Apuntes deLaboratorio 2

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICODE LAS INFECCIONES

RESPIRATORIAS BACTERIANAS

Horacio LopardoClaudia Hernández

Rolando Soloaga

1999

LABORATORIOS BRITANIA s.a.Los Patos 2175 C.P. (1283)

Buenos Aires - ArgentinaFax 0054-11-4304-1623

Tel.Fax 0054-11-4306-0041email: britania@datamarkets.com.ar

Todos los derechos reservados.Prohibida la reproducción total o parcial sin autorización previa del editor.Registro de la Propiedad Intelectual Nº 744.351

Comité EditorCarlos BantarCarlos A. GuardianoHoracio Lopardo

Editor ResponsableRonaldo J. L. MedaPropietario Lab. Britania s.a.

Diagramación y DiseñoTop Laser S.R.L.

BRITANIA1

INTRODUCCION GENERAL

Dentro de las infecciones que afectan al géne-ro humano, las que ocurren en el tracto respira-torio son las más frecuentes y por ende, las queoriginan el mayor número de consultas médicas.Aún haciendo abstracción de las de origen viral,que escapan al alcance de esta publicación, lasinfecciones respiratorias (IR) constituyen un mo-tivo de frecuente preocupación dentro del equipode salud. En especial, las complicaciones y gas-tos generados por las IR altas y la elevada mor-bimortalidad de las localizadas en el tracto respi-ratorio inferior,son objeto de numerosas publica-ciones en revistas de la especialidad. En este fas-cículo trataremos de describir críticamente losmétodos empleados para realizar el diagnósticomicrobiológico de las IR. Las dificultades , co-mo se sabe, derivan de que las vías aéreas supe-riores, al ser un punto de contacto entre el ser hu-mano y el ambiente exterior, están fuertementecolonizadas con una flora conformada por másde 200 especies. Esto conspira contra una tomade muestra libre de agentes contaminantes, másaún teniendo en cuenta que algunos de los colo-nizantes, en ciertas oportunidades podrían trans-formarse en agentes etiológicos de algunas deestas infecciones. De esta manera, los métodosempleados no dan resultados de certeza, sino quecasi siempre arrojan datos indicadores de mayoro menor probabilidad de que el o los microorga-nismos aislados sean los verdaderos causantes delas IR.

INFECCIONESINFECCIONESRESPIRARESPIRATTORIAS ORIAS ALALTTASAS

El tracto respiratorio superior está conforma-do por la naso y la orofaringe, las que se encuen-

tran conectadas a los senos paranasales y el oídomedio. De este modo, en esta sección considera-remos el diagnóstico microbiológico de las farin-gitis, otitis y sinusitis.

FARINGITIS

Aproximadamente un 70-80% de las farin-goamigdalitis (sindrome inflamatorio faríngeo)son de etiología viral y por su carácter autolimi-tado no requieren normalmente del estudio mi-crobiológico. El 20-30% restante es de origenbacteriano y en su gran mayoría son producidaspor S. pyogenes. También éstas generalmentecuran sin necesidad de tratamiento. Sin embargo,debido a las posibles complicaciones supurativasy no supurativas es esencial su diagnóstico preci-so y su tratamiento. Lamentablemente, exceptoen algunos casos típicos de escarlatina, el diag-nóstico basado sólo en parámetros clínicos no esconfiable y debe recurrirse al estudio microbio-lógico. Habitualmente el objetivo del cultivo deun exudado de fauces es la búsqueda de estrepto-cocos ß-hemolíticos del grupo A. No obstante,los pertenecientes a los grupos C y G de Lance-field (colonia grande) son capaces de producircuadros similares y algunas de las complicacio-nes que origina S. pyogenes. Si bien es aún con-trovertido su rol en la faringitis, la tendencia ac-tual es identificarlos para diferenciarlos de cepasß-hemolíticas de estreptococos del grupo "mille-ri". Estas pueden aglutinar con antisueros C y Gaunque más frecuentemente lo hacen con anti-sueros F. Constituyen además la mayoría de lascepas no serotipificables dentro de los estrepto-cocos ß-hemolíticos y se han detectado muy po-cas cepas que pueden dar aglutinación cruzadacon estreptococos del grupo A. Los estreptoco-cos ß-hemolíticos del grupo "milleri" pertenecen

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS INFECCIONESRESPIRATORIAS BACTERIANAS

Horacio Lopardo: Doctor en Ciencias Bioquímicas. Bioquímico Principal del Laboratorio de Microbiología.Hospital de Pediatría SAMIC " Prof Dr J. P. Garrahan", Buenos Aires. Profesor Titular de Bacteriología Clíni-ca. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata

Claudia Hernández, Bioquímica. Bioquímica Asistente del Laboratorio de Microbiología. Hospital de PediatríaSAMIC " Prof Dr J. P. Garrahan", Buenos Aires

Rolando Soloaga, Bioquímico. Microbiólogo de la Fundación Favaloro, Profesor Pro-titular de la Maestría enMicrobiología Clínica, Universidad Católica Argentina. Profesor Asociado de la Cátedra de Microbiología. Carrera de Medicina. Universidad del Salvador

a la flora habitual de las vías aéreas superiores yhasta el momento no ha sido demostrada su par-ticipación en las faringoamigdalitis.

Otros agentes etiológicos de faringitis pocofrecuentes en nuestros tiempos son Arcanobacte-rium haemolyticum, Corynebacteriun diphte-riae, Neisseria gonorrhoeae, hongos levaduri-formes y la asociación fusoespirilar responsablede la angina de Vincent. En este fascículo sóloconsideraremos al primero de ellos pues losotros microorganismos son responsables de enti-dades clínicas claramente definidas por síntomasy signos y/o por pautas epidemiológicas. De es-te modo la solicitud del estudio queda claramen-te dirigida y representa un abordaje diferente alrutinario por parte del microbiólogo.

No obstante ellos son considerados en los al-goritmos de trabajo. Para mayores precisionessugerimos dirigirse a la bibliografía citada.

1) FARINGITIS ESTREPTOCOCICA

a) TOMA DE MUESTRA: Se coloca la cabe-za del paciente en hiperextensión y se iluminanlas fauces en forma conveniente. Con hisopo es-téril se frotan ambas amígdalas (o ambos pilaresen pacientes amigdalectomizados) . Si existieraun exudado visible se debería tratar de tocarlocon la punta del hisopo. En cualquier caso se de-berá evitar el contacto del hisopo con el paladaro la lengua, es por ello que resulta imprescindi-ble ayudarse con un bajalenguas. El hisopo sedeberá colocar en un tubo con gotas de soluciónfisiológica estéril o con medio de transporte(Cary Blair , Stuart o similar). Como alternativarecomendada sólo ante una emergencia se pue-de conservar seco en un tubo de ensayo estéril.El hisopo seco puede conservar la viabilidad delos estreptococos ß-hemolíticos en un alto por-centaje de casos. La conservación de estas mues-tras se deberá efectuar a temperatura ambientedurante el menor tiempo posible.

b) SIEMBRA: Se utiliza una placa entera deagar tripteína de soya o agar Columbia adiciona-da de 5% de sangre ovina. Si la siembra se reali-za con cuidado, puede utilizarse media placa pa-ra cada muestra. Se frota el hisopo en una super-

ficie de 3 x 2 cm , cercana al borde de la placa.Con el ansa se disemina en forma de tres o cua-tro estrías cruzadas y se realizan otras estrías enprofundidad en la zona cercana al punto desiembra.

c) EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO:Sólo se justifica en casos de diagnóstico presun-tivo de candidiasis orofaríngea, Angina de Vin-cent o difteria. La coloración de Gram en formarutinaria no debe realizarse pues puede llevar aconfusiones.

d) INCUBACION: La incubación debe reali-zarse a 35°C en atmósfera normal. Aparente-mente una incubación en atmósfera enriquecidaen CO2 no aportaría demasiado ni resultaría per-judicial. La incubación debe prolongarse 48 ho-ras en caso de que a las 24 no hubiera desarrollode estreptococos ß-hemolíticos

e) RESULTADOS: El diagnóstico etiológicode la faringitis estreptocócica depende funda-mentalmente de la observación de hemólisis enagar sangre de oveja. Las colonias ß-hemolíticasse estudian independientemente del número deellas presentes en la placa. Las faringitis ya seasintomáticas o subclínicas con frecuencia produ-cen cultivos con recuentos muy altos de estrep-tococos ß-hemolíticos. Lo contrario sucede encultivos faríngeos de portadores sanos. Sin em-bargo, estas apreciaciones no son consistentes,de modo que la cuantificación no permite discri-minar en forma confiable la portación de la in-fección. Se deberá informar entonces sólo lapresencia o la ausencia de estreptococosß-hemolíticos.

f) IDENTIFICACION DE LOS ESTREP-TOCOCOS AISLADOS: Las colonias beta-he-molíticas deben ser identificadas según técnicasconvencionales: coloración de Gram, pruebas decatalasa, bacitracina y PYR. Eventualmente yante casos dudosos (ver esquema) o para trabajosepidemiológicos se puede completar la identifi-cación con pruebas serológicas (látex, coagluti-nación) , Voges-Proskauer, glucuronidasa y fer-mentación de azúcares. (ver tablas 1 y 2).

BRITANIA2

BRITANIA3

TABLA 1

IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS

BAC= bacitracina, PYR= pirrolidonilarilamidasa, VP= Voges-Proskauer, GLU= Glucuronidasa

SEROGRUPO

A

B

C

G

F

No agrupables

ESPECIE

S. pyogenesS. grupo milleri

S. agalactiae

S. dysgalactiae ss. equisimilisS. equi ss. equi

S. equi ss. zooepidemicusS. grupo milleri

S. dysgalactiae ss. equisimilisS. grupo milleri

S. grupo milleri

S. grupo milleri

BAC

SR (s)

R

R (s)R (s)R (s)R (s)

R (s)R (s)

R (s)

R (s)

PYR

+-

-

----

--

-

-

VP

-+

-

---+

-+

+

+

GLU

-+

-

---+

-+

+

+

TABLA 2

IDENTIFICACION DE LOS ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO C (COLONIA GRANDE)

ESPECIE

S. dysgalactiae ss. equisimilisS. equi ss. equi

S. equi ss. zooepidemicus

THEHALOSA

+--

SORBITOL

--+

BRITANIA4

A

Sospecha deAngina de Vincent*

Hisopado de la úlcera

C

Sospecha deDifteria**

Coloraciónde Gram

Coloración de azulde metileno

Cultivo

Observación degránulos

metacromáticos

A/sangre(procesar

como en D)

Agar sangrecon cistinay telurito(ASCT)

Medio deLoeffler

2 hs

18 hs

pase aASCT

Incubar24-48 hs

Coloración deazul de metileno

Pruebasbioquímicas

Prueba detoxigenicidad

(enviar a centrode referencia)

Coloniasnegro-grisáceas

Gram: bacilos gram + pleomórficoscatalasa positivos

Gram yAzul demetileno

Informepreliminar

Extendidos

Bacilos gram +difteromorfos dispuestos

en V, letras chinasy/o empalizada

B

Sospecha deCandidiasis orofaríngea*

Hisopado de losexudados blanquecinos

Extendidos

Coloraciones de Gramy azul de metileno (30 seg.)

Observar la presenciade asociación fusoespirilar

Exámen en frescocon o sin el agregado

de HOK al 20%

Observar la presenciade células levaduriformescon o sin seudomicelios

Cultivo

Agar Sabouraudcon o sin antibióticos

Desarrollo dehongos levaduriformes

Identificación a nivelde especie (ver tratado

de especialidad)

Toma de muestra: tomar parte de laseudomembrana con pinza o instrumento"ad hoc". Si no se pudiera arrancar laseudomembrana, tomar un hisopadofaríngeo y otro nasofaríngeo.Transporte: en solución fisiológica.

Hisopado o muestra de seudomembrana

(sin valor diagnóstico)

GRUPO

A

A

G

G

C

C

B

F

No aglutinable

No aglutinable

VOGES-PROSKAUER

-

+

-

+

-

+

-

+

+

-

RESULTADO

Repetir PYR y BAC

S. milleri (colonia chica)(no significativo)

S. dysgalactiae ss. equisimilis (col.grande)

S. milleri (col. chica) (no significativo)

S. dysgalactiae ss. equi o S. dysgalactiae ss. zooepidemicusS. dysgalactiae ss. equisimilis (col.grande)

S. milleri (col. chica) (no significativo)

S. agalactiae (no significativo)

S. milleri (col. chica) (no significativo)

S. milleri (col. chica) (no significativo)

Enviar a centro de referencia

Algoritmo del procesamiento del exudado de fauces.EVALUACIÓN CLÍNICO/EPIDEMIOLÓGICA

***

BRITANIA5

D

Faringoamigdalitiscon o sin rash cutáneo

Cultivo

E

Sospecha de faringitisgonocócica **

Coloración de Gram

Observar la presenciade diplococos gram

negativos intra o extracelulares(no tiene valor diagnóstico)

Cultivo

A/choc.

72 hs en jarrac/vela o estufa con

10% de CO

TM #o similar

Coloración de gramde las colonias

diplococos gram(-)

Oxidasa

+

Pruebas de oxidaciónde azúcares en medio base

CTA, Nitratos (-) y DNAsa (-)(ver tratados de la especialidad)

Glu+ Mal- Sac- Lac-

ß-hemólisis No ß-hemólisis

Gram

Cocos gram +catalasa -

BacitracinaPYR

++ InformarS. pyógenes

+ -- +

- -• Aglutinar

• Voges-Proskauer***

Repetir

+ + + -- +

- -

Flora orofaríngeahabitual

D A/S de oveja(búsqueda de estreptococos

betahemolíticos)

1 D A/S humana(búsqueda de Arcanobacterium

haemolyticum)

2

2Incubar 48 hs a 35 Cº al aire(1º lectura a las 18-24 hs)

Incubar 72 hs a 35ºC en 5-10% de CO(lecturas periódicas cada 24 hs)

ß-hemólisis

Camp invertida +Arcanobacterium haemolyticum

(confirmar con pruebas bioquímicas;ver tratados de la especialidad)

Coloración de Gram

catalasa

Bacilos Gram positivosdifteromorfos

Cocos Grampositivos

No ß-hemólisis

Flora crofaríngeahabitual

Bacilos Gram +difteromorfos

continuar comoen C o D según el caso

2

2

-

Se descarta

# TM= Thayer Martin.

* No se recomienda efectuar esta búsqueda en forma rutinariadado que al tratarse de microorganismos que son parte de laflora habitual orofaríngea, se corre el riesgo desobrediagnosticar estas enfermedades.

** No se recomienda efectuar esta búsqueda en forma rutinariapor no ser costo-efectiva al tratarse de microorganismosexcepcionalemente encontrados en pacientes sin factores deriesgo o clínica compatible.

PRUEBA DE LA BACITRACINACon las colonias aisladas en el primocultivo

se efectúan estrías superpuestas en tres sentidos,cubriendo una superficie aproximada de un cuar-to de una placa de agar sangre. En el centro deesta superficie se coloca un disco de 0,04 U debacitracina . Se deja incubar 18-24 horas a 35°Cy se observa la formación o no de un halo de in-hibición alrededor del disco.

PRUEBA POSITIVA: producción de un ha-lo de inhibición de cualquier diámetro

PRUEBA NEGATIVA: ausencia de halo deinhibición

PRECAUCIONES:i) Verificar que la cepa produzca beta-hemóli-

sis en sangre ovina. ii) Verificar que se trate de un aislamiento puro. iii) Verificar que los discos contengan 0,04U

pues hay discos con otras concentraciones . iv) Verificar que se logre un desarrollo con-

fluente pues el uso de inóculos bajos puede darlugar a la producción de resultados falsamentepositivos.

PRUEBA DE LA PIRROLIDONILARILAMIDASA (PYR)Sobre un portaobjetos o sobre la tapa de una

placa de Petri se coloca un disco de PYR comer-cial. Se lo humedece y se lo frota con un pali-llo cargado con varias colonias del microorganis-mo a ensayar.

Se le agrega una gota del reactivo revelador,se deja unos 5 minutos y se efectúa la lectura.

PRUEBA NEGATIVA: disco incoloro PRUEBA POSITIVA: disco rojoOtras alternativas pueden encontrarse en la

bibliografía o en los prospectos de los reactivoscomerciales.

g) METODOS RAPIDOS DE DIAGNOSTI-CO DE FARINGITIS POR ESTREPTOCO-COS BETA-HEMOLITICOS DEL GRUPO A

Existen más de 40 productos comercialesdestinados al diagnóstico rápido de la faringitisestreptocócica. Estos equipos emplean técnicasde extracción del antígeno específico de grupo yel posterior revelado por coaglutinación, agluti-nación con partículas de látex o enzimoinmu-noensayo. Los detalles de técnica deberán tomar-se de los prospectos de cada uno de los equipos.

La secuencia de operaciones es:

1) Toma de muestra para cultivo de exudadode fauces.

2) Repetir la toma utilizando uno de los hiso-pos provistos por el equipo. Si el equipo no in-cluyera hisopos deberá disponerse de un hisopode dacrón pues libera mejor los antígenos al me-dio durante la extracción.

3) Extracción del antígeno (habitualmentepor método enzimático).

4) Reacción de aglutinación o enzimoinmu-noensayo.

Si el resultado es positivo: informarSi el resultado es negativo: efectuar un culti-

vo convencional con el primer hisopo e informarde acuerdo a éste.

NOTA: estos métodos resultan de utilidadcuando su sensibilidad es de alrededor del 90% yla comunicación médico-microbiólogo puederealizarse rápidamente

h) PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOSANTIBIOTICOS PARA ESTREPTOCOCOS BE-TA-HEMOLITICOS AISLADOS DE FAUCES

Aún no ha sido detectada la resistencia a pe-nicilina o cefalosporinas de tercera generaciónen S. pyogenes por lo que no se considera nece-sario efectuar rutinariamente ningún tipo de en-sayo que involucre a estas drogas. De todos mo-dos, los puntos de corte para establecer su sensi-bilidad o resistencia fueron contemplados por laNCCLS tanto para difusión como para dilución.Por el contrario, el conocimiento de la sensibili-dad a eritromicina y clindamicina ya es necesa-rio dado que en muchos países y algunas regio-nes de la Argentina los niveles de resistencia amacrólidos se han elevado en forma considera-ble. Por otra parte el uso de nuevos macrólidosha sufrido también un aumento importante. Porello, para el caso de exudados de fauces se reco-mienda efectuar una prueba de sensibilidad dedifusión en agar Mueller Hinton con sangre ovi-na al 5% utilizando discos de clindamicina y eri-tromicina separados 20 mm. De este modo se po-drá apreciar el achatamiento del halo de clinda-micina (mecanismo MLS inducible) o no (meca-nismo de eflujo) cuando la cepa es de sensibili-dad intermedia o resistente a eritromicina y sen-sible a clindamicina. En el primer caso se debe-rá informar como clindamicina resistente y en elsegundo como clindamicina sensible.

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2) BUSQUEDA DE ARCANOBACTERIUMHAEMOLYTICUM

Esta bacteria es un agente reconocido de fa-ringitis y se la aisla frecuentemente de exudadosde fauces de adolescentes sintomáticos. Frecuen-temente se acompaña de rash escarlatiniforme.Es sensible in vitro a la penicilina, pero este an-tibiótico suele fracasar en los tratamientos pro-bablemente debido a la localización intracelularde estos microorganismos . Por ello el antibióti-co de elección es la eritromicina u otro macróli-do. Esta diferencia respecto de S. pyogenes au-menta el interés de su búsqueda en los exudadosde fauces.

Se trata de cocobacilos gram positivos quepueden aparecer arracimados, en V o con ramifi-caciones rudimentarias. Desarrollan producien-

do hemólisis en sangre humana pero no tan evi-dente en sangre ovina. Su crecimiento se produ-ce entre las 24 y 72 horas por lo que se sugiereincubar las placas hasta 3 días a 35°C en atmós-fera con 5-10% de CO2 .

Su identificación se basa en las siguientespautas: dan negativas las pruebas de catalasa,movilidad, gelatinasa, ureasa, xilosa, manitol yesculina; dan positivas las pruebas de fermenta-ción de glucosa y maltosa y las pruebas de re-ducción de nitratos y fermentación de sacarosason variables. La prueba de CAMP se realiza delmismo modo como se efectúa para Streptococ-cus agalatiae. A diferencia de esta bacteria, enlugar de reforzar la hemólisis producida por lacepa ATCC 25923 de S. aureus, la anula.

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BIBLIOGRAFIA

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OTITIS MEDIA AGUDA

La otitis media aguda ( OMA ) se define co-mo un proceso inflamatorio de la mucosa de reves-timiento de las cavidades que constituyen el oídomedio, caja del tímpano, celdas mastoideas ymembrana timpánica.

La patogenia de la OMA es compleja y mul-tifactorial. Las bacterias responsables de la OMAcolonizan primero el epitelio nasofaríngeo y lleganluego al oído medio a través de las trompas de Eus-taquio por aspiración o inyección directa al soplar,estornudar o bostezar. La infección ocurre cuandoel inóculo alcanzado es grande o cuando los meca-nismos de defensa específicos e inespecíficos es-tán alterados.

Diagnóstico microbiológico

1 ) Toma de muestra

La única muestra válida para el estudio mi-crobiológico es la punción del contenido del oídomedio por tímpanocentesis. En este procedimientose realiza una punción aspiración, con aguja, de lamembrana timpánica para obtener material reteni-do en el oído medio. Es realizado por un otorrino-laringólogo o pediatra entrenado. Las indicacionesde tímpanocentesis son:

a- OMA con retención de exudado en niños se-riamente enfermos o con signos y síntomas tóxicos.

b- Respuesta insatisfactoria al tratamientoantibiótico y persistencia del exudado.

c- Otitis media con exudado en pacientes consíndrome meníngeo.

d- Otitis media con exudado con complica-ciones supurativas intrapetrosas o endocraneales.

e- Otitis media con exudado en menores detres meses, en huéspedes inmunocomprometidos yen cualquier caso que se sospeche de un microor-ganismo causal inusual.

Técnica de la tímpanocentesis: el procedi-miento puede ser realizado sin anestesia general,con adecuada inmovilización del paciente, bajo vi-sión con otomicroscopio binocular. El instrumen-tal utilizado ( cánulas de aspiración, espéculos óti-cos , etc. ) debe ser estéril.

1- La piel del conducto auditivo externo pre-senta microorganismos saprófitos como S. aureusy P. aeruginosa, por tal motivo es indispensable lalimpieza del mismo con alcohol al 70 % boricado

a saturación por más de un minuto (el alcohol creaun medio desfavorable para la proliferación bac-teriana y el ácido bórico es bacteriostático paraPseudomonas). Se elimina el mismo mediantesucción.

2- Punción timpánica con aguja Butterfly n°19 a 23, sin alas, adosada a una jeringa de 5 cc. car-gada con 1 cc. de solución fisiológica estéril. Lapunción de la membrana se realiza en el cuadranteposteroinferior ya que es la zona que presenta másdeclive y de esta manera se asegura el drenajecompleto de la caja.

3- Aspiración de la efusión del oído medio.4- Colocación del material en frascos de

transporte adecuado para el cultivo.5- Se envía inmediatamente al laboratorio de

Microbiología. Posteriormente se indican los cuidados loca-

les de todo tímpano que presenta perforación es-pontánea o provocada para evitar contaminaciónpor gérmenes presentes en la piel del conducto.Esto consiste en a ) impedir la entrada de agua contapón de algodón seco con una capa de vaselinasólida por fuera del mismo para impermeabilizar-lo; b ) instilación de alcohol al 70 % boricado a sa-turación varias veces por día para limpieza de lascavidades del oído medio a través de la perforacióny de la piel del conducto.

2 ) Medio de transporte

El material puede ser enviado al laboratorioen la jeringa del procedimiento, en tubo seco oen frascos con atmósfera apropiada como el TAB(transporte anaeróbico) (Laboratorios Britania,Buenos Aires). Los dos primeros tienen el incon-veniente de una mala preservación de los anaero-bios, lo cual es importante en las OMA supura-das y en las OMC (otitis media crónica). El en-vío del material en la jeringa no cumple ademáscon las normas de bioseguridad requeridas parael manipuleo de materiales biológicos. Por ésto,el medio de transporte ideal para este material esel frasco TAB.

3 ) Procesamiento

Al material se le efectúa una coloración deGram y se siembra en agar sangre , agar chocolatey caldo tioglicolato. Se incuba 48 hs. en atmósferacon un 5 % de CO2 (sistema de jarra y vela).

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En el caso de OMA supurada y OMC se de-be agregar medios de cultivo para el aislamiento deanaerobios como placas de agar sangre con vitami-na K y caldo sellado con parafina . En el caso depacientes HIV ( + ) con OMC se deben agregarmedios para el estudio micológico como un tubode agar Sabouraud.

Positividad de los cultivos: La recuperaciónde microorganismos a partir de muestras obtenidaspor timpanocentesis varía según la población in-cluída ( con o sin antibiótico, distintas edades, tipode otitis: aguda, aguda supurada o crónica, tipo dehuésped ) pero en general se encuentran entre un60 – 85 %.

En el Hospital Garrahan en el año 1998 se es-tudiaron 539 punciones de OMA provenientes de444 pacientes y se obtuvieron los siguientes resultados

Pacientes 444______________________________

Positivos 342 77 % ______________________________

Negativos 102 23 %

Cultivos 539______________________________

Positivos 476 70 %______________________________

Negativos 163 30 %

En caso de tratarse de una otitis bilateral sedebe cultivar el material obtenido de ambos oídos,ya que sólo el 64 % tendrán el mismo microorga-nismo. Por ejemplo, en el año 1998 se estudiaron195 pacientes con OMA bilateral.

CULTIVOS______________________________

Pacientes 195______________________________

Iguales 64,6%______________________________

Positivo/Negativo 12,8%______________________________

Positivo/Positivo+otro 15,9%______________________________

Distinto 6,7%

Si bien el tratamiento antibiótico previo in-mediato o simultáneo disminuye la recuperaciónde los cultivos, el porcentaje de positividad en es-tos pacientes justifica su siembra.

Pacientes con ATB.______________________________

Positivos 71.7 %______________________________

Negativos 28,3 %

Pacientes sin ATB.______________________________

Positivos 87.6 %______________________________

Negativos 12.4 %

4 ) Identificación bioquímica

Los principales agentes etiológicos de lasOMA son S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus,M. catarrhalis y estreptococos ß-hemolíticos delgrupo A.

Microorganismos aislados de OMA ( huésped normal )

N° DE CEPAS %______________________________

S. pneumoniae 141 35.4 ______________________________

H. influenzae 194 48.6 ______________________________

M. catarrhalis 25 6.3 ______________________________

S. aureus 24 6______________________________

S. ß hemolítico (grupos A , C y G ) 8 2______________________________

P. aeruginosa 5 1.2______________________________

Candida sp. 2 0.5______________________________

Totales 399 100

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A ) Streptococcus pneumoniae

Los neumococos son diplococos gram posi-tivos que pueden presentar cápsula o estar despro-vistos de ella. Su forma más característica es lan-ceolada aunque también pueden formar cadenascortas o estar aislados. En medios líquidos, la ma-yor parte de las cepas capsuladas presentan un cre-cimiento difuso, mientras que las no capsuladasmuestran un crecimiento granular En agar sangrecrecen presentando α hemólisis. Las cápsulas seobservan cuando las colonias son tratadas con elanticuerpo específico de tipo, el cual, al combinar-se con el polisacárido capsular, lo vuelven refráctil(reacción de Quellung). Los neumococos son gér-menes exigentes que generalmente requieren unmedio enriquecido y una atmósfera de 5 % de CO2para crecer. Se han diferenciado más de 75 tiposserológicos de neumococos, por la existencia depolisacáridos inmunológicamente diferentes ensus cápsulas.

Diagnóstico de laboratorio:

I – Prueba de la optoquina: se usa el discode optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae(sensibles) y otras especies de estreptococosα hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la op-toquina es una medida de la fragilidad de la mem-brana celular bacteriana. La optoquina, que es elclorhidrato de etilhidrocupreína, se utiliza en unadilución acuosa de 1 / 4000 para impregnar los dis-cos, quedando en éstos 5 µg de la droga.

Método: se toma una suspensión de coloniaspuras en caldo Mueller Hinton o tioglicolato y conun hisopo se estría una placa de agar sangre de car-nero al 5 %. Sobre la estría se coloca el disco deoptoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al 5 %( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35° C.

Interpretación: Sensible, cuando hay inhibi-ción alrededor del disco. Se considera como puntode corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (dis-cos de 6 mm). Resistente, cuando el crecimientono es inhibido alrededor del disco. Los casos dehalos intermedios deben resolverse por acumula-ción de pruebas a favor o en contra.

II – Prueba de la solubilidad en bilis: Se uti-liza esta prueba para diferenciar entre S. pneumo-niae, soluble, en bilis y otras especies de estrepto-cocos alfa hemolíticos, “ insolubles ” en bilis. Es-

ta prueba controla la capacidad de las células bac-terianas de producir lisis en presencia de sales bi-liares, en un tiempo y a una temperatura específi-ca. Las sales biliares utilizadas son el desoxicolatode sodio o el taurocolato de sodio. Las sales bilia-res hacen descender la tensión superficial en la in-terfase medio-membrana, provocan una descom-posición de la membrana celular y aceleran el pro-ceso autolítico natural del neumococo activandolas enzimas por combinación de las sales biliarescon el neumococo.

Método: Se prepara 1 ml de una suspensióndensa en solución fisiológica de un cultivo puro.Se divide en dos partes iguales en tubos separados.A uno de ellos se le agregan 0,5 ml de una soluciónde desoxicolato de sodio al 10 % y al otro 0,5 mlde solución fisiológica. Se incuba hasta 3 hs y seobserva cada 15 minutos.

Interpretación: Positiva cuando se observaun aclaramiento del tubo con desoxicolato respec-to al de solución fisiológica. Negativo, cuando nohay diferencia de turbidez entre ambos tubos.

B ) Haemophilus influenzae

Son bacilos pequeños gram negativos, inmó-viles, no esporulados y pleomórficos, anaerobiosfacultativos que producen la energía ya sea poroxidación o por fermentación. Su crecimiento óp-timo se obtiene incubando las placas en atmósferade 5 % de CO2 a 35 – 37 ° C. Son bacterias fasti-diosas y crecen solamente en medios enriquecidos(agar chocolate o agar chocolate suplementado) ocon una fuente exógena de los nutrientes esencia-les (satelitismo alrededor de una estría de S. au-reus). Estos nutrientes esenciales son el factor V(NAD) y el factor X (hemina). Forman coloniaspequeñas, translúcidas y ciertos biotipos presentanun olor característico por producción de indol apartir de triptofano. Estas bacterias pueden poseercápsula (cepas serotipificables a, b, c, d, e, f) o no(cepas no serotipificables).

Diagnóstico de laboratorio

I – Requerimiento de los factores V y X: sebasa en la necesidad de H. influenzae de requerirambos factores para su crecimiento.

Método: con ansa, se prepara una suspensiónde las colonias aisladas en solución fisiológica. Sehisopa una placa de agar tripticasa soja y se colo-

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can tres discos. Uno impregnado en factor V, otroen factor X y el tercero con los dos factores . Se in-cuba a 35-37° C en atmósfera de CO2

Se observa crecimiento alrededor de losdiscos.

Identificación de Haemophilus spp..

ESPECIE PRUEBA________________________________________DEPENDENCIADE FACTORES

X V HEMÓLISIS LACTOSA MANOSA_____________________________________________________

H.influenzae + + - - -H.haemolyticus + + + - -H.parainfluenzae - + - - +H.parahaemolyticus - + + - -H.aphrophilus - - - + +H.paraphrophilus - + - + +H.segnis - + - - -H.ducreyi + - - - -

II ) Prueba de las porfirinas: el ácido deltaamino levulínico es convertido enzimáticamente aporfirinas produciendo una fluorescencia roja. Mi-de la independencia del factor X. La reacción bio-química es la siguiente:

Porfobilinógeno sintetasa

δ amino levulínico---------------porfobilinógeno

uroporfirinógeno uroporfirinógeno sintetasa I decarboxilasa

-------------------uroporfirinógeno-------------------

coproporfirinógeno oxidasa

-coproporfirinógeno-----------protoporfirina IX

ferroquelatasa----------------------hemina

Fe++

Método: se prepara una suspensión bien car-gada en un buffer fosfato 0.1 M ( pH 6.9 ) quecontenga 2 mM de ácido δ aminolevulínico y 0.8mM de MgSO4 . Se incuba 4 horas a 37° C. El tu-bo se ilumina con luz ultravioleta observando unafluorescencia roja (presencia de porfobilinógeno).

Interpretación: la fluorescencia roja indicauna conversión del ácido δ-aminolevulínico a por-

firinas. Eso indica que el microorganismo no re-quiere factor X. A las 24 hs. puede revelarse conreactivo de Kovacs ( rojo en fase acuosa = positivo

presencia de porfirinas) .

C ) Moraxella catarrhalis

Son diplococos gram negativos, oxidasa ycatalasa positivas, inmóviles y no producen espo-ros . Son aeróbicos y su temperatura óptima de cre-cimiento es de 35 a 37 ° C , aunque crece tambiéna menores temperaturas. (28° C). Crecen bien enagar sangre y en agar chocolate, como así tambiénen medios líquidos. No producen oxidación deazúcares en medio CTA y dan positivas las pruebasde reducción de nitratos y DNAsa

Diágnostico de laboratorio

I ) Producción de ácido a partir de carbohi-dratos: determina la capacidad de producir ácido apartir de un hidrato de carbono específico incorpo-rado a un medio base. Utilizando un indicador depH puede determinarse si la bacteria ha degradadoel hidrato de carbono en varios productos termina-les observando un cambio de color.

Los azúcares estudiados son glucosa, malto-sa, sacarosa y lactosa.

Método: El medio base utilizado es el CTA.Se evalúa con una concentración del 1% del carbo-hidrato en el medio base. Se inoculan los tubos yse incuban a 37 ° C.

Interpretación: Una reacción positiva esaquella en la cual se produce un cambio de color(amarillo). Una reacción negativa es aquella en laque el medio permanece rojo rosado .

II ) Reducción de nitratos: determina la ca-pacidad del microorganismo de reducir el nitratoen nitritos.

Método: Se utiliza caldo nitrato que es caldoinfusión cerebro corazón (BHI) al 2.5 % y NO3Kal 0.1 %. A las 24 hs. de incubación a 37 ° C loscaldos inoculados se revelan con 3 gotas del reac-tivo A (ácido sulfanílico (0.8 g), ácido acético gla-ciar (30 ml) y agua destilada (100 ml) y 3 gotas delreactivo B ( dimetil α naftilamina (0.5 g) , ácidoacético glaciar ( 30 ml ) y agua destilada (100 ml).

Interpretación: la aparición de un color rojofuerte vinoso indica una prueba positiva. Si no haydesarrollo de color, es negativa.

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III ) Prueba de la DNAsa: determina la pre-sencia de una enzima capaz de clivar el ADN in-corporado al medio.

Método: se utiliza el medio comercial. Serealiza una estría y se incuba 24 hs. a 37 ° C. Se re-vela con el agregado de ClH 1 N.

Interpretación: es positiva cuando apareceun halo transparente alrededor del crecimientobacteriano. En ausencia de halo se interpreta comonegativa.

Características diferenciales de Neisseria yMoraxella

ESPECIE FORMACIÓN DE ÁCIDO D N___________________G M S L_______________________________________

N.gonorrhoeae + - - - - -N.meningitidis + + - - - -N.lactamica + + + - - -N.cinerea - - - - - -N.subflava + + - v - -N.sicca + + - + - -N.mucosa + + - + - +M.catarrhalis - - - - + +________________________________________D= DNasa. N= NITRATOS. G= Glucosa. M= Maltosa. S= Sacarosa L= Lactosa

D ) Estreptococo ß hemolítico grupo “A”

Ver sección anterior: exudado de fauces

E ) Staphylococcus aureus

Son cocos gram positivos que se disponen enpares, tetradas o racimos. Son microorganismosinmóviles que no forman esporos. Son catalasa po-sitivos y la mayor parte de las cepas fermentan elmanitol, producen pigmento amarillo en medioscon sangre, hemolisina y coagulasa.

Diagnóstico de laboratorio

I ) Prueba de la catalasa: determina la pre-sencia de la enzima catalasa. Esta enzima descom-pone el peróxido de hidrógeno que se forma comoproducto terminal oxidativo de la descomposiciónaeróbica de los azúcares.

Método: con un ansa recoger una colonia deun cultivo puro de 24 hs. y colocarla sobre un por-taobjetos. Agregar una gota de H2O2 al 30 %. Ob-servar la formación inmediata de burbujas.

Interpretación: una prueba positiva corres-ponde a la formación de burbujas bien visibles(formación de O2 ) .

II ) Prueba de la coagulasa: comprueba lafacultad de un microorganismo de coagular elplasma por acción de la coagulasa.

coagulasaPlasma-------------------cóagulo de fibrina

Método: incubar 0.5 ml de cultivo puro conigual volumen de plasma de conejo o humano. Ob-servar a las 4 horas. Si al cabo de ese tiempo nohay coágulo visible, dejar incubando 24 horas.

Interpretación: prueba positiva, se formancoágulos o filamentos de fibrina bien visibles. Lacoagulación puede ser completa o parcial. La prue-ba es negativa si no hay formación de coágulos yla suspensión se mantiene homogénea .

III ) Prueba de la DNAsa :Ver Moraxella catarrhalis .

F ) Otros patógenos

Otros patógenos como Chlamydia pneumo-niae, Mycoplasma pneumoniae u hongos son ex-cepcionales como causa de OMA, Sin embargo, enun estudio reciente Block y colaboradores recupe-raron un 8 % de clamidias de 101 muestras de tím-panocentesis de pacientes con OMA utilizandotécnicas de PCR y cultivo.

Los agentes más controvertidos son los virus.Por lo general, se los acepta como agentes predis-ponentes de la infección bacteriana más que comoagentes etiológicos. Las bacterias anaerobias seconsideran que pueden ser flora de contaminacióny no agentes causales de la OMA. En el HospitalGarrahan no se aislaron anaerobios de 371 mues-tras de OMA con tímpano conservado en 1996.Estas bacterias tienen importancia en las OMA su-puradas y en OMC.

5 ) Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

A ) Streptococcus pneumoniae

Se determina la sensibilidad a la penicilina ,cefotaxima (o ceftriaxona), eritromicina, co-trimo-xazol y opcionalmente a vancomicina, aunque noestén descriptas cepas resistentes a este antibiótico.

& Penicilina

a ) por difusión: I- se utiliza un método de“screening” que emplea discos de oxacilina de 1µg. Se hisopa una placa de agar Mueller Hintonsuplementado con 5 % de sangre de carnero. Secoloca el disco de oxacilina y se incuba 24 horasen atmósfera con 5 % de CO2. Interpretación: Ha-los > ó = a 20 mm ⇒ sensible < ó = a 19 mm⇒ resistente o intermedio

II- E–test: sobre una placa de las mismas ca-racterísticas que en el caso anterior, se coloca unatira reactiva que está impregnada de concentracio-nes crecientes de penicilina. Luego de la incuba-ción se observa la zona de inhibición que tiene for-ma elíptica y se determina la CIM leyendo la líneaen donde esa zona de inhibición intercepta la tirareactiva .

b ) por dilución: se siguen las normas paramicro o macrodilución. Las cepas sensibles tienenuna CIM < ó = a 0.06 µg / ml, las intermedias en-tre 0.12 y 1 µg / ml y las resistentes > ó = a 2 µg /ml.

& Cefotaxima. ceftriaxona y cefuroxima: sedetermina solamente por el método de dilución enlas condiciones antes descriptas para penicilina.(ver normas de NCCLS ). Pueden emplearse tam-bién las tiras de E-test en las mismas placas utili-zadas para penicilina.

& Eritromicina, co-trimoxazol. cloranfeni-col y vancomicina: su sensibilidad está normatiza-da para los métodos de difusión y de dilución enlas condiciones antes descriptas para penicilina. Lasensibilidad y resistencia a azitromicina y claritro-micina pueden ser extrapoladas de los resultadosobservados con eritromicina.

B ) Haemophilus influenzae

Se debe determinar la sensibilidad a ampici-lina, ampicilina – sulbactam , cloranfenicol, co-tri-moxazol, cefuroxima y cefaclor.

No se han detectado aislamientos resistentesa cefotaxima, cefixima, ceftibuten, ceftriaxona , ci-profloxacina ni azitromicina.

La sensibilidad a los distintos antimicrobia-nos puede determinarse por difusión o por diluciónsiguiendo las normas de la NCCLS.

& Ampicilina: además del método de difu-sión se debe realizar una prueba rápida para detec-tar las ß lactamasas. Existen tres pruebas rápidas:La acidimétrica , la iodométrica y la cromogénica.Las dos primeras utilizan un indicador colorimétri-co para detectar la presencia del ácido peniciloicoproducido como consecuencia de la hidrólisis de lapenicilina por las ß lactamasas. El método acidi-métrico usa como sustrato penicilina en un buffercitratado con rojo de fenol como indicador. Unadisminución del pH debido a la presencia de ácidopeniciloico da como resultado un cambio de colordel rojo al amarillo. El sustrato en el método iodo-métrico es penicilina en un buffer fosfatado con elagregado de yodo y almidón. El ácido peniciloicoreduce al yodo e impide que éste se una al almidón(reacción negativa , incolora). Si no se produce lahidrólisis de la penicilina el yodo y el almidón for-man un complejo violáceo. (reacción positiva) . Eltercer método usa nitrocefin que es una cefalospo-rina cromogénica que exhibe un rápido cambio decolor del amarillo al rojo cuando el enlace amidadel anillo beta lactámico es hidrolizado por una be-ta lactamasa. Método: añadir una gota de nitroce-fin a un portaobjetos limpio. Utilizando un ansa es-téril, tomar una colonia de la placa y emulsionarlaen la gota de nitrocefin. El resultado es positivo sise produce el cambio de color a los 30 minutos(hay que proteger el portaobjetos de la desecacióndurante el período de espera). También se puedenusar discos comerciales.

& Cloranfenicol: la resistencia a cloranfeni-col puede ser mediada por una enzima, la cloran-fenicol acetil transferasa. Para detectarla se hisopamedia placa de agar chocolate con una suspensiónde H. influenzae. Se hacen dos estrías, una sobre lamedia placa hisopada y otra sobre la media placa

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no hisopada, con una cepa patrón de S. aureusATCC 25923. En la mitad de dichas estrías se co-loca un disco de cloranfenicol. Se incuba a 37 ° Cdurante 24 horas y se miden los halos de inhibicióndel crecimiento de la cepa de S. aureus alrededorde los discos. Una disminución de dicha zona, enla mitad de la placa hisopada con el aislamiento deH. influenzae, indica destrucción enzimática delantibiótico.

Una prueba similar puede servir para deter-minar por método microbiológico la presencia deß lactamasa. Para ese fin se usa la misma cepa pa-trón de S. aureus y un disco de ampicilina

C ) Moraxella catarrhalis

Para determinar la sensibilidad a penicilina,ampicilina y amoxicilina es suficiente la realiza-ción de una prueba de detección de beta lactama-sa, pero sólo es aceptable el método del nitocefin.M. catarrhalis es sensible a cefalosporinas, ampi-cilina / sulbactam, amoxicilina / clavulánico, imi-penem y eritromicina. Se han detectado cepas re-sistentes a cotrimoxazol por lo que su sensibilidaddeberá determinarse por pruebas de difusión condiscos. Se usa agar Mueller Hinton y se incuba a35 ° C siguiendo las normas del NCCLS .

D ) Streptococcus pyogenesVer sección de exudados de fauces

E ) Staphylococcus aureus

La sensibilidad a los distintos antimicrobia-nos se determina por el método de difusión si-guiendo las normas de NCCLS

OTITIS MEDIA AGUDA SUPURADAY OTITIS MEDIA CRÓNICA

Diagnóstico microbiológico

Se debe cultivar el material obtenido porpunción aspiración del mismo previa limpieza ydesinfección del conducto auditivo externo con al-cohol boricado al 70 %. El material se coloca enmedio de transporte TAB. Además de los mediosutilizados para el material proveniente de OMA,en el caso de OMA supurada se debe agregar me-dios para el aislamiento de bacilos gram negativos

(CLDE) y anaerobios (placas con vitamina K ycaldo anaerobio). En el caso de OMC se deberáagregar también medios para el aislamiento dehongos como agar Sabouraud.

En un estudio realizado en el Hospital Garra-han en el año 1996, se cultivaron 67 materialesprovenientes de oídos con otitis media crónica dehuéspesdes normales. El 97 % de los mismos fue-ron positivos y un 41.5 % de ellos correspondierona flora polimicrobiana. Los principales microorga-nismos fueron Pseudomonas aeruginosa (20.2 %),Proteus spp. (15 %), Staphylococcus aureus(8 %), anaerobios (24 %), otros bacilos gram nega-tivos fermentadores y no fermentadores, Haemop-hilus influenzae (12 %), y en menor proporciónS.pneumoniae y M.catarrhalis. Dentro de losanaerobios, en nuestra experiencia, los más fre-cuentes fueron las especies de Bacteroides del gru-po “fragilis” y los cocos gram positivos (aproxi-madamente 30 % de cada uno). Les siguieron losbacilos gram negativos pigmentados (especial-mente Porphyromonas spp. (13 %), Fusobacte-rium spp. (10 %), Veillonella spp. (9 %), Clostri-dium spp. (8 %), bacilos gram positivos no esporu-lados (7 %) y otros bacilos gram negativos (5 %).

——————————________________________________________________________________________________

HUESPED NORMAL

OMA OMA supurada OMC

Material de tímpanocentesis ( punción )

TAB________________________________________

OMA OMA OMCsupurada

________________________________________Gram + + +________________________________________Agar sangre + + +________________________________________Agar chocolate + + +________________________________________BHI + + +________________________________________CLDE - + +________________________________________Vitamina K - + +________________________________________Caldo anaerobio - + +________________________________________Agar Sabouraud - - +

Otitis externa

Es la infección del conducto auditivo exter-no. Puede ser localizada, difusa, crónica o malig-na. Los gérmenes colonizantes de la piel comoStaphylococcus epidermidis, Staphylococcus au-reus, Corynebacterium spp y en menor propor-ción, anaerobios como Propionibacterium acnes ybacilos gram negativos, principalmente Pseudo-monas aeruginosa, en determinadas ocasiones degran humedad y temperatura pueden invadir la piely producir inflamación y / o supuración.

Otitis externa localizada: se presenta comopústula o forúnculo asociada a folículo piloso. Losgérmenes responsables son Staphylococcus aureusy Streptococcus pyogenes. El tratamiento es local,drenaje y antibióticos sistémicos.

Cultivo: sólo tiene valor el cultivo del mate-rial obtenido por punción del absceso.

Otitis externa difusa: ocurre en ambienteshúmedos y calurosos. La piel del conducto auditi-vo externo se edematiza e inflama. Pseudomonasaeruginosa y otros bacilos gram negativos puedentener un papel patógeno. El tratamiento consiste enuna limpieza de la zona con alcohol boricado a70%.

Cultivo: no se cultivan

Otitis externa crónica: es debida a irritaciónlocal producida por el material purulento prove-niente del oído medio en una otitis crónica supura-da. El tratamiento está dirigido a curar la otitis me-dia.

Cultivo: sólo se debe cultivar el material ob-tenido de oído medio por aspiración transtimpánica.

Otitis externa maligna: es una infección delconducto auditivo externo que se disemina a partesblandas adyacentes, vasos sanguíneos y hueso.Pseudomonas aeruginosa es el patógeno respon-sable. El tratamiento consiste en limpieza del teji-do , instilación de gotas con esteroides y antibióti-cos antipseudomonas locales y sistémicos.

Cultivo: se debe cultivar la secreción y rea-lizar hemocultivos .

SINUSITIS AGUDA

La sinusitis es una afección frecuente quecomplica el 5 % al 10 % de las infecciones deltracto respiratorio superior , y a la cual ningún gru-po de edad es inmune. Resuelve espontáneamenteen más del 40 % de los casos.

El revestimiento mucoso de los senos para-nasales es similar al de la nariz, con el cual se con-tinúa. El epitelio es de tipo cilíndrico con célulascaliciformes , y tiene una cubierta de moco , que esbarrido por las cilias hacia el ostium de cada senoparanasal, y luego a la nasofaringe .La disquinesiaciliar, el edema de la mucosa y las alteraciones enla calidad y cantidad de las secreciones son lascausas fundamentales de la alteración de la fun-ción normal de los senos paranasales. La infecciónviral y la inflamación alérgica de la mucosa son lascausas más frecuentes de la obstrucción fisiológi-ca del ostium. La presión negativa intrasinusal quesucede a la obstrucción del ostium permite la inva-sión bacteriana.

En adultos y adolescentes, los síntomas de si-nusitis incluyen obstrucción nasal, rinorrea, dolorfacial, cefalea y fiebre. En los niños pequeños lossíntomas son menos específicos y se superponencon los del resfrío común.

En los pacientes con infección de las vías aé-reas superiores debe sospecharse sinusitis cuandolos síntomas perduran por más de 10 días.

Diagnóstico clínico

El exámen otorrinolaringológico incluye larinoscopía anterior y la nasofibroscopía, que per-mite visualizar el origen de la rinorrea y descartarcuerpos extraños, alteraciones anatómicas endona-sales y presencia de masas tumorales.

El método convencional para el diagnósticode sinusitis utiliza radiografías planas de los senosparanasales, en planos anteroposterior, lateral, sub-mento - vértice y de Water. La presencia de nivelhidroaéreo o la opacificación total de un seno secorrelaciona con identificación de bacterias en el64 % al 70 %. El engrosamiento de la mucosa de-be correlacionarse con la clínica para diferenciarsinusitis aguda de crónica.

La tomografía computada se indica en aque-llos casos que presentan complicaciones, cuandose sospecha patología tumoral o infecciones espe-cíficas y en los pacientes en los cuales se contem-

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pla la posibilidad de cirugía. Los hallazgos radiológicos y tomográficos

deben ser siempre correlacionados con la clínicaantes de tomar decisiones.

Diagnóstico microbiológico

Las características bacteriológicas de las si-nusitis agudas en niños son similares a las descrip-tas en adultos. Los patógenos de los senos parana-sales son similares en tipo y frecuencia a los halla-dos en otitis media aguda. La mayoría de las infec-ciones son causadas por Strptococcus pneumoniaey Haemophilus influenzae y en menor número porStaphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes yMoraxella catarrhalis. Son escasos los trabajosque muestran la frecuencia de los distintos agentesetiológicos de la sinusitis aguda. Yousimies-Somery cols. en 1988, describieron 339 aislamientos bac-teriológicos de senos paranasales obtenidos porpunción. Los patógenos más frecuentes entre losaerobios son los enunciados más arriba. Entre losanaerobios (2 % del total), los más frecuentemen-te aislados fueron Propionibacterium acnes (dedudoso significado clínico), Peptostreptococcusspp. y Prevotella spp.

El aislamiento de virus es bajo y no está cla-ro si la infección viral precede a la bacteriana o sies una invasión simultánea de ambos organismos.Entre los virus los más frecuentes están Rhinovi-rus, Influenza, Parainfluenza y Adenovirus .

El rol de Chlamydia pneumoniae comoagente etiológico de sinusitis aguda no está biendocumentado aunque se ha aislado de pacientescon esta patología.

En el caso de sinusitis intrahospitalarias, porejemplo las sinusitis asociadas a respirador, tienenimportancia los bacilos gram negativos y anaero-bios. En pacientes inmunosuprimidos se debe in-vestigar la presencia de hongos.

Toma de muestra

El estudio microbiológico debe ser realizadocon material obtenido por punción aspiración delcontenido del seno. Los cultivos obtenidos de lasfosas nasales y nasofaringe no poseen valor pre-dictivo en las sinusitis.

En los casos que se sospeche micosis debeobtenerse, ya sea por vía endoscópica o a cieloabierto, muestra de la mucosa del seno para suestudio.

Punción antral: indicaciones y técnica En los niños es extremadamente rara la nece-

sidad de indicación de punción de los senos para-nasales. Al no haberse completado el desarrollo,los ostium de drenaje no son tan estrechos como enel adulto y evolucionan favorablemente con el tra-tamiento aún en los casos que presentan complica-ciones. Por este motivo se indica punción en adul-tos y niños sólo cuando no hay respuesta al trata-miento médico.

El seno afectado con mayor frecuencia es elmaxilar en el adulto y el etmoidal en el niño.

La punción del seno maxilar se realiza conaguja gruesa o trocar “ad hoc” ya en el meato infe-rior de la fosa nasal, donde la pared interna del se-no es más delgada o en la pared anterior del mis-mo, por arriba de la arcada dentaria.

En las punciones de senos etmoidales y se-nos frontales se utiliza la vía externa, previa inci-sión de piel. También pueden obtenerse muestraspara el estudio bacteriológico por vía endoscópicasiempre y cuando pueda asegurarse la obtencióndel material del interior del seno involucrado, ha-biendo sorteado el ostium.

Medio de transporte y procesamiento

El material obtenido es colocado en frascosTAB y remitido al laboratorio.

La siembra y el procesamiento es igual que elproveniente de oído medio.

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BIBLIOGRAFIA

INFECCIONESINFECCIONESRESPIRARESPIRATTORIAS BORIAS BAJAJASAS

NEUMONIA EXTRAHOSPITALARIA

Es la sexta causa mas común de muerte enUSA y la causa mas frecuente de mortalidad re-lacionada con infección.

El desarrollo de infección pulmonar aguda in-dica un defecto en las defensas del huésped, in-greso de gérmenes particularmente virulentos oinóculos elevados.

Los agentes infecciosos acceden al tracto res-piratorio inferior a través de la aspiración de laflora residente de vías aéreas superiores (S.pneu-moniae, H.influenzae, M.catarrhalis, S.aureus,anaerobios, bacilos gram negativos y S.pyoge-nes), inhalación de micropartículas (M. tubercu-losis, H.capsulatum, P.brasiliensis, C.immitis,C.neoformans, Aspergillus spp, Brucella spp,L.pneumophila, C.psittaci, B.anthracis); conmenor frecuencia puede producirse una siembrahematógena a partir de un foco a distancia (Can-dida spp, S. aureus) o por contiguidad (ej: absce-so subdiafragmático).

Los factores que interfieren con las defensasnormales del huésped son alteración de la con-ciencia, humo de cigarrillo, hipoxemia, acidosis,alcoholismo, inhalaciones tóxicas, edema de pul-món, desnutrición, infecciones virales previas,uremia, obstrucción mecánica, utilización deagentes inmunosupresores (corticoides y drogascitotóxicas), edad avanzada. También puede aso-ciarse con enfermedades de base como diabetes,fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstruc-tiva crónica, enfermedad cardíaca congestiva yenfermedades inmunosupresoras como el SIDA.

Estos datos son fundamentales para orientaral laboratorio de microbiología hacia la búsque-da de determinados agentes, por ejemplo:

Fibrosis quística: P. aeruginosa, S. aureus,H. influenzae y en menor medida B. cepacia yotros bacilos gram negativos.

Infecciones virales previas: S.aureusContacto con aves: C. psittaci.Viajes a áreas endémicas: C. immitis, P. bra-

siliensis, L. pneumophila, F. tularensis.

Riesgo ocupacional y/o contacto con anima-les: C. burnetti, B. anthracis, Brucella spp,Y. pestis.

Antecedente de macroaspiración: anaerobiosEpidemias de influenza: Influenza, S.pneu-

moniae, S.aureus, S.pyogenes, H.influenzae. Condiciones socioeconómicas pobres:

M. tuberculosis.Alcoholismo: S. pneumoniae, anaerobios,

bacilos Gram negativos.Pacientes infectados con HIV: P. carinii,

M. tuberculosis, S. pneumoniae, H. influenzae.EPOC/fumadores: S. pneumoniae, H. in-

fluenzae, M. catarrhalis, Legionella spp.Exposición a murciélagos o materia fecal

de los mismos: H. capsulatum.Exposición a conejos: F. tularensis.

También resulta crítico conocer si la neumo-nía es de adquisición intrahospitalaria o ambula-toria, como así también si el huésped es inmuno-competente o no.

PRESENTACION CLINICA.CLASIFICACION

Si bien sirve como orientación tiene ciertas li-mitaciones y no se puede aplicar en los extremosde la vida ni a pacientes inmunocomprometidos A) Aguda:

I) Típica: S.pneumoniae, H.influenzae, M.ca-tarrhalis, bacilos gram negativos, S. aureus,S. pyogenes.

II) Atípica:IIa) Sin eosinofilia: viral, M.pneumoniae,

C.burnetti, Legionella spp, Chlamydia spp IIb) Con eosinofilia: parasitaria: Ascaris

lumbricoides, Strongyloides stercoralis, Toxo-plasma gondii, Paragonimus westermani; dro-gas; idiopática.B) Crónica: M. tuberculosis y otras micobacte-rias, Nocardia spp, P. pseudomallei, anaerobios,Actinomyces spp, H. capsulatum, P. brasiliensis,C. immitis, B. dermatitidis, Sporothrix schenckii,C. neoformans, E. hystolítica, parásitos y causasno infecciosas (neoplasias, sarcoidosis, vasculi-tis, granulomatosis linfomatoidea, sustanciasquímicas, radiación, neumoconiosis, neumonitispor hipersensibilidad, etc.).

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BRITANIA19

ETIOLOGÍA

En general la incidencia de S. pneumoniae seencuentra en el rango del 15-47%, H. influenzae6-10%, S. aureus 3-22%, M. catarrhalis 5-6%,P. aeruginosa 3-5%, otros bacilos gram negati-vos 4-25%, M. pneumoniae <1-6%, Legionellaspp 12-23%, M. tuberculosis 4-11%, P. carinii3-8%, virus 3-4%, anaerobios 3-8%, estreptoco-cos del grupo viridans y beta hemolíticos 1-2% ycausas desconocidas en 33-49%.

Si bien S. pneumoniae es uno de los principa-les agentes etiológicos en la neumonía de la co-munidad, puede haber ciertas variaciones deacuerdo a la población y el área geográfica con-sideradas.

Actualmente otras causas poco frecuentes deneumonía en nuestro país son B. anthracis (ex-posición a animales o cueros, lanas), Pseudomo-nas pseudomallei (viajes al Asia, Australia),Francisella tularensis (exposición a animales in-fectados o a picaduras de artrópodos en áreas en-démicas), Brucella spp (exposición a animales oaerosoles), Yersinia pestis (exposición a anima-les infectados especialmente gatos), Coxiellaburnetti (exposición a ganado ovino, bovino, ca-prino y sus secreciones), Leptospira spp, (expo-sición a aguas contaminadas o animales infecta-dos) y Hantavirus (exposición a roedores o porcontagio interhumano).

Los pacientes inmunocomprometidos comoaquéllos con tumores sólidos y oncohematológi-cos que reciben quimioterapia, los que recibentratamiento con corticoides y los que tienen in-munodeficiencias adquiridas (como por ejemploSIDA) o congénitas, están mas predispuestos ainfecciones respiratorias que los inmunocompe-tentes.

En estos pacientes la importancia relativa decada tipo de microorganismo depende del tipo deinmunosupresión y del grado de la misma.

RELACION ENTRE TIPO DEINMUNOSUPRESION Y AGENTES

ETIOLOGICOS

- Neutropenia:Bacilos gram negativos: Pseudomonas aeru-

ginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,Enterobacter spp.

Cocos gram positivos: S.aureus, S.epidermi-dis, Enterococcus spp, estreptococos del grupoviridans.

Bacilos gram positivos: Bacillus spp, Clos-tridium spp.

Hongos: Aspergillus spp, Fusarium spp, Zy-gomycetes, Trichosporon beigelii, Candida spp,Torulopsis glabrata.

- Alteración en los linfocitos TBacterias: Mycobacterium spp, Nocardia as-

teroides, Listeria monocytogenes, Salmonellaspp, Legionella spp.

Virus: citomegalovirus, varicela zoster, her-pes simplex, Epstein Barr.

Protozoos: Pneumocystis carinii, Toxoplasmagondii.

Hongos: Cryptococcus neoformans, Histo-plasma capsulatum, Coccidioides immitis.

Helmintos: Strongyloides stercoralis.

- Alteración en los linfocitos BBacterias: S.pneumoniae, H.influenzae

- Alteración en el "clearence" traqueo-bronquial o ruptura mecánica de las barrerasepiteliales

Bacterias y hongos que colonizan el tractorespiratorio.

CRITERIOS DE JERARQUIZACIÓN DEMUESTRAS RESPIRATORIAS

Diagnóstico definitivo:

- Aislamiento de un patógeno bacteriano dehemocultivo, líquido pleural o biopsia de pul-món en el contexto de un cuadro clínico compa-tible con neumonía.

- Aislamiento y/o detección de M. tuberculo-sis, P. carinii, H. capsulatum, C. immitis, P. bra-siliensis, C.pneumoniae, L.pneumophila, C. psit-taci B. dermatitidis, S. stercoralis, T. gondii,virus de influenza virus sincicial respiratorio,Hantavirus, Parainfluenzae, Coxsackievirus yAdenovirus de muestras respiratorias.

- PCR positiva para C. pneumoniae, M. pneu-moniae, L. pneumophila.

- Aumento de 4 veces el título de anticuerpospara M. pneumoniae (Fijación de complemento),L. pneumophila (Inmunofluorescencia indirec-ta), influenza A, B, parainfluenza I, II, III, ade-novirus, C. burnetti.

- Diagnóstico histopatológico compatible,por ej. con citomegalovirus.

Diagnóstico presuntivo

- Coloración de Gram y crecimiento predomi-nante de S. pneumoniae, H. influenzae, M. ca-tarrhalis, S. aureus, S. pyogenes, bacilos gramnegativos, en una muestra de esputo o de lavadobronquial de pacientes sin tratamiento antibióti-co previo y clínica compatible con neumonía.

- Título individual >1/256, antígeno urinariopositivo o coloración fluorescente para L. pneu-mophila.

Factores asociados al bajo diagnóstico mi-crobiológico en neumonías extrahospitalarias

- Antibióticos previos.- Muestras de esputo no representativas

(>50%).- Bajo rendimiento del hemocultivo (20-30%

en neumonías del adulto por S. pneumoniae y12-15% en pediatría).

- Valor nulo del esputo para aislamiento deanaerobios en la neumonía aspirativa.

- Detección de antígenos capsulares es inespe-cífica en muestras de esputo de pacientes con

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MUESTRAS PARA EL DIAGNOSTICO DE NEUMONIA EXTRAHOSPITALARIA

Examen directo y cultivo

Cultivo Detección deantígenos

Detección deanticuerpos

Esputo;Lavado bronquial

Líquido pleural

Punción transtraqueal ypunción pulmonarpercutánea

Cepillo protegido y/olavado broncoalveolar

Biopsia de pulmón

Hemocultivo Suero, orina y líquido pleural para detección de antígenocapsular de S. pneumoniae y H. influenzae.Orina para detección deantígeno de Legionellapneumophila serogrupo 1

Suero para Chlamydia spp,Mycoplasma spp,C. burnetti,Legionella pneumophila

Tabla 1

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EPOC, bronquitis crónica altamente colonizados.- Baja sensibilidad de coloraciones fluores-

centes en esputo para Legionella spp.- Muestras invasivas exponen al paciente a

riesgos adicionales y no estan disponibles en to-dos los hospitales.

ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL

Utilidad del cultivo de esputo y del lavadobronquial

- Neumonía extrahospitalaria.- Adultos o niños mayores que pueden expec-

torar.- Pacientes sin tratamiento antibiótico previo- Pacientes con fibrosis quística.- Pacientes con exacerbaciones agudas de la

bronquitis crónica.- Búsqueda de M. tuberculosis, Legionella

spp, H. capsulatum, C. immitis, P. brasiliensis,C. pneumoniae (patógenos indudables).

- Aislamiento de S. pneumoniae, M. catarrha-lis, H. influenzae, S. aureus, S. pyogenes, bacilosgram negativos, M. pneumoniae deben ser anali-zados en el contexto de los datos clínicos, radio-logía, exámen citológico y predominio de flora.

Rendimiento del cultivo de esputo

Aproximadamente 60-70% en personas conneumonía y sin tratamiento antibiótico previo y30-40% en personas con tratamiento antibióticoprevio.

Procesamiento del esputo

Debe procesarse dentro de los 30’-2 horas derecogido o conservarse a 4ºC para evitar el so-brecrecimiento de la flora acompañante.

Es conveniente seleccionar las porciones pu-rulentas, evitando tocar las partes salivosas, Parafacilitar ésto puede volcarse la muestra en unaplaca de Petri vacía.

Exámen directo

- Fresco: Observación de filamentos (Asper-gillus spp, Mucorales), levaduras multibrotadas(P. brasiliensis), esférulas (C. immitis).

- Coloración de Gram: recuento de neutrófi-los, células epiteliales escamosas, predominio debacterias indicativo de:

diplococos gram positivos lanceolados:S. pneumoniae.

cocobacilos gram negativos pleomórficos:H. influenzae.

diplococos gram negativos: M. catarrhalis.- Coloración de Ziehl Neelsen o de Kinyoun:

visualización de bacilos ácido alcoholresistenteso ácidoresistentes. (micobacterias, Nocardia spp)

- Coloración de Giemsa: celularidad, elemen-tos micóticos.

- Azul de o-toluidina, metenamina plata,Gram Weigert, coloración fluorescente con anti-cuerpos monoclonales: P. carinii.

Cultivo

a) Cultivo para gérmenes comunes- Sembrar en 4 estrías en agar sangre y agar

chocolate (5-10% de CO2), McConkey o CLDE(aerobiosis)

b) En pacientes fibroquísticos adicionar mani-tol salado (aumenta la recuperación de S. aureus)y OFB (medio selectivo con polimixina B paraB. cepacia).

c) Ante sospecha clínica o epidemiológica yen pacientes inmunocomprometidos

Mycobacterium spp: Lowestein Jensen y Sto-nebrink (previa homogeneización)

Hongos: Agar Sabouraud con antibióticos yagar cerebro corazón con antibióticos.

Interpretación del esputo y lavado bronquial

Exámen directo

- Muestra representativa: <10 Células esca-mosas, >25 leucocitos (10x), germen predomi-nante. Este criterio de restricción no es válidopara M. tuberculosis ni para hongos de micosissistémicas.

- Muestras no representativas:>10 células escamosas y/o <25 leucocitos en

campo de 10xFlora polimicrobiana.

Cultivo

Jerarquizar el crecimiento de gérmenes quellegan hasta la 3-4 estría en forma desplazante,con este fin es útil aplicar los criterios de Bartlettque se presentan en la tabla 2.

Creemos conveniente jerarquizar losmicroorganismos que llegan puros hasta la 3ºestría (++++) o los predominantes que lleganhasta la 4º estría aunque presenten florapolimicrobiana en las primeras.

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Tabla 3(1) Tratar de aislar el morfotipo predominante visto en la coloración de Gram, tipificar y realizar pruebas de sen-

sibilidad correspondientes; sugerir confirmación con nueva muestra Si no se puede reaislar el germen predo-miante informar el exámen directo haciendo hincapié en el predominio e informar flora polimicrobiana

(2) La única utilidad sería como cultivo de vigilancia para estudio de colonización. Sugerir nueva muestraCEECs: células epiteliales escamosasPMN: neutrófilosXXX: No se aconseja el cultivo, en caso de realizarse informar FPM.FPM: FLORA POLIMICROBIANA

Gram

++++++++++

1º Estría

<10>10>10>10

2º Estría

<5<5>5>5

3º Estría

--<5>5

CRITERIOS DE INFORME PARA EL ESPUTO.

CEECs (10x)

PMN (10x)

Germen Predominante(1000x)

FPM (1000x)

CultivoPredominante

Cultivo:FPM

Informe

Coloración de Gram

>10<10

<10>10>10

>10<10<10

<25>25

>25>25>25

>25<25<25

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

XXX

XX

XXXX

FPMGénero y especieAntibiogramaFPM o (1)FPMGénero y especieAntibiogramaFPM o (1)FPMGénero y especie

Tabla 3

Tabla 2. Criterios utilizados para jerarquizar el desarrollo de los gérmenes en muestras de esputo

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PROCESAMIENTO DE LIQUIDOS DE PUNCION

EXAMEN DIRECTO CULTIVO BUSQUEDA DE ANTIGENOSCAPSULARES

Fresco

Coloración de Gram

Coloración de Giemsa

Coloración de Ziehl Neelsen

Agar sangre y chocolate (5-10% deCO2), CLDE (aerobiosis), agar anaero-bio (anaerobiosis), caldo tioglicolato obotellas de BACTEC o Bact-Alert anaeróbicas.

Lowenstein Jensen + StonebrinkMedios líquidos de métodos automati-zados como BACTEC o BACT-ALERT.

Agar Sabouraud y agar cerebro corazóncon antibióticos.

CIEFCoaglutinación

LátexELISA

CIEF: contrainmuno electroforesis

Tabla 4

LIQUIDOS DE PUNCION:LIQUIDO PLEURAL (PL), PUNCION

TRANSTRAQUEAL(PTT) Y PUNCIONPULMONAR PERCUTANEA (PPT)

Se las utiliza cuando no se ha podido llegar aldiagnóstico a través del esputo, no hay respuestaal tratamiento empírico, se sospecha la presenciade anaerobios y/o existe derrame pleural (PL).

La PTT y la PPT estan contraindicadas cuan-do el paciente esta intubado, tiene hemoptisis y/ohipoxemia severa, no coopera con el procedi-miento o esta bajo tratamiento antibiótico, ycuando existen transtornos de la coagulación.

Se han descripto falsos positivos para la PPTen 2-20%, principalmente contaminantes de piel.Los falsos negativos pueden llegar al 20%.

En la PTT la incidencia de falsos negativos esdel 1%, pero son frecuentes los falsos positivospor contaminanación de piel o de la flora orofa-ríngea en pacientes con EPOC, neoplasias bron-

cogénicas o aspiración crónica.En pacientes con neumonía y empiema pleu-

ral, los agentes más frecuentes son S. aureus,S. pneumoniae y S. pyogenes. Se ha documenta-do un aumento en la incidencia de anaerobiosdebido a la utilización de técnicas microbiológi-cas adecuadas. Barlettt y col aislaron bacteriasaerobias en 24% de los casos, anaerobios en 35%y flora mixta en 41% de 83 pacientes del servi-cio médico, que no habían recibido previamentetratamiento antibiótico.

El empiema secundario a enfermedad subdia-fragmática con frecuencia es de causa polimicro-biana y anaerobia.

En empiemas de origen postraumático u hos-pitalario hay una elevada frecuencia de S. aureusy bacilos gram negativos. Los receptores detransplantes de órganos y los pacientes con SI-DA pueden padecer reactivaciones de focospleurales de infecciones micobacterianas y fún-gicas previas.

INFORME

Debe comunicarse el aislamiento de cual-quier microorganismo, aunque deben tomarsecon precaución los desarrollos de germenes depiel que sólo crecen en medios líquidos puestoque probablemente representan contaminación.

OTRAS MUESTRAS

Los especímenes obtenidos por fibrobroncos-copía (lavado broncoalveolar y cepillo protegi-do) se reservan en general para pacientes conneumonía severa que requieren internación enterapia intensiva, para pacientes que no respon-

den a la terapia antibiótica, inmunocomprometi-dos, neumonías asociadas con cuerpos extraños,búsqueda de P. carinii y en aquéllos con sospe-cha de tuberculosis pero que no tienen esputoproductivo. Estos serán discutidos en detalle enneumonías intrahospitalarias.

La biopsia de pulmón a cielo abierto se utili-za en contados casos y tambien sera discutidamás adelante.

NEUMONIA NOSOCOMIAL (NP)

La neumonía nosocomial representa la segun-da o tercer causa más frecuente de infección in-trahospitalaria y se da comunmente en pacientesque requieren ventilación mecánica (ARM) enunidades de cuidados intensivos. Algunos auto-res documentan incidencias del 20% en estasunidades pero los valores pueden ser superioresen pacientes con Síndrome de Distress Respira-torio (SDRA). El riesgo de desarrollar neumoníaasociada a ventilador aumenta linealmente, cercade 1% por día, y en la mayoría de los casos, enlos primeros 8 días de intubación.

La mortalidad cruda se encuentra en el ordende 30-50% y la mortalidad atribuible entre el20-30%; estos valores se incrementan en el casode P. aeruginosa y Acinetobacter spp. La morbi-lidad es también un factor importante a conside-rar puesto que en pacientes intubados incremen-ta la duración de la ventilación mecánica en 18-22 días y el tiempo total de internación en 10-13días.

Se entiende por neumonía nosocomial aqué-lla que desarrolla después de las 48 horas de in-ternación .Las principales manifestaciones clíni-cas son la fiebre y la leucocitosis a nivel sistémi-co y secreciones traqueobronquiales purulentas einfiltrados pulmonares a nivel local. Dichos ha-llazgos en personas previamente sanas casi siem-pre indican neumonía. En pacientes que estanen ARM existen causas alternativas de infiltra-dos como ser injuria pulmonar, atelectasias, em-bolia de pulmón, derrame pleural, insuficienciacardíaca, aspiración de sangre o contenidogástrico, infiltrados neoplásicos, fibroprolifera-ción, etc. Además la fiebre puede ser debida aotras causas infecciosas como infección de caté-teres, de heridas quirúrgicas, de úlceras por de-cúbito, intraabdominales, sinusitis e infecciones

urinarias; o bien puede relacionarse a causas noinfecciosas como ser pancreatitis, fase prolifera-tiva del SDRA, émbolos pulmonares, fiebre aso-ciada a drogas, hipertermia maligna, reacción atransfusiones, tromboflebitis venosa, infarto demiocardio, postquirúrgica, etc.

Las secreciones traqueales purulentas casisiempre están presentes en pacientes ventilados,pero pueden originarse tanto en el tracto respira-torio superior como inferior . En estos pacientesla porción de la tráquea superior entre el extremodistal del tubo endotraqueal y las cuerdas voca-les actúa como reservorio de secreciones origi-nadas en orofaringe, senos paranasales y estóma-go . Mínimas manipulaciones de este tubo hacenque las secreciones se introduzcan en la tráquea. Como consecuencia de ésto, el cultivo de secre-ciones traqueales, que si bien posee una sensibi-lidad aceptable, presenta una especificidad muybaja del orden del 30% cuando se compara conla biopsia de pulmón. Esto se debe a la coloni-zación orofaríngea con flora hospitalaria gramnegativa que se produce tempranamente en lamayoría de los pacientes internados.

Todo lo anteriormente mencionado explicapor qué los criterios clínicos y radiológicos utili-zados para definir neumonía en este grupo parti-cular son poco precisos .El lavado broncoalveo-lar y/o el cepillo protegido broncoscópicos o no,sembrados en forma cuantitativa, son las mues-tras de elección para ser analizadas junto con unscore clínico y radiológico , De esta forma sepuede realizar un uso racional de antibióticos,evitando sobretratamientos, acortando la dura-ción de la terapia empírica, minimizando laemergencia de cepas resistentes y disminuyendola morbi-mortalidad asociada .

Dentro de los agentes etiológicos más fre-cuentes se encuentran los bacilos gram negati-vos, aproximadamente un 70% con respecto altotal, principalmente Pseudomonas aeruginosa,seguida por Klebsiella pneumoniae, Acinetobac-ter baumannii, Enterobacter spp, Serratia mar-cescens, con un orden de frecuencia que depen-de de cada hospital. Staphylococcus aureus esotro importante microorganismo que se aísla en-tre el 10-20% de los casos. En la primer semanade internación tambien puede encontrarse aun-que con menor frecuencia Streptococcus pneu-moniae, Haemophilus influenzae y Moraxella

BRITANIA24

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catarrhalis. Las bacterias anaeróbicas, micobac-terias y hongos, en tanto, se recuperan en un por-centaje muy bajo en pacientes con neumoníaasociada a respirador.

Se han documentado también infeccionesepidémicas por Legionella spp, virus sincicialrespiratorio y parainfluenza A . Los dos últimospueden causar hasta un 20% de los casos en uni-dades pediátricas.

En la Fundación Favaloro sobre 241 episo-dios de NP diagnosticados entre 1992 y 1995, seaisló P. aeruginosa en 26% de los casos,K. pneumoniae en 12,6% y S. aureus en 10%dentro de los más importantes agentes. La pre-sentación fué monomicrobiana en el 75% de lospacientes.

En pacientes inmunocomprometidos hospi-talizados deben considerarse una serie de gérme-nes adicionales como Nocardia spp, Mycobacte-rium spp, P. carinii, T. gondii, estreptococos delgrupo.viridans, R. equi, citomegalovirus, Herpessimplex, etc.

Diagnóstico bacteriológico

A) Muestras de primera elección1) Muestras tomadas por fibrobroncoscopía:

lavado broncoalveolar (BAL), cepillo protegido(CEP).

Muestras alternativas de segunda elección2) BAL y CEP no broncoscópicos, tomados a

través de distintos sistemas de doble catéter 3) Secreciones traqueales para cultivo cuanti-

tativo.

Muestras adicionales4) Líquido pleural (en caso de derrames

pleurales)5) Biopsia de pulmón a cielo abierto, biopsia

transbronquial o punción pulmonar percutánea6) Hemocultivos

7) Muestras complementarias para excluirotros focos: catéteres, punción de senos maxila-res, de heridas quirúrgicas, urocultivos, etc.

B) Transporte de las muestrasDeben procesarse dentro de los 30 minutos

y no más allá de las 2 horas de obtenidas. Un ex-

cesivo retraso en el transporte podría resultar enel sobrecrecimiento de microorganismos conta-minantes o colonizantes o en la disminución delrecuento de patógenos "fastidiosos" comoS. pneumoniae o H. influenzae.

Excepcionalmente pueden conservarse a 4ºCdurante 24-48 horas.

C) Procesamiento

SECRECIONES TRAQUEALES

Coloración de Gram:Realizar en primer lugar un recuento de neu-

trófilos y células epiteliales escamosas, conside-rándose representativa una muestra con > 25PMN y < 10 células epiteliales (10x).

Búsqueda de bacterias intra y extracelulares.Diversos estudios avalan el criterio de rechazo deesta muestra en el caso de no visualizarse mi-croorganismos.

SiembraSemicuantitativa: Similar a lo descripto para

esputo en lo que hace a siembra e interpretación.

Cuantitativa: mezclar partes iguales desecreciones y de N-acetil cisteína al 1%, dejaractuar durante un minuto, luego realizar unadilución 1/100 (0,1 en 9,9 ml de soluciónfisiológica estéril) y sembrar 100 µl (diluciónfinal 1/1000) en los medio citados en el puntoanterior. Es conveniente el agregado de al menos2 diluciones más: 1/10.000 y 1/100.000. Se debeconsiderar como representativo un punto decorte de 106 ufc/ml.

En este caso la especificidad mejora conside-rablemente con respecto al procesamiento semi-cuantitativo pero se mantiene aún por debajo delos correspondientes valores de BAL o CEP.

Procedimientos adicionales: tienen por obje-tivo aumentar la especificidad del cultivo de se-creciones traqueales y ayudar a la jerarquizacióndel microorganismo aislado.

Determinación de fibras de elastina: se mez-cla una ansada de secreciones traqueales con 2-3gotas de KOH al 40%, se calienta suavemente yse observa con 10x buscando ovillados de fibras

con puntas deflecadas. Estas fibras se producenen los pacientes con neumonía necrotizante y sudeterminación si bien tiene una especificidadcercana al 100% (excepto en personas con Sín-drome de Distress Respiratorio del Adulto), pre-senta una sensibilidad del 50%.

Determinación de anticuerpos ligados abacterias: los valores de sensibilidad y especifi-cidad son comparables a la técnica anterior perola determinación es mucho menos práctica pararealizarla diariamente.

MUESTRAS TOMADAS PORFIBROBRONCOSCOPÍA

Debe evitarse la succión de secreciones de lavía aérea proximal a medida que avanza el fibro-broncoscopio, como así también la introducciónde lidocaína a través del canal de succión.

CEPILLO PROTEGIDO (CEP)

Esta muestra fué desarrollada por Wimberleyen 1979,. Consiste de un cepillo dentro de unadoble cánula, interna y externa, con un tapón decarbowax en el extremo distal de esta última pa-ra evitar la contaminación con secreciones orofa-ríngeas a medida que avanza el dispositivo a tra-vés del canal de succión del fibrobroncoscopio.Una vez ubicado éste en el sitio elegido se avan-za la cánula interna y por último el cepillo y setoma la muestra, luego de lo cual se invierte elproceso retrotrayendo primero el cepillo dentrode la cánula interna, después ésta dentro de la ex-terna y por último se retira todo el dispositivo.Se recomienda que en pacientes con injuria pul-monar difusa se realice el cepillado en el sectorreconocido endoscopicamente con drenaje de se-creciones francamente purulentas o bien se to-men cepillados en dos o más zonas del pulmóny/o bilateralmente.

Por otra parte cuando se toman BAL y CEPconviene obtener primero este último; Meduri ycol. encontraron que cuando se tomaba primeroel BAL, el porcentaje de falsos positivos del CEPera de 50%, en tanto que cuando se invertía el or-den el porcentaje caía al 17%. Los falsos positi-vos también pueden producirse en pacientes conanormalidades anatómicas.

Procesamiento: la muestra puede llegar al la-

boratorio de Bacteriología dentro de la doble cá-nula o bien en 1 ml de solución fisiológica. En elprimer caso, antes de extraer el cepillo debe de-sinfectarse la cánula externa por fuera con alco-hol etílico de 70º, luego se extrae y se corta el ce-pillo y se coloca en 1 ml de caldo BHI (la solu-ción fisiológica puede disminuir los recuentos deS. pneumoniae y H. influenzae e inhibir el creci-miento de L. pneumophila) y se agita con vortexdurante 1 minuto. Se siembra esta dilución y unadilución 1/1000 en agar sangre, agar chocolate,CLDE o similar y agar anaerobio; este últimotiene mayor importancia en el caso de pacientesen los que se produjo una franca aspiración decontenido orofaríngeo. Las placas deben ser in-cubadas durante 72 horas.

La coloración de Gram puede realizarse delcentrifugado del líquido en que se agita el cepi-llo o bien directamente de un segundo cepillo.

La cantidad de muestra tomada por este pro-cedimiento es muy pequeña, alrededor de 0,01 a0,001 ml de secreciones respiratorias, lo cual in-dica que un recuento de 103 ufc/ml correspondea recuentos de 105 o 106 ufc/ml en la secreción.

El punto de corte de 103 ufc/ml ha sido vali-dado por comparación con cultivos de biopsia depulmón a cielo abierto.

La sensibilidad de esta técnica se encuentraen el orden de 80% (rango 64-100%) y la espe-cificidad en 92% (rango 69-100%).

Cuando se toman dos muestras en el mismomomento, pueden haber variaciones en 1 unidadlogarítmica en 13-16% de los pacientes, ésto ha-ce que se deban analizar muy cuidadosamentelos recuentos "borderline" e idealmente se repitael procedimiento dentro de las siguientes 48 ho-ras. Como fuera demostrado por Dreyfuss y col.,sólo en 35% de estos casos, la segunda muestratenía el mismo aislamiento, con recuentos >103

ufc/ml, y fueron confirmados clínica e histológi-camente como neumonías. Esta variabilidad pue-de deberse al pequeño volumen de muestra to-mado o a la irregular distribución de gérmenesen la secreción. También debe considerarse cau-telosamente un recuento de 100 ufc/ml en pa-cientes que están recibiendo antibióticos.

Debido a la escasa cantidad de muestra obte-nida, (0.01-0.001 ml) este procedimiento no esde elección para la búsqueda de M. tuberculosis,H. capsulatum, C. immitis, P. brasiliensis y C.neoformans.

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LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL)

Consiste en la instilación y aspiración se-cuencial de solución fisiológica a través delbroncoscopio enclavado en un subsegmento pul-monar. La infusión de al menos 100-120 ml (5alícuotas de 20 ml) es utilizada para un adecua-do estudio en adultos . En pacientes pediátricos,en cambio el volumen final no supera los 10 ml(miniBAL).

En los pacientes con neumonía asociada arespirador el CEP y BAL se obtienen general-mente del subsegmento afectado del pulmón,aunque la necesidad de seleccionar un subseg-mento determinado ha sido cuestionada.

En el caso de neumonía en pacientes no intu-bados, podrían obtenerse ambas muestras BAL yCEP, reservando la biopsia transbronquial paraexcluir causas no infecciosas.

Por otra parte, el BAL bilateral en pacientesinmunocomprometidos podría incrementar lasensibilidad para detectar algunos patógenos co-mo P. carinii y citomegalovirus.

Una variante descripta por Meduri y col., uti-liza un catéter balón protegido trans-broncosco-pio que se insufla cuando el dispositivo está en-clavado en el lugar elegido y de esta forma oclu-ye la vía aérea impidiendo la contaminación consecreciones de vías respiratorias superiores, au-mentando la especificidad de esta muestra a va-lores comparables a los del CEP.

Es importante que se envíen por separado lasdistintas fracciones que se recuperan, ya que laprimera es la mas contaminada y si bien se pue-de utilizar para cultivo de micobacterias, Legio-nella spp y micosis sistémicas, tiene el mismovalor que las secreciones traqueales para los gér-menes habituales. En este último caso la segun-da o tercera porción son las ideales para realizarcultivos cuantitativos . Debe remitirse una por-ción al laboratorio de anatomía patológica paraestudios histopatológicos.

Procesamiento: Se presenta en la figura 1(pág. 32).

InterpretaciónCon respecto al exámen directo es fundamen-

tal que el porcentaje de células epiteliales esca-mosas sea < 1%, contando por lo menos 200-300

elementos entre macrófagos, células epitelialesescamosas y neutrófilos; si este porcentaje se su-pera se estaría en presencia de una muestra con-taminada con secreciones respiratorias de víassuperiores, por lo tanto si bien se puede utilizarpara diagnóstico de tuberculosis y micosis sisté-micas, sería de pobre utilidad para el cultivocuantitativo bacteriano.

La presencia de células ciliadas bronquialespodría tambien ser tomada de acuerdo a algunosautores como otro marcador de contaminación.La observación de macrófagos es normal, si losmismos no se visualizan, en ausencia de neutró-filos, indicaría que es una muestra muy diluída ocon bajo contenido de secreciones respiratorias.

Los neutrófilos por otra parte constituyen larespuesta del huésped a la infección. El hecho deno observarlos hace que la neumonía sea un pro-ceso improbable en ese momento (en pacientesno neutropénicos) o por lo menos en el lugardonde se tomó la muestra. Por otra parte la pre-sencia de los mismos no es específica de neumo-nía puesto que como se mencionó anteriormentepodrían existir otras múltiples causas queexpliquen su presencia.

También es de utilidad evidenciar la presen-cia de bacterias intracelulares puesto que tienenuna alta correlación con infección (especificidad95-100%, sensibilidad 75%), aunque no esta cla-ro cual es el porcentaje de células fagocíticas conbacterias intracelulares que indican esta condi-ción (rango 2-25%). Debemos recordar sin em-bargo que las bacterias capsuladas (Ej: S. pneu-moniae) son habitualmente extracelulares.

Si bien existe consenso internacional paraconsiderar a 104 ufc/ml como punto de corte, al-gunos autores han tomado los valores de 103 o de105 cfu/ml.

En la Fundación Favaloro sobre 241 episo-dios de neumonía intrahospitalaria, 86% de loscasos cursaban con recuentos mayores a 104

ufc/ml, en tanto que en el grupo control solo18% superaba este valor (p<0,001).

En la tabla 5 se presenta la sensibilidad, es-pecificidad, valor predictivo positivo y negativoe Indice de Youden para los distintos puntos decorte en el trabajo mencionado.

BRITANIA28

Punto de corte(ufc/ml)

Sensibilidad Especificidad V.Predictivo(+)

V.Predictivo (-)

Y. Youden

≥ 103

≥ 104

≥ 105

1008640

638292

175873

1009174

0.630.680.32

Tabla 5. Datos sobre 241 episodios de neumonía intrahospitalaria (Fundación Favaloro).

La mayor sensibilidad se encontró con el pun-to de corte de 103 ufc/ml, pero su especificidad yvalor predictivo positivo fueron muy bajos. Lamayor especificidad fué para el punto de corte de105 ufc/ml pero la sensibilidad resultó muy baja.Si se analizan ambos parámetros con el Indice deYouden {(Sensibilidad + Especificidad) - 1} po-demos ver que coincidiendo con el consenso in-ternacional el mejor punto de corte fué 104 ufc/ml.

Debido al mayor volumen del especimen, esteprocedimiento muestrea 1 millón de alveólos (1%de la superficie pulmonar) y a la dilución con so-lución fisiológica, los recuentos se ven menosafectados que en el caso de CEP por tratamientosantibióticos previos.

El problema con tratamientos antibióticos re-cientes,dentro de las 48 horas de la fibrobroncos-copía, es de mayor magnitud que un curso prolon-gado donde hay más chances de seleccionar bac-terias resistentes. Se demostró que el 93% de loscultivos de CEP y BAL han sido estériles cuandose repetían 48 horas después de iniciado el trata-miento antibiótico en pacientes en los que previa-mente se diagnosticó neumonía con cultivoscuantitativos. La relación del tratamiento antibió-tico con falsos positivos no es tan clara aunquepodría relacionarse con una propagación distal decolonizantes de tráquea más resistentes que elgermen causal.

Por otra parte en una revisión realizada porMeduri y Chastre, estos autores encontraban queen pacientes que estaban recibiendo antibióticosse observaba un 54% de aislamientos vs 76% enlos que no lo recibían. Los falsos positivos iban de

41-60% para el CEP en el primer grupo vs 24%en el segundo.

Aproximadamente un 25% de las neumoníasen pacientes ventilados son polimicrobianas; Jo-hanson y col. trabajando con mandriles intubadosestablecieron un Indice Bacteriano ( IB ) que seobtenía de aplicar logaritmo decimal a cada re-cuento individual y luego sumarlos; 77% de loslóbulos que histologicamente tenían neumoníadaban un IB >6, en tanto que tan solo 7% de losque no tenían esta infección superaban dicho va-lor. En el mencionado estudio de la FundaciónFavaloro sobre 241 episodios de neumonía intra-hospitalaria, 25% eran polimicrobianas y todassuperaban el valor de 6.

La sensibilidad del BAL se encuentra en elrango de 72-100% y la especificidad en el rangode 69-100%. Para el BAL protegido los valores desensibilidad están en el rango de 82-92% y los deespecificidad en 83-97%.

En el caso de hongos filamentosos, en pacien-tes inmuncomprometidos, el mayor problema esla baja sensibilidad (0-50%).La biopsia de pul-món generalmente es la muestra más importantepara el diagnóstico . La colonización orofaríngeaes poco frecuente y probablemente representa unfactor de riesgo para infecciones invasivas en neu-tropénicos. En el caso de Candida spp, en cambioel principal problema es la carencia de especifici-dad debido a la frecuente colonización, depen-diendo el diagnóstico final de la demostración delas levaduras en tejidos. No se deben aplicar pun-tos de corte a los cultivos para hongos.

BRITANIA29

Tabla 6Causas de falsos positivos y negativos para BAL y CEP

Figura 1. Procesamiento esquemático de BAL y CEP

FALSOS NEGATIVOS

Terapia antibiótica

Incorrecta localización del fibrobroncoscopio

Estadíos tempranos de la infección

Pobre retorno del BAL en pacientes con víascolapsables (enfisema) o en lóbulos inferiores

Retardo en el procesamiento

Errores metodológicos al realizar dilucioneso procedimientos inapropiados.

FALSOS POSITIVOS

Succión de secreciones purulentas a medidaque el fibrobroncoscopio avanza

Instilación de lidocaína a través del canalinterno del fibrobroncoscopio

Terapia antibiótica

Anormalidades anatómicas

Pacientes con EPOC

Alta presión en las vías aéreas

1 ml de caldo

BALCEP

Vortex 60 segundos

Sembrar 0,1 ml en AS, ACH,CLDE, Agar anaerobio(CEP). Dilución final 1/10.

0,1 ml en 9,9 de soluciónfisiológica (1/100)

Sembrar 0,1 ml en AS, ACH, CLDE,Agar anaerobio (CEP). Dilución final1/1000.

Centrifugar 10 ml, 1500-2000rpm, 10-15’

Sedimento

Fresco, Gram, Giemsa

Adicionales: Ziehl Neelsen*,*Kinyoun, *azul de o-toluidina

*coloración fluorescente p/Legionella

CRITERIOS DE INFORME PARA EL BALY CEP. DISTINTAS SITUACIONES

1) Recuentos por arriba del punto de corte(104 o 103 ufc/ml respectivamente) y respuestainflamatoria importante (>10 neutrófilos/1000x)con /sin bacterias en el examen directo

A) Unico microorganismo: tipificacióny antibiogramaB) Dos o tres microorganismos: tipifica-ción y antibiograma de cada uno, infor-me del recuento individual y del IndiceBacteriano.

2) Recuentos "Borderline" (103 y 102 ufc/mlrespectivamente)

A) Con respuesta inflamatoria: tipifica-ción y antibiograma del o los microorga-nismos.B) Sin respuesta inflamatoria: probablecontaminación (quedan excluídos de estaconsideración los pacientes neutropénicos)

Evaluar factores que afectan los recuentosbacterianos, especialmente el tratamiento anti-biótico instaurado dentro de las 24 horas de rea-lizada la fibrobroncoscopía.

Sugerir nueva muestra dentro de las 48 horas.

3) Recuentos bajos (102 y <10 ufc/ml respec-tivamente), con o sin respuesta inflamatoria.

A) Cultivo negativo

LAVADO BRONQUIAL

Tiene las mismas limitaciones que el cultivode secreciones traqueales para gérmenes comu-nes, por lo tanto su principal utilidad en pacien-tes intubados reside en la búsqueda de micobac-terias, micosis sistémicas, Nocardia spp y Rho-dococcus equi.

BIOPSIA TRANSBRONQUIAL

Se obtiene con forceps que se pasan a travésdel canal de trabajo del broncoscopio y se tomamuestra de alveólo y/o de tejido peribronquial.Es importante para la realización de técnicas his-topatológicas en el diagnóstico de neoplasias,sarcoidosis. Tambien en pacientes con SIDA pa-ra el diagnóstico de P. carinii y tuberculosis.Permite observar invasión de tejidos por hongosy herpes virus. Debido al problema potencial decontaminación con secreciones respiratorias su-periores, la especificidad para el cultivo de gér-menes comunes puede ser baja, como así tam-bien la sensibilidad debido al pequeño tamaño dela muestra.

El procesamiento se discutirá junto con el debiopsia de pulmón a cielo abierto.

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Referencias de Fig. 1Casos especiales: (sospecha epidemiológica o en pacientes inmunocomprometidas)

Adicionar coloraciones y medios para micobacterias, Nocardia spp,P. carinii, hongos. Utilizar el sedimento de la 1ºfracción.

AS: agar sangreACH: agar chocolateCLDE: cistina lactosa deficiente en electrolitosAgar anaerobio: Agar sangre lacada suplementada con vitamina K y hermina.Tiempo de incubación: 72 horasAtmósfera de incubación: AS y ACH en 5-10% de CO2; CLDE en aerobiosis, Agar anaerobio en

anaerobiosis. Puede realizarse examen directo del CEP centrifugando ellíquido donde se agitó el mismo o bien a partir de una segunda muestra.

BRITANIA31

Tabla 8Utilidad de distintas técnicas broncoscópicas para el aislamiento de distintos gérmenes. Escala de 0-3

Microorganismos

P. carinii

M. Tuberculosis

Bacterias “habituales”

Legionella spp

Nocardia spp

Candida spp

Aspergillus spp

Micosis sistémicas

Lavado bronquial

2

3

0

1

3

0

0

2

CEP

1

0

3

1

ND

0

0

1

BAL

3

2

3-2

2

2

1

1

2

Biopsia transbronquial

3

3

0

1

1

2

2

1

Ventajas del BAL sobre el CEP

• Menor costo.• Menos afectado por el uso previo de

antibióticos.• La muestra es de mayor volumen lo que per-

mite la realización de diferentes técnicas diag-nósticas.

• Es una muestra válida para la búsqueda demicobacterias y hongos de micosis sistémicas,no así para anaerobios a menos que se utilize latécnica protegida descripta por Meduri.

• El exámen directo provee información in-mediata para el manejo del paciente conneumonía nosocomial.

En pacientes intubados con sospecha clínicade neumonía, la real utilidad de la broncoscopíaes excluir neumonía o bien documentar , en elcaso de pacientes con esta infección, un germendistinto al aislado en las secreciones traqueales.La elección de un tratamiento antibiótico ade-cuado es tan crítica como establecer la verdade-ra presencia de neumonía puesto que tratamien-tos erróneos constituyen un importante factor deriesgo en la mortalidad atribuible a estas infec-ciones.

Dentro de las principales complicaciones dela fibrobroncoscopía se encuentran hipoxemia,sangrado, arritmias y neumotórax .La frecuenciade presentación de las mismas depende del tipode procedimiento y de la enfermedad de base delpaciente.

Tabla 7Comparación entre distintas técnicas fibrobroncoscopicas.

Muestra broncoscópica

Lavado bronquial

Cepillo protegido

Lavado broncoalveolar

Biopsia transbronquial

Sitio anatómico

Bronquios

Bronquiolos

Alveólos

Parénquima pulmonar

Cantidad de muestra

10-20 ml

0,01-0,001 ml

10-100 ml

0,1 g

Dilución

1/10-1/100

1/1000

1/10-1/100

Punto de corte (ufc/ml)

103

104

MUESTRAS NO BRONCOSCÓPICAS

Existe una variedad de estas técnicas que po-seen las ventajas potenciales de ser menos inva-siva, de tener un costo inicial menor al de labroncoscopía, menor compromiso del pacientecon respecto al intercambio de gases, posibilidadde realizarlas en pacientes con tubos endotra-queales pequeños, realización por cualquier mé-dico sin necesidad de recurrir al neumonólogo,independizarse de la habilidad o capacidad deloperador. Dentro de las desventajas está la posi-bilidad de error en la toma de muestra debido aque se realiza a ciegas y a que se instila un volu-men de solución fisiológica mucho menor, (apro-ximadamente 10 ml.).

Se han realizado CEP no broncoscópicos uti-lizando distintos tipos de catéteres como Metras,catéteres 15-Fr, nasotraqueales, etc; También seha realizado BAL a través de distintos sistemasde doble catéter.

El procesamiento de estas muestras es idénti-co al de las muestras broncoscópicas, como asítambien los puntos de corte considerados. Sinembargo solo el CombiCath ha sidoconvenientemente evaluado contra un “goldstandard” como la biopsia de pulmón.

La sensibilidad se encuentra en el rango de60-100% y la especificidad en el orden de 69-100%.

También se ha descripto una técnica de aspi-rado con catéter protegido telescópico; en estecaso se inserta un catéter con un tapón de carbo-wax en el árbol bronquial, a ciegas, hasta que eldispositivo no avanza más, luego se retrotrae1cm, se expulsa el tapón y se aspira aproximada-mente 0,01 ml de secreción. Se corta y envía lapunta del catéter que se procesa en forma similaral CEP, siendo el punto de corte 103 ufc/ml. Lasensibilidad se encuentra en el orden del 60-70%y la especificidad en 84-100%.

BRITANIA32

Tabla 9Comparación de técnicas no broncoscopicas

TIPO DIRIGIDO VOLUMEN (ml) COMPARACION CULTIVOCUANTITATIVO

COMBICATH

CATETER PARADUODENOGRAFIAS

BAL-Cath

SWANZ-GANZ

CATETERES DESUCCION

NO

NO

SI

NO

NO

20

100-150

25-100

150

20

H/PMC

CLINICA

CEP-BAL

H

CLINICA

SI (>103 UFC/ml)

SI (>104 UFC/ml)

SI (>104 UFC/ml)

NO

SI

MUESTRAS ADICIONALES

BIOPSIA DE PULMÓN A CIELO ABIERTO

Si bien se considera el "gold standard", cuan-do esta muestra es demasiado pequeña puede te-ner falsos negativos en aproximadamente un25% de los casos si se compara con el pulmónentero. Proporciona un diagnóstico definitivo y

exacto, pese a esto raramente se indica en el ma-nejo de pacientes ventilados puesto que ha sidorelegado a un segundo lugar por las técnicasbroncoscópicas; se la utiliza para aquéllos pa-cientes que no evolucionan de acuerdo a lo espe-rado y/o en los que no se ha podido llegar aldiagnóstico por métodos menos invasivos. Losresultados de este procedimiento han sido supe-riores a los de la biopsia transbronquial y a los de

H/PMC Diagnóstico histológico post morten.

BRITANIA33

la punción pulmonar percutánea, debido a que engeneral se puede tomar una muestra de tamañosuficiente y bajo visualización directa.

El procesamiento microbiológico de rutina,previa homogeneización con mortero o Stoma-cher, debería contemplar la mayor cantidad deposibilidades (gérmenes comunes, anaerobios,

micobacterias, nocardia, Legionella, hongos yP.carinii) y también debería remitirse una por-ción de la muestra para estudios histopatológi-cos.

En pacientes sin tratamiento antibiótico sedeben jerarquizar recuentos superiores a 104

ufc/g de tejido.

HEMOCULTIVOS

Aproximadamente un 10% de los pacientescon neumonía asociada a respirador tienen he-mocultivos positivos relacionados a este foco. Eneste grupo de riesgo la especificidad de estamuestra es baja, puesto que 60-70% de los he-mocultivos positivos se producen a partir de unfoco distinto al pulmonar.

De todas formas es una muestra complemen-taria importante, sobre todo cuando se analiza enconjunto con el cultivo cuantitativo de BAL oCEP y puede ayudar a clarificar la interpretaciónde recuentos "borderline" en estas muestras.Tambien es necesario analizar en paralelo el cul-tivo de otros potenciales focos como ser urocul-tivo, catéteres, punción de heridas quirúrgicas,de senos paranasales , muestras intraabdomina-les, etc.

Situaciones especiales

Legionella sppSe aisló en 2-6% de los casos de neumonía de

la comunidad en USA. La población en riesgo,

está constituído por personas expuestas a fuentescontaminadas, gerontes, fumadores, y huespedescomprometidos en la inmunidad celular(transplantados).

Se han identificado 15 serogrupos de L. pneu-mophila y 33 especies adicionales. El serogrupo1 es responsable de cerca del 80% de las infec-ciones causadas por L. pneumophila. El resto delos casos corresponde a los serogrupos 4 y 6.Otras especies como L. micdadei, L. longbeache,L. durmoffii y L. bozemanii producen menos del20% de los casos.

Las indicaciones para su búsqueda sonenfermedades severas que requieren internaciónen UCI, evidencias de adquisición en áreasendémicas o epidémicas, falta de respuesta altratamiento con beta lactámicos, neumonía eninmunocomprometidos y sospecha clínica enbase a fiebre alta, hiponatremia, manifestacionesa nivel de SNC, niveles de LDH mayores a 700U/ml y enfermedad severa.

Las muestras que presentan mejor rendimien-to para su aislamiento son el BAL y la biopsia depulmón, aunque también se ha recuperado de es-puto, líquido pleural, secreciones traqueales, la-

Tabla 10Procesamiento rutinario de biopsias de pulmón

EXAMEN DIRECTO

• EXAMEN EN FRESCO

COLORACIONES DE:

• GRAM

• GIEMSA

• ZIEHL NEELSEN

• KINYOUN

• COLORACION FLUORESCENTE CON

ANTICUERPOS POLICLONALES PARA

LEGIONELLA

• AZUL DE O-TOLUIDINA

CULTIVO• CULTIVO CUANTITATIVO EN AGAR SANGRE Y

AGAR CHOCOLATE EN 5-10% DE CO2

• CLDE EN AEROBIOSIS

• AGAR BHI SUPLEMENTADO CON VITAMINA K,

HEMINA Y SANGRE LACADA, EN ANAEROBIOSIS

• LOWENSTEIN- JENSEN Y STONEBRINK Y/O

SIEMBRA EN FRASCOS DE BACTEC O BACT-

ALERT PARA MICOBACTERIAS

• AGAR SABOURAUD Y AGAR BHI CON

ANTIBIOTICOS

vado bronquial, hemocultivo y otros materiales.Para el diagnóstico se puede recurrir a colo-

raciones fluorescentes con anticuerpos monoclo-nales, cultivos en medios selectivos suplementa-dos con carbón, extracto de levadura y alfa ceto-

glutarato (BCYE), detección de antígeno urina-rio para L. pneumophila serotipo 1 por RIA oELISA, serología por inmunofluorescencia indi-recta y PCR. (Tabla 11)

Mycoplasma spp y Chlamydia spp

En un estudio sobre neumonía de la comuni-dad realizado en el Hospital de Clínicas de Bs.As. se documentó durante el año 1997, una inci-dencia de M. pneumoniae del 8% y C. pneumo-niae de 6.8%.

El diagnóstico de estos agentes se basa prin-cipalmente en demostrar la seroconversión.

Ambos microorganismos pueden ser cultiva-dos de muestras respiratorias como esputo, hiso-pado o aspirados nasofaríngeos, BAL, etc, pero

esto es dificultoso y escapa a las posibilidades dela mayoría de los laboratorios clínicos.

El diagnóstico utilizando PCR constituirá enel futuro una importante herramienta.

C. pneumoniae es un importante agente etio-lógico de neumonía en la población general y enpacientes inmunocomprometidos, C. psittaciproduce neumonía en pacientes que tuvieroncontacto con aves y C. trachomatis en recién na-cidos que adquieren el microorganismo de ma-dres con infección genital.

BRITANIA34

Metodo Muestra Sensibilidad Especificidad Tiempo Observaciones

Cultivo Esputo, BAL

Biopsia de pulmón

Hemocultivo

75-90

90-99

10-30

100

100

100

2-7 días SF utilizada enel BAL puedeinhibir eldesarrollo.

Serología(IFI)

Suero 75 95-99 6-9 semanas Se requieresuero agudo yconvalesciente.

Coloraciónfluorescentecon anticuerposmonoclonales

Esputo, BALBiopsia depulmón

25-75 95-99 1 día Detectaserogrupo1.No es sensiblepara otrasespecies.Reaccionescruzadas conB.pertussis.

Antígenourinario

Orina 80-90 99 1 día Específica paraserogrupo 1Puede serpositivo, mesesdespues deltratamiento.

PCR Esputo, BAL,Hisopadosnasofaríngeos

>90 >90 2 días No disponiblecomercialmente.

Tabla 11Sensibilidad y especificidad para las distintas metodologías de diagnóstico para Legionella spp.

Rhodococcus equi

Este microorganismo inicialmente fue aisladode caballos, pero recientemente empezó a adqui-rir relevancia en huéspedes inmunocomprometi-dos, principalmente en pacientes infectados con

el virus del HIV, enfermedades malignas y trata-miento inmunosupresor. El cuadro clínicoincluye fiebre, tos y neumonía necrotizante, fre-cuentemente acompañada de bacteriemia . Deberealizarse el diagnóstico diferencial con M. tuber-culosis, Nocardia spp y hongos.

BRITANIA35

Método Muestra Sensibilidad Especificidad Tiempo Observación

Cultivo Esputo, BAL >90 50-90 7-10 días

SerologíaF.de C*

Crioaglutinac.

Suero 75-80

33-75

80-90

<50

4-9 semanas

2-6 semanas

Se requiere sueroagudo yconvalesciente. Si solo se disponedel últimoconsiderar: >1/64

Inespecífico

PCR Esputo, BAL,aspirado ohisopadonasofaríngeo

95 95-99 2 días No se disponecomercialmente.

Tabla 12Diagnóstico de laboratorio de M.pneumoniae. Comparación de técnicas

Método Muestra Sensibilidad Especificidad Tiempo Observaciones

Cultivo Hisopadonasofaríngeo

50-90 6 días Se requieremedios detransporteespeciales ylíneas celularesHL o Hep-2

Serología-MIF

F de C*

Suero

Suero

50-90

30-40

Desconocido

<50

4-6 semanas

4-6 semanas

Incremento enel el título de 4veces o títuloindividual deIgM>1/16 oIgG>1/512

Reaccionescruzadas conC.psittaci yC.trachomatis

PCR Hisopadonasofaríngeo,BAL

80-90 >85 2 días Nodisponiblecomercialmente

Tabla 13Diagnóstico de laboratorio de C. pneumoniae. Comparación de técnicas

F. de C.: Fijación de complemento.

BRITANIA36

Se han realizado aislamientos de muestras co-mo esputo, lavado bronquial, líquido pleural,biopsia de pulmón, hemocultivos, abscesos cere-brales, pelvianos, subcutáneos, paraespinales,muestras óseas, senos paranasales, LCR, etc.

Se presenta como cocobacilos gram positivosy puede observarse en los cultivos frescos unadébil ácido resistencia con la coloración de Kin-youn. Esta propiedad se pierde con el envejeci-miento de los mismos.

Si bien las colonias presentan característica-mente un pigmento rosa salmón, algunos aisla-mientos pueden ser de color crema o amarillentos.

Debe realizarse la diferenciación bioquímicacon los géneros Gordona, Tsukamurella y otrosdifteroides; para ello se recurre a la hidrólisis dela caseína, hipoxantina, tirosina, xantina, gelati-na, urea y a la reducción del nitrato a nitrito.

Nocardia spp

Las infecciones por este germen son general-mente oportunistas y ocurren en pacientes concondiciones predisponentes como neoplasias,desórdenes pulmonares crónicos y en personasbajo tratamiento inmunosupresor. Otros gruposde riesgo son los pacientes con disgamaglobuli-nemia, enfermedad granulomatosa crónica,transplante renal y cardíaco.

El sitio primario de infección suele ser el pul-món y de allí puede producirse la diseminación aotros focos.

Las especies más frecuentemente aisladas enel ser humano son N. asteroides, N. brasiliensisy N. otitidis caviarum.

Las mejores muestras para su aislamiento son elBAL, lavado bronquial, biopsia de pulmón. Es ra-ra su recuperación a partir de muestras de esputo.

En el exámen directo, la coloración de Kin-youn permite poner en evidencia a los bacilos ococobacilos ácido resistentes. Los medios concarbón y extracto de levadura son útiles para suaislamiento, aunque tambien puede recuperarsede Lowenstein Jensen y agar Sabouraud

Micobacterias

Para su detección, el esputo sigue siendo lamuestra de primera elección, pero en pacientesque no expectoran puede recurrirse al lavado

gástrico, esputo inducido o bien a muestras to-madas por fibrobroncoscopía (BAL, lavadobronquial o biopsia transbronquial).

Se recomienda tomar tres muestras sucesivasde esputo , preferentemente las primeras de lamañana, dada la liberación intermitente del bacilo.

Algunos autores documentan una mejor sen-sibilidad con el lavado bronquial que con BAL,pero estas muestras pueden ser complementa-rias. También puede obtenerse esputo post bron-coscopía.

Para el exámen directo puede recurrirse a lacoloración de Ziehl Neelsen o a la de auramina-rodamina, con sensibilidad y especificad compa-rables.

En el caso del cultivo puede recurrirse a téc-nicas de precipitación o de centrifugación, utili-zando agentes decontaminantes como el NaOHal 4% o N- acetilcisteína con NaOH al 2%, lue-go se siembra en Lowenstein Jensen y medio deStonebrink y/o en medios 7H9, 7H10, 7H11. Eltiempo de aislamiento se encuentra entre 4-8 se-manas.

Los métodos de cultivo radiométricos (BAC-TEC) permiten disminuir el tiempo de detecciónen forma considerable . En la actualidad se en-cuentran en evaluación medios no radiopmétri-cos tanto para el sistema BACTEC como para elBact-Alert. Estas técnicas pueden combinarsecon sondas de DNA.

Otras metodologías empleadas son PCR yELISA.

Las micobacterias atípicas producen enfer-medad en pacientes inmunocomprometidos, ytambién en menor proporción en personas inmu-nocompetentes. Para jerarquizar su aislamientose debe considerar evidencia clínica, radiológicae histopatológica; aislamiento repetido con altonúmero de colonias o de muestras "estériles" yausencia de otras causas de enfermedad.

Anaerobios

Se los aisla en 85-95% de los abscesos de pul-món, 62-100% de las neumonías aspirativas, yen 22-33% de las neumonías de la comunidad.En los pacientes con asistencia respiratoria me-cánica que desarrollan neumonía se recuperancon poca frecuencia, menos del 10%.

Las muestras válidas para cultivo son la pun-

BRITANIA37

ción transtraqueal, punción pulmonar percutá-nea, biopsia de pulmón a cielo abierto, cepilloprotegido (punto de corte de >103 ufc/ml) y BALprotegido (punto de corte de > 104 ufc/ml).

Los especímenes deben ser sembrados enagar sangre lacada suplementada con vitamina Ky hemina, con y sin antibióticos (aminoglucósi-dos) y caldo cerebro corazón suplementado , Losmedios sólidos se incuban por 48 horas comomínimo y los caldos por 7 días, ambos en atmós-fera de anaerobiosis.

P. carinii

Las mejores muestras para su detección sonel BAL y la biopsia transbronquial, (sensibilidad>90%)aunque la sensibilidad del esputo induci-

do con solución hipertónica se encuentra en elrango de 50-90%.

En los pacientes que reciben pentamidina ae-rolizada como profilaxis, la sensibilidad delBAL y del esputo inducido se ve afectada, de-biendo realizarse múltiples lavados que incluyana los lóbulos medios y superiores o recurrir a labiopsia transbronquial.

El diagnóstico se realiza a través de colora-ciones dirigidas a la pared del quiste como azulde o-toluidina y metenamina plata o bien aqué-llas dirigidas contra trofozoítos o esporozoítosintraquísticos como las de Giemsa y Diff Quik.También puede realizarse inmunofluorescenciadirecta con anticuerpos monoclonales. Reciente-mente se ha aplicado la metodología de PCR conexcelentes resultados.

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