agonista superagonista agonista parziale antagonista competitivo antagonista non competitivo...
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AgonistaSuperagonista
Agonista parzialeAntagonista competitivo
Antagonista non competitivoAntagonista irreversibile
PotenzaEfficaciaAffinita’
Risposta
0
50
100
0.1 1 10 100 1000 10000EC50
Potenza
Efficacia~ sigmoidale
?
D + R
DR Risposta
Binding
R
R R
R
Separazione Filtrazione, centrifugazione
ligandoradioattivo
tessuto,membrane
R
Quant
ifica
zione
R
R
R
RR
R
R
R
RR
R
R
Totale (come prima) Non-specifico (in presenza di un eccesso diFarmaco non radioattivo)
R
R R
R
Legame specifico = legame totale - legame non specifico
Protocollo di binding (tipo 1)([crescenti] di radioattivo
R
[R]
R
[3R]
R
R
[10R]
R
R
R
[30R]
R
R
R
R
R
+ tutti i non-specifici rispettivi
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 20 40 60 80 100 120 Siti saturabili(Specifico)
Siti infiniti e non saturabili(non specifico)
totale
musc
musc
musc
nic
nic
nic
R
R
R
R
Acetilcolina radioattiva
totale Non-specifico
musc
musc
musc
nic
nic
nic
R
R
Acetilcolina Radioattiva +
Eccesso di muscarina
Recettori muscarinici = totale legato da R - non-specifico in presenza di musc
Autoradiografia per scoprire la distribuzione di proteine di membrana o intracellulari
La PET come limite estremo di binding
D + R
DR
[DR][D] [R]
Ka =
1Ka
Kd =
Quando [DR] = [R] allora Kd = [D]
[D][R][DR]
Kd =
k1
k2
Affinita’
D + R
DR()(1 - )
R + DR e’ un numero costante. Quindi vi sara’ una concentrazione di Dcon la quale tutti i recettori saranno occupati. Questo proprieta’ viene definita saturazione
[D] - [D]
KA =
KAD - KAD =
KAD = + KAD
KAD = + KAD
Lo Scatchard plot
=KA[D]
1 +KA[D]
[DR][RT]
KA[D]1 +KA[D]
=
[DR] + KA[D][DR] = [RT]KA[D]
= [RT]KA - KA[DR][DR][D]
= -KA([DR] - [RT])[DR][D]
Proporzione dei recettorilegati
[DR][D]
[DR]
Pendenza = - KA
RT
= -KA([DR] - [RT])[DR][D]
Scatchard Plot
LEGATO
LEGATO/LIBERO Bmax
Ka (-pendenza)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500Bound (CPM)
A
C
B
Paziente A Paziente B Paziente CIntercetta X 3193 399 3335 CPM - Pendenza 0.0114 0.0115 0.0065 nM-1
Leg
ato/
Lib
ero
(dp
m/n
M)
Legato (dpm)
Avete appena scoperto un nuovo metodo per ottenere cellule dissociate da un organo ma dovete caratterizzare il sistema per confermare che queste cellule si comportano in maniera uguale al tessuto originale. Per fare questo, utilizzate N-metil-scopolamina (3H-NMS) ed una sospensione di cellule intatte (100,000 cellule per tubo). Affinita’ ed il numero di recettori per cellula.
[3H-NMS] pM legame specifico (fmol/tubo)20 0.2450 0.51100 0.80200 1.14500 1.541000 1.74
I due tipi di binding: tipo I e tipo II
Saturazione Competizione
[X*]
[3X*]
[X*]
Protocollo di binding (tipo 2)Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo
R
[R]
R
R
R
R
R
[R] + F
R
R
R
R
[R] + 10F [R] +1000F
R R R R
Non specifico
Perche’ utilizzare questo protocollo???
Binding
R R
R
Separazione Filtrazione, centrifugazione
ligandoradioattivo
tessuto,membrane
R
Quant
ifica
zione
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 20 40 60 80 100 120
Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510
10 0.1 100 Non-specifico 500
Esempio di binding (II)CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0.001 0.01 0.1 1 10 100
Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510
10 0.1 100 Non-specifico 500
Curva diinibizione
A* + R AR B + R BR
KA =[AR]
[A][R]KB =
[BR][B][R]
[AR] = KA[A][R] [BR] = KB[B][R]
RT = [R] + [AR] + [BR]
= [R] + KA[A][R] + KB[B][R]
= [R](1+ KA[A] + KB[B])
[R] =(1+ KA[A] + KB[B])
RT
[AR] = KA[A]RT
(1+ KA[A] + KB[B])
[AR] RT
KA[A]RT
(1+ KA[A] + KB[B])=
[AR] RT
KA[A]RT
(1+ KA[A] + KB[B])=
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0.001 0.01 0.1 1 10 100
0.5 IC50
Se KA e KB sono uguali:KA = 1 + KB[B]*IC50
KA = 1IC50 - D*
Esempio di binding (II)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0.001 0.01 0.1 1 10 100
Legame specifico: 3500 - 500 = 3000
N.S.
Legame a 0.1 nM di radioattivo
D* = 0. 1 nMIC50 = 0.2 nM
KA = 1IC50 - D*DR
RT[D*]KA
[*D]KA + 1=
Una delle prime formule che abbiamo visto
10 253430 2525
100 2378300 1734600 1111
1000 6873000 154
10000 101
Proviamo
L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e’ stato sintetizzato [32P]NAADP ad una attivita’ specifica di 800 Ci/mmol. Ilbinding e’ stato fatto con concentrazione fissa di [32P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP.
[NAADP]pM
DPM