AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE

YENİLİKLER

AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE

YENİLİKLER

Yrd.Doç.Dr.Hakan ÖzveriAcıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi

Üroloji Anabilim Dalı

Genetikte Yaşanan Gelişmeler

• “ERA of GENOMICS”

• “GENETİK ÇAĞI”

• Tüm DNA sekanslarının

sistematik olarak çalışılarak

ortaya konulması

• Human Genome Project(HGP)-

İnsan Genom Projesi

• International Hapmap Project

• Encylopedia of DNA Elements

Project(ENCODE)

• 30-35 bin gen (Tahmin 80-140 bindi)

• Normal spermatogenezde görev alan gen sayısı: 2000 ve üzeri

• 1 no’lu kromozom- 2968 gen

• Y Kromozumu- 231 gen

• Gen az ama ürün çeşitliliği inanılmaz!!!(500 bin-1 milyon protein)

Genetikte Yaşanan Gelişmeler

Microarray Teknolojisi

• Gen çipi

• DNA çipi

• Biyoçip

• Ekprese edilen binlerce genin ekspresyon düzeyini aynı anda izlemek için sıralı bir şekilde oluşturulmuş DNA spotları

Microarray Teknolojisi

•Microarray’de onbinlerce spot

•Yüzeye tutturulan DNA segmentleri (20 ile

100 ya da daha fazla nükleotid uzunluğunda

olabilir) probe olarak tanımlı

Microarray Teknolojisi

• Tüm sekanslama girişimlerinde olduğu gibi

microarray kullanımında da amaç

• Bir organizmanın belirli bir

hücresinde,belirli bir zamanda ve belirli

koşullar altında hangi genler ifade

edilmektedir?

Microarray Teknolojisi

Anormal Hücreler Normal Hücreler

RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu

Reverse Transcriptase

İşaretleme

Microarrayde Hibridizasyon

Microarray Teknolojisi-İnfertilite

• Spermiyogramda anomali saptanmayan fertil ve infertil erkeklerde Microarray analizlerinin karşılaştırılması

• Fertil ve infertil erkeklerin Transkriptom’ları arasında

istatistiki fark var. Özellikle erkek gamet formasyonu ve maturasyonu ile ilgili genlerin ekspresyonlarında anlamlı farklar mevcut.

Garrido N ve ark., Fertil Steril; Vol 91, No: 4, Supp Nisan 2009

Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji

Tanı(n=500) %

Varikosel 34.0Obstrüksiyon 26.0Testiküler Yetmezlik 16.4Idiyopatik 26.0Ejakülatuar 2.4Kriptorşidi 3.0ASA 2.0Genetik nedenler 0.5Gonadotoxinler 2.0Infeksiyonlar 1.0Sistemik hastalıklar 0.2Endokrinopati 1.0Travma 1.0

Çoğunluğunda tam gösterilememiş

olsa da GENETİK PATOLOJİ?

HGP ÖncesiHGP Öncesi

Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji

1. Genetik (%15-20)A)Kromozomal Bozukluklar Azoospermi- Normospermi ~%5.8Klinefelter Sendromu (XXY) Azoospermi-Şiddetli Oligospermi ~%4.15Diğer Eşey kromozomal değişik. Azoospermi- Normospermi %0.15Robertsonian Translokasyonlar Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %0.75Resiprokal Translokasyonlar Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi %0.75B)Y Kromozom Delesyonları Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi ~%8.2AZFa Azoospermi-SCOS %0.4AZFb Azoospermi-Spermatogenik Arrest %1.3AZFc Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %2.7AZFb-c SCOS/Spermatogenik Arrest %0.7AZFa-b Azoospermi-SCOS-Şid. Oligospermi %0.1AZFa+b+c Azoospermi-SCOS %0.3Parsiyel AZFc Azoospermi-Normospermi %2.3AZF dışında %0.5C)Gen Mutasyonları %1-6CFTR(CBAVD hastalarında %60-70)Obstrüktif Azoospermi %5AR Azoospermi-Oligospermi %1.7INSL3-LGR8 Kriptorşidizm <%52.Varikosel (%35)3. İdiyopatik (%25)4. Enfeksiyon (%10)5. Endokrin (<%5)6. İmmünolojik (<%5)7. Kanal Obstrüksiyonları(<%5)

İNFERTİLİTEDE GENETİK

9.766 İnfertil Erkek 94.465 Erkek Yenidoğan

Kromozomal Anomali %5.8 %0.38

Seks Kromozomal Anomali %4.2 %0.14

Otozomal Kromozomal Anomali %1.5 %0.25

Johnson MD, Fertil Steril,1998; 70:397

Van Assche E, Hum Reprod, 1996; Dec; 11 Suppl 4:1-24.

İnfertilite - Azoospermi: % 5-20

0102030405060708090

100

Obstrüksiyon Endokrinopati Genetik Testiküleryetmezlik

%

Azoospermi değerlendirmesinde Amaç –

Ürolog gözüyle

Düzeltilebilir patolojilerin saptanması ve tedavisi

İnfertilite ile görülebilen hayatı tehdit edici hastalıkların tanınması ve tedavisi

Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerine gereksinimi azaltmak- maliyetin düşürülmesi

Üremeye yardımcı tedavi yöntemleri ile çocuklara geçebilecek genetik geçişli patolojilerin saptanması ve çiftlerin bilgilendirilmesi

AnamnezFizik muayene

Semen analizi (2x)

Hormonal değerlendirmeGenetik değerlendirme

Radyolojik değerlendirme

TEDAVİ

Azoospermi Değerlendirmesi

Biyopsi/Sitoloji

10

20

AzoospermiEn az 2 semen analizinde, mikroskopik incelemede ejakülatta hiç spermatozoa görülmemesi durumu

GENETİK BOZUKLUKLAR

•Grup I: Kromozoma ait nümerik ya da yapısal anomaliler47 XXYKromozomların yapısal anomalileri(delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon)

•Grup II: Epigenetik Mutasyon ya da kırılma olmaksızın oluşan ve gen ekspresyonunu değiştiren biyokimyasal

DNA modifikasyonları (DNA Metilasyonu, Histon Metilasyonu, Histon asetilasyonu, histon fosforilazyonu, kromatin re-modelling)

•Grup III: Tek gen hastalıkları Kistik Fibrozis

•Grup IV: Poligenik/multifaktöryel genetik hastalıklarEn sık görülen ve insanda infertilitede dahil hastalıkların çoğunluğunda etyolojik faktör

•Grup V: Non-Kromozomal DNA Mutasyonları Mitokondriyal Mutasyonlar

Kromozomal Anomaliler(Nümerik)

Klinefelter Sendromu (47 XXY – Non-mozaik Form)

•1/500-1/1000 canlı doğumda•Azospermide en sık kromozomal neden(%14)•Atrofik testisler ( ~ 5 ml)•Azospermi•Jinekomasti•KS’lu hastaların %80-100’ünde normal haploid sex kromozomu

•Sperm elde etme oranları %27-45Denschlag ve ark., Fertil Steril, 2004

Klasik Triad ?

Klinefelter Sendromu Tanı

1. Periferik kandan karyotip analizi Uzun süre, fazla işgücü, pahalı, Mozaik tipte düşük sensitivite

2. Yanak içi mukozasından Barr Body(Cisimcik) Sitolojisi Ucuz ve sensitif

3. FISH

Pahalı, tecrübeli eleman, software

4. X Kromozomu üzerindeki iki genin metilasyon düzeyleri

arasındaki fark – 5 $Familial Mental Retardation Gene 1 (FMR1) ile

X-Chromosome Inactivating Transcript(XCIT)

5. Quantitative Flourescence PCR-

Multipl genetik patoloji

Kantitatif Floresan PCR(QF-PCR)

• Seks kromozom anomalileri

• Mikrodelesyonlar/Duplikasyonlar

• AR CAG tekrarları

• Bütün kromozomal bozuklukların eş zamanlı saptanabilmesi

Y Kromozom Mikrodelesyonları

• Erkek infertilitesi ile Y Kr.Mikrodelesyon ilişkisi :

1976 Tiepolo ve Zuffardi Y Uzun kolunda AZF bölgesi

Gen bölgesi Aday Gen/genler

AZFa USP9Y, DBY(Dead Box on the Y), UTY

AZFb E1F1AY, RBMY

AZFc DAZ, CDY1, BPY2, PRY

AZFd DYS237

• Oligospermi - %6-8

• Azospermi - %3-15

AZF delesyon tiplerinin dağılımı

AZFb16%

AZFa5%

Non-AZF5%

AZFc60%

Kombi14%

AZFc

AZFb

AZFa

Non-AZF

Kombi

Y-Mikrodelesyonlarında Sperm Elde Etme

SpermKomplet AZFa ya da AZFb

-Kombine AZFa+AZFb+AZFc

-Kombine AZFb+AZFc

-Kombine AZFa+AZFc

-Parsiyel AZFa ve AZFb(Tek ya da kombine) +Parsiyel ya da komplet AZFc

+Kombine parsiyel AZFb+AZFc

+

Y-Mikrodelesyonlarında Testis Histolojisi

HistolojiKomplet AZFa Germ Hücre Aplazisi ya da

SCO

Komplet AZFb Matürasyon arresti(Spermatosit ya da

spermatid evresinde)

Komplet AZFc Şiddetli Hipospermatogenez

Şiddetli Oligospermi

Kombine parsiyel AZFa+AZFb

Miks Histoloji

Kombine parsiyel AZFb+AZFc

SCO ya da matürasyon arresti

Gr/gr Delesyonları

• AZFc bölgesinde segmentler arasındaki Homolog Rekombinasyonlar sonucu

• 21 gen delesyona uğrar

• AZFc’de DAZ geninden 2 kopya, CDY1 den 1 kopya ve çeşitli transkripsiyon ünitelerinden de bazı kısımların delesyonu

AZFc

• AZFc delesyonu olan erkeklerde zamana bağlı olarak sperm üretiminde azalma

Simoni ve ark, Fertil Steril, 1997, 67:542-547

• AZFc delesyonu bilinen erkeklerde Kriyoprezervasyon yapılmalıdır.

Krausz C ve ark, Hum Reprod, 1999, 14:1717-1721

AZF Duplikasyonları

• 4 adet DAZ geni oluşumu ile giden duplikasyonlar

Repping 2003, 2004

• AZFc parsiyel duplikasyonu erkek infertilitesinde bir risk faktörüdür.

Lin ve ark., 2007, Hum Mutat

• Azospermik ve Oligospermik hastalarda DAZ gen sayısında artış

Writz ve ark., 2005, Fertil Steril

Y Kromozom MikrodelesyonlarıKlinik Önemi

•Spermatogenezde ciddi bozulma

•İnfertiliteye neden olan genetik hastalıklar arasında en sık tespit edilen bozukluk

•Yardımla üreme teknikleri Üreme için tek şans

•Sperm elde etmenin mümkün olmadığı durumlar(AZFa, AZFb)

•Erkek çocukta da kalıtsal olarak Mikrodelesyon geçişi

•Genetik bilgilendirme çok önemli!

EPİGENETİK

Epigenetik Modifikasyon

Transkripsiyondaki Rolü

DNA Metilasyonu Gen Baskılanması

Histon Metilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu

Histon Demetilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu

Histon Asetilasyonu Gen aktivasyonu

Histon Deasetilasyonu Gen baskılanması

Histon Fosforilizasyonu Gen aktivasyonu ve baskılanması

Histon Ubiquitylation Gen baskılanması ve aktivasyonu

Histone sumoylation Gen baskılanması

Gen Mutasyonları Kistik fibroz gen mutasyonları

Konjenital bilateral vaz deferens agenezisi İdiyopatik bilateral epididimal obstrüksiyon

Kallman sendromu (KAL-1)Androjen reseptör gen mutasyonuİmmotil silia sendromuPolikistik böbrek hastalığıOrak hücre anemisi ve talasemi

Kistik Fibrozis-CBAVD

• Otozomal resesif geçiş

• 1/2500 sıklık

• Pulmoner ve pankreatik fonksiyon bozukluğu

• 7q31 üzerinde ”Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Geni”

• CVAD’li hastaların %85’inde en az 1 CF gen mutasyonu

• KF’li hastaların >%95 CBAVD nedeni ile infertil

Kistik Fibrozis-CBAVD

• Klinik

– Kronik pulmoner obstrüksiyon ve

enfeksiyonlar

– Pankreatik yetmezlik

– Neonatal mekonyum ileusu

– İnfertilite

Kistik Fibrozis-CBAVD

•Muayene– Epididim gövde ve kuyruğu yok

– Testis, caput epididim palpabl

Kistik Fibrozis Kromozom 7q.31.2>1200 mutasyonEn sık görülen 24 mutasyon

Mutasyon Sıklık% Mutasyon Sıklık% Mutasyon Sıklık%

ΔF508 66 R117H 0 0.3 A455E 0.1

G542X 2.4 R1162X 0.3 S549N 0.1

G551D 1.6 R347 0.2 R560T 0.1

N1303K 1.3 Dl507 0.2 1898+1G®T 0.1

W1282X 1.2 3849+10kbC®T 0.2 2184delA 0.1

R533X 0.7 G85E 0.2 2789+5G®A 0.1

621+1G®T 0.7 1078delT 0.1 3659delC 0.1

1717- G®T 0.6 R334W 0.1 711+1G®T 0.1

Jarvi K, Chan PTK. In: “Reproductive Medicine Secrets”. 2004.Chan PTK. J Male Sex Reprod Health. 2002;2:161-164.

Kistik Fibrozis-CFTR

• CFTR geni non-coding DNA bölgesinde İntron 8’in splicing alanında Polythymidine yolunda varyasyonlar, azalmalar (5T, 7T, 9T)

• 5T azalması Splicingde azalma

CFTR mRNA’da %50 azalma

Matür ve fonksiyonel CFTR proteininde azalma

CFTR-Fertilite

• Sperm kapasitasyonu için hücre içi pH ve Plazma membran hiperpolarizasyonu• Gerekli olan- Ekstraselüler HCO3-• Adenil siklaz aktivasyonu ve CAMP

üretimi• Sonuç- CFTR spermde azalmış

fertilizasyon kapasitesine neden oluyor. Xu MW ve ark, Proc Natl Acad Sci, June

2007

Kistik Fibrozis-CFTR

• İdiyopatik Obstrüktif Azospermide

ve Palpable Vaz Deferens %50 CFTR gen Mutasyonları

• Öneri : CBAVD, CUAVD ve İdiyopatik Obstrüktif Azospermide CFTR taraması (5T)

Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Önemi

• 1 partnerde CFTR mutasyonu var ise diğer partneri tara!

• Erkekte CBAVD var ise kadın partneri tara!

• CBAVD, CUAVD de renal hipoplazi ya da ageneziyi araştır!

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları

• 1/60.000 sıklıkta

• AR’nin olmaması ya da fonksiyonel olarak farklılaşması

• X Kromozomu üzerinde (Xq11-q12)

• 300’den fazla mutasyon

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları

• AR – 8 exon

• Exon 1 – CAG Tekrarı

• Normal bireylerde 17-26 tekrar

• Hasta bireylerde 40-52 tekrar

• Tanı – PCR ile AR CAG tekrar bölgesinin incelenmesi

Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİKHangi hastada hangi test?

Non-obstrüktif azoospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi

Şiddetli oligospermiKaryotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi

CBAVD – obstrüktif azoospermi Kistik Fibrozis taraması– Genişletilmiş panel 5T analizi (Tek ya da çift taraflı vaz deferens

yokluğu tespit edildiğinde)

İnfertilitede genetiğin rolü

• Yanıt bekleyen sorular:• 1-Normal spermatogenezde, sperm maturasyonunda ve

sperm fonksiyonlarında hangi genler rol oynamaktadır?• 2- İnfertiliteye yol açan polimorfizm ya da mutasyonlar

nelerdir, bunları saptayarak hastaları daha iyi tedavi edebilir miyiz?

• 3- Spermatogenez esnasında normal gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir?

• 4- Erkek infertilitesinde anormal mayotik rekombinasyon ya da ayrışma nasıl rol oynar?

• 5- Embriyogenez üzerinde anormal DNA hasarlarının etkisi nedir?

SONUÇ

•Daha ayrıntılı genetik ve moleküler çalışmalara ihtiyaç var

•Yeni metodlar hızlı, tekrarlanabilir ve maliyeti kabul edilebilir olmalı