aula 6nov-metodos alternativos para analise microbiologica.pdf
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Aplicao de mtodos alternativos
para anlise microbiolgica de
alimentos
Profa. Msc. Leila Larisa Medeiros Marques
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Mtodos utilizados em
microbiologia de alimentos
Mtodos tradicionais ou convencionais;
Mtodos rpidos ou alternativos.
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Mtodos tradicionais ou
convencionais
Pouco elaborados;
Trabalhosos;
Demorados;
Muito material de laboratrio;
Requer pessoal treinado;
Sujeito a falhas humanas.
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Mtodos tradicionais ou
convencionais
Sensibilidade insuficiente: capacidade de detectar o que o mtodo prope;
Especificidade: detecta s microrganismos procurados nem sempre ocorre;
Repetitividade: se o operador fizer 50 vezes ele obtm o mesmo resultado - no ocorre;
Reprodutibilidade: gera resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!
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Mtodos convencionais
Foram desenvolvidos h muitos anos e vm sendoempregados como mtodos oficias na maioria doslaboratrios brasileiros e outros pases;
Esses mtodos esto descritos em publicaes consideradasde referncia, internacionalmente aceitas:
-Bacteriological analitical manual (ed. 1992) - (FDA) e (AOAC);
-Compendium of methods for the microbiological examinationof foods (APHA) (ed. 1992);
-Microorganisms in foods (ed. 1978) (ICMSF);
-ISO - International Organization for Standardization;
-IDF - International Dairy Federation.
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Mtodos tradicionais ou
convencionais
1. ANLISE QUANTITATIVA - MTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
A) Contagem de colnias de microrganismos em placas de petri
- Em profundidade " pour - plate"
- Na superfcie do meio
B) Tcnica de contagem por membrana filtrante
C) Tcnica da determinao do nmero mais provvel (NMP)
2. ANLISE QUALITATIVA
-Tcnica de presena/ausncia
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Anlise quantitativa -
mtodos de contagem de
microrganismos
Contagem de colnias de microrganismos em placas
de petri
1-Tcnica de semeadura em superfcie;
2-Tcnica de Pour-Plate ou de profundidade;
3-Tcnica de sobrecamada.
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Vantagem: Rapidez Resultados
em 24 ou 48 Horas?
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Objetivos dos mtodos rpidos
em anlises microbiolgicas
1. Melhorar a eficincia dos laboratrios,
simplificando trabalhos, reduzindo o custo no
geral, aumentando a capacidade analtica;
2. Aumentar confiabilidade dos resultados, pois
no preparado pelo analista, o kit vem pronto;
3.Aumentar a preciso dos resultados.
***Importante: ter um microbiologista treinado
para interpretao
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Mtodos rpidos ou alternativos
1) Automao laboratorial;
2) Mtodos rpidos para avaliar a
qualidade;
3) Mtodos rpidos para avaliar
inocuidade.
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1. Automao industrial
A) Pesagem ("Diluter");
B) Homogeneizao ("stomacher-
homogeneizador de pisto");
C) Semeadura ("Spiral plater");
D) Plaqueamento (uso de meios
cromognicos).
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1.Automao laboratorial
A. Preparo de meios de cultura = masterclave
Bioscan -Dispenser em placas de Petri -750
placas/hora;
B. Pesagem de amostras-por ex: atravs de um
aparelho chamado DILUTER -ajustado que ao
colocar a amostra, pesa a alquota desejada, e j
dilui acrescentando a gua necessria para a
diluio!
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1.Automao laboratorial
C. Homogeneizao - Uso do stomacher -
homogeneizador de pisto no mais os
liquidificadores que cortam as clulas
microbianas injuriando-as na anlise!!!
D. Semeadura - Utilizao de um aparelho
chamado spiral plater - a amostra semeada
na placa, atravs de uma cnula, que verte o
inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.
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2. Mtodos para avaliao da
qualidade
Microrganismos
deteriorantes/Indicadores
Mtodos de contagem-direta e
indireta
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Contagem Direta
1. Membrana filtrante: utilizada para lquidos onde grande
quantidade necessitada para amostra: utilizada em gua,
refrigerantes.
2. Mtodos de contagem fluorognicos: como LST MUG-
baseado na propriedade da E. coli de emitir fluorescncia na
presena deste composto, o indicador procurado, adiciona-se MUG
(u-metil umbeliferil beta-d-glicorondeo) ao caldo da cultura
(presuntivo). O nmero de tubos com gs e fluorescentes aps 24h,
ou 48h, sob luz ultra-violeta visvel, d o nmero mais provvel de
E.coli por grama.
*Meios cromognicos prontos:exploso em 2007
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Contagem direta- Meio
cromognico: gar Rambach
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Contagem direta- Petrifilme
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Contagem direta- Petrifilme
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Contagem direta- Petrifilme: tcnica para anlise
de Escherichia coli
1 2 3
4 5
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Contagem direta- Petrifilme: tcnica para
anlise de Enterobacteriaceae
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Contagem direta- Petrifilme: tcnica para
anlise de bolores e leveduras
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Contagem direta- Petrifilme: tcnica
para anlise de S. aureus
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Petrifilm: cuidados Armazenar os pacotes fechados na geladeira;
Antes de abrir aguardar para que o pacote esteja a temperatura
ambiente;
Depois de aberto deixar a temperatura ambiente por no mximo 30
dias;
No usar placas que estejam laranja ou marrom;
Verificar a data de vencimento;
Para descartar, esterilizar;
Contagem :
Contar placas com mais de 250 colnias;
Contar um ou mais quadros, fazer a mdia e multiplicar por 20;
As colnias podem ser tiradas para identificao;
Congelar a < - 15C at 1 semana.
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Contagem direta: outros mtodos
LST MUG: Colilert; sistemas prontos para
uso (placas de simplate);
placas de Petrifilme - 3 M;
placas de compact dry -Versus- Madasa.
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Contagem indireta
1. Bioluminescncia;
2. Impedncia/Condutncia.
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Contagem indireta: tcnica de
bioluminescncia
Princpio: quantidade de ATP detectada a partir de
clulas metabolicamente ativas (resduos orgnicos,
inclusive microrganismos). Em ambiente de produo,
monitoramento microbiolgico;
Mecanismo: Reao de enzima luciferina-luciferase
(cauda do vaga-lume);
ATP -Reage com a enzima produzindo luz, medida em
um luminmetro.
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Contagem indireta: tcnica de
bioluminescncia Aplicao comum: monitoramento
de higienizao em plantas
processadoras de alimentos;
Equipamentos comercializados
base de bioluminescncia: Lightning e
Hi-Lyte;
Consistem em um swab aplicado a
superfcie a ser checada: introduz
num tubo com os reagentes
necessrios e o coloca no
luminmetro que mede a
intensidade da luz: quanto mais sujo,
+ luz!
Existem vrios fabricantes desse tipo
de equipamento.
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Contagem indireta: tcnica de
bioluminescncia
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Contagem Indireta:
IMPEDNCIA/CONDUTNCI
A
Princpio: microrganismos alteram a corrente eltrica de um meio
de cultura devido s atividades metablicas na multiplicao.
Molculas grandes (protenas, lipdeos) so transformadas em
molculas menores; aminocidos, ac. graxos, etc., que so
quimicamente mais ativas. O acmulo destes compostos produz
alteraes mensurveis.
Ex.: BACTOMETER-Bio Mrieux. A quantidade de microrganismos
presentes definida pela determinao do TEMPO DE
DETECO
Deteco ocorre quando a [ ] atinge 106-107microrg./ml.
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3. Mtodos Rpidos Para
Avaliao De Inocuidade
Kits completos de identificao:
A. BIOQUMICOS
B. IMUNOLGICOS
C. MOLECULARES
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3. Mtodos Rpidos Para
Avaliao De Inocuidade
A. Bioqumicos:
Mtodos que a partir de uma cepa obtida por algum mtodo de
deteco - inoculada em kits -e so observadas para capacidade
de realizar determinadas reaes bioqumicas;
Entram na fase final da anlise objetivo de identificar. Ex: Galerias
API, Bio-Mrieux
Testes complementares de identificao. Ex: Microgen Listeria ID, da
Bioscan.
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3. Mtodos Rpidos Para
Avaliao De Inocuidade
Imunolgicos:
Imunoenzimticos;
Imunocaptura;
Imunoimobilizao;
Coaglutinao.
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: imunoenzimticos
O tipo mais empregado: sandwich;
O patgeno PROCURADO capturado da amostra por
anticorpos adsorvidos superfcie de uma matriz slida (esferas de
polietileno, placas de micro-titulao, papel, etc.);
O complexo antgeno-anticorpo reage com o conjugado, forma
novo anti-corpo especfico p/ o microrganismo em teste. Ligada
enzima cromognica (fosfatase alcalina/peroxidase), o sandwich
reage com o substrato da enzima cromognica e mostra cor: teste
positivo.
Ex. Unique,Vidas -Bio Mrieux-automatizado
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: imunocaptura
Princpio: capacidade dos microrganismos aderirem superfcie de
partculas metlicas revestidas de anticorpos especficos;
Ligando os antgenos bacterianos + anticorpos: o sistema tem um
suporte com m que atrai as partculas metlicas, e o que fica um
concentrado de microrganismos procurados.
Enriquecimento e plaqueamento!
Sorologia: deve ser feita em colnias suspeitas, dando assim
resultado imediato.
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: Imunoimobilizao
Princpio: bactrias mveis cultivadas em meios semi-slidos tem
sua mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares
especficos;
Forma uma banda de precipitao visvel na interface
ANTICORPO/BACTRIA;
Aplicvel a qualquer microrganismo flagelado (mvel);
Ex.Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella.
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: coaglutinao
Conhecido como aglutinao de ltex (passiva reversa);
Uso em toxinas microbianas;
Aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas com
anticorpos anti-toxinas.;
Ex.: RPLA kits_OXOID p/ pesquisa de enterotoxinas
estafiloccicas.
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: mtodos moleculares
Sondas genticas -pouco usadas: Separa
fita de DNA-sonda reage marcador cor
que lida no colormetro;
PCR -Tradicional e automatizado -Ex:
BAX SYSTEM -Dupont-Qualicom-
Patgenos alvo: Salmonella, Listeria
monocytogenes e Listeria sp, Enterobacter
sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Bolores
e Leveduras;
Ribotipagem-Ribotipo-Sofisticao em
anlises -Riboprinter-Dupont-Qualicom-
RG .
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: PCR tradicional
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3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De
Inocuidade: ribotipagem
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Referncias bibliogrficas
FRANCO, B. D. G. M. Mtodos rpidos em microbiologia de
alimentos - Curso Mtodos de Anlise em Microbiologia de
Alimentos -ITAL, 2006.
SILVA, N.; JUNQUEIRA,V. C. A.; SILVEIRA, N.;TANIWAKI, M.H.;
SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de
anlise microbiolgica de alimentos. 3ed. So Paulo: Varela,
2007.