se i rasti.

Ovo je primarna elijska kultura.

elijska kultura moe se smatrati primarnom do njenog prvog subkultuviranja(pasairanja).

Termin kratkotrajne kulture se koristi za primarne elijske kulture koje se nemogu subkultivirati.

Primarne elijske kulture koje su dobijene od jedne ili nekoliko elija i koje su vezane za podlogu, rastu tako da formiraju koloniju koja se naziva primarnom kolonijom.PRIMARNE ELIJSKE KULTURE

Dvije osnovne metode dobijanja primarnih elijskih kultura su:

Kulture eksplantata mali komadii tkiva se, uronjeni u medij, veu za dno plastine ili staklene posude, a zatim se kroz nekoliko dana pojedinane elije izdvajaju iz tkivnih eksplantata i veu za podlogu posude ili ostaju u mediju (zavisno od tipa elija) gdje poinju da se dijele i rastu.

Enzimska disocijacija raireniji i bri metod koji podrzumijeva disocijaciju tkiva na pojedinane elije proteolitikim enzimima kolagenazom ili tripsinom. Ovim se dobija suspenzija pojedinanih elija koje se zatim stavljaju u posude sa kultivacijskim medijem u inkubator gdje se dijele i rastu.SUBKULTIVIRANJE (PASAIRANJE)

Kada elije u primarnoj kulturi ispune sav raspoloivi prostor (dno posude ili medij) potrebno je premjestiti elije u nove posude sa svjeim medijem. Ovaj postupak oznaen je kao pasairanje.

Odvajanje kultiviranih elija od dna posude postie se kratkotrajnim izlaganjem tripsinu ili veoma njenim struganje specijalnim patulama.

Ostatak elija u suspenziji moe se krioprezervirati uz pomo dimetilsulfoksidaili glicerola na -130C.

Kasnije, po potrebi, odlediti i ponovo kultivirati.SISTEMI ELIJSKIH KULTURA

Dva su osnovna sistema elijskih kultura. Razlika izmeu ovih sistema je zasnovana na sposobnosi elija da se veu za podlogu staklene ili plastine posude.

Sistemi jednoslojnih elijskih kultura

U ovim sistemima kultiviraju se elije koje imaju sposobnost vezanja napodlogu, gdje rastu u jednom sloju.

Jednoslojne kulture se uglavnom odr